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Compreende bioqumicos;
uma
srie
de
processos
Na dcada de 50, James Watson e Francis Crick descobrem a estrutura do DNA; Publicam na revista Nature o artigo
O DNA se estrutura na forma de uma dupla hlice e as bases nitrogenadas se ligam aos pares por ligaes de H;
At a dcada de 70 era extremamente difcil obter a sequencia dos cidos nucleicos, mesmo os pequenos (5 a 10 nucleotdeos); Em 1977 surgem duas novas tcnicas para o sequenciamento do DNA; Uma pelos cientistas Alan Maxam e Walter Gilbert e outra por Frederick Sanger;
Degradao Qumica;
Primeiramente, a fita dupla de DNA marcada com 32P, na extremidade 5 da dupla fita. A enzima polinucleotdeo quinase catalisa esse processo; dupla fita adiciona-se dimetilsulfato, seguido de aquecimento (90 C). As ligaes de H so rompidas, separando as duas fitas do DNA; A amostra separada em 4 tubos, onde em cada tubo ocorrer a clivagem da fita num determinado nucleotdeo ou par de nucleotdeos; A amostra de cada tubo submetida eletroforese e o gel usado para posterior revelao radiogrfica, revelando a sequencia encontrada dos nucleotdeos (extremidade marcada);
Degradao Qumica:
Sequenciamento Enzimtico:
A fita dupla de DNA a ser sequenciado deve ser separada em suas fitas simples (moldes); Essa amostra dividida em quatro diferentes tubos, cada um dos tubos contm os quatro desoxirribonucleotideo trifosfatado (dNTP) e apenas um didesoxirribonucleotdeo trifosfatado (ddNTP), alm do primer, marcado radioativamente; A sntese da fita complementar ao molde ocorre a partir do primer marcado, com a ao da enzima DNA polimerase;
Sequenciamento Enzimtico:
Os ddNTP diferem dos dNTP pela ausncia do grupo 3-OH, ou seja, quando incorporados fita h a interrupo de sua sntese; Pequenas quantidades de ddNTP so adicionadas e aleatoriamente a sntese ser interrompida com o ddNTP de seu respectivo tubo, formando fragmentos de tamanhos diferentes; Estes fragmentos podem ser separados e analisados atravs de eletroforese, com posterior revelao radiogrfica;
Sequenciamento Enzimtico:
Utilizao de elementos danosos para marcao de amostras (istopos radioativos); Necessidade de radiografia para visualizao da sequencia de DNA;
Mtodos Automticos:
Alguns utilizam os mesmos princpios do mtodo de Sanger; Uso de marcadores fluorescentes (nos diferentes ddNTP); Ao ser excitada com laser, emite fluorescncias caractersticas de cada base; Fim da necessidade de 4 reaes paralelas (mistura de produtos fluorescentes);
Eletroferograma:
Pirosequenciamento:
Desenvolvido pela Roche Applied Science, empresa sua; Ocorre em nanoesferas de oligonucleotideos (PCR); O nucleotdeo adicionado fita crescente de DNA detectado diretamente pela liberao e transformao de uma molcula de pirofosfato (PPi), no se baseia na eletroforese para separao dos fragmentos; O PPi liberado convertido em ATP, pela ao da ATP sulfurilase, este ATP fornece energia para que a enzima luciferase oxide a luciferina, com emisso de luz; Essa luz imediatamente detectada, para a construo do pirograma, utilizado para anlise das sequencias; Sequenciamento em tempo real e por sntese;
Pirosequenciamento:
Dias, C.K.S. SEQUENCIAMENTO DE DNA: MTODOS E PRINCPIOS, Instituto de Biocincias UNESP Botucatu (SP); Nelson L.D., Cox M.M. Lehninger Princpios de Bioqumica, 3 ed., So Paulo, 2002; http://pt.wikipedia.org/wiki/cido_desoxirribonucleico <acessado em 7/11/2012> http://www.biomolweb.kit.net/pages_html/sequencing.html <acessado em 9/11/2012>
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