CTEDRA DE BIOTECNOLOGA 2013

Recuperacin De Productos En Biotecnologa

INTEGRANTES CARRERA, M. GABRIELA CAVALLO, ANDREA MARTINEZ, M. VICTORIA OLGUIN, JOS IMANOL SEVILLA, JAVIER

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Recuperacin de productos en Biotecnologa

NDICE
Pgina Introduccin Recuperacin de productos Unidades de operacin en la recuperacin del producto Floculacin y flotacin Sistemas de filtro Centrifugacin Desintegracin de los microorganismos Cromatografa Extraccin Cristalizacin y Precipitacin Desecacin Rendimiento Bibliografa 1 4 6 7 7 11 17 24 25 26 26 28 30

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INTRODUCCIN
La comercializacin de nuevos productos obtenidos a travs del empleo de la biotecnologa requiere un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de desarrollar un proceso eficiente. El objetivo general de este proceso es convertir materia prima relativamente de bajo costo en productos de mayor valor comercial. En este sentido la biotecnologa se puede definir como la coleccin de procesos rocesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos. Un esquema general de un proceso biotecnolgico:

El punto central de este proceso es el biorreactor. En esta unidad de operacin se utilizan catalizadores biolgicos (microorganismos, clulas clulas vegetales animales, enzimas, virus, etc.) para la produccin de sustancias, alimentos, agentes teraputicos, etc. de inters. No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y xito de la operacin depende de un adecuado procesado procesado previo que incluye desde el diseo del medio de cultivo hasta la esterilizacin del mismo. Por otro lado, la recuperacin del
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producto final requiere una serie de operaciones referidas a la separacin y purificacin. Estas operaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas. Los productos que resultan de los proceso biotecnolgicos pueden ser muy variados. La variedad estar dada por: La naturaleza qumica del mismo: sustancias simples (alcoholes, cidos orgnicos); protenas, sustancias con actividad teraputica (antibiticos, hormonas) etc. El volumen de produccin y la concentracin del producto en el caldo de fermentacin: los llamados llamados commodities (etanol, cido ctrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton. /ao y en altas concentraciones en la fermentacin. Mientras que los agentes teraputicos de ltima generacin (hormonas, factores de coagulacin, etc.) se producen slo algunos kg/ao y su concentracin en la produccin es baja. Esto determina la escala de produccin. Los requerimientos de pureza del producto final. Las molculas a ser utilizadas en salud humana requerirn una pureza final muy diferente a las enzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar de un acidulante para alimentos. Con estos criterios podemos agrupar a los productos tal como se muestra en la Tabla 1.

En la Tabla 2 vemos los volmenes de produccin de ciertos productos.

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En la Tabla 3 vemos las concentraciones de productos en los caldos luego de la etapa de produccin.

En la Fig. 2 vemos como tanto volumen (2.a) como concentracin (2.b) inciden en los precios finales de estos productos.

Por supuesto la ubicacin de un producto en este grfico no es fija. El mejor ejemplo son los antibiticos. La concentracin de los mismos en los caldos fue incrementndose a medida que se conoca ms del producto, se mejoraba la productividad de las cepas, se desarrollaban nuevas metodologas metodologas de produccin y as fue aumentndose el volumen y bajando los precios. Lo mismo puede ocurrir con los agentes teraputicos de ltima generacin. Por ello hablar de recuperacin de productos en Biotecnologa no es referirnos a algo invariable. Las etapas y metodologas a emplear estn determinadas por todo lo

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dicho, pero de cualquier manera se puede trazar un esquema general que sea aplicable a cualquier proceso.

RECUPERACIN DE PRODUCTOS
Uno de los aspectos ms crticos de un proceso de fermentacin industrial es la recuperacin y purificacin del producto. La seleccin de las etapas apropiadas de purificacin depende de la naturaleza del producto producto final, su concentracin, los productos laterales presentes, la estabilidad del material biolgico y el grado de purificacin necesario. Cuando se discute la recuperacin del producto se debe distinguir entre los conceptos de purificacin y concentracin. Una etapa de recuperacin cambia la pureza o la concentracin de un metabolito. En el proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros. En los primeros tiempos de la microbiologa industrial las tcnicas utilizadas en la recuperacin de productos tos (por ejemplo extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin, desecacin) se tomaron ms o menos directamente de la ingeniera qumica sin ms que un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biolgicos. Gradualmente se comprendi endi que haba que perfeccionar procesos especficos de purificacin para materiales biolgicos. El biorreactor dej de ser considerado en forma aislada del equipo utilizado en purificacin. Actualmente el biorreactor y las tcnicas de purificacin estn considerados como un sistema integrado, en el que todos los componentes deben ser optimizados conjuntamente.

Estrategias de diseo de procesos de separacin y purificacin Para todos aquellos productos de la Biotecnologa llamada tradicional hay un gran conocimiento tecnolgico y de las propiedades bsicas de las molculas a purificar tanto como del entorno en que se encuentran luego de la etapa de produccin. No ocurre lo mismo con los productos de ltima generacin ya que, por las necesidades comerciales comerciale para aprovechar la baja competencia, el elevado precio, y dada la baja escala actual de produccin, la estrategia es llegar rpido con el producto al mercado con la tecnologa de separacin y purificacin que se posea (por lo general la desarrollada a escala es de laboratorio). Esta estrategia posibilita un buen posicionamiento en el mercado que permite, posteriormente, el desarrollo de nuevas tecnologas de cambio de escala y de separacin y purificacin. Otra vez el ejemplo de este tipo de evolucin son los lo antibiticos. Las estrategias de diseo de procesos de separacin y purificacin para los productos conocidos pueden resumirse en: 1. Conocer las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio activo y caractersticas del producto final (por ejemplo definir pureza requerida).El uso determina la pureza. Para agentes teraputicos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. acti Se tolera un mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar libre de pirgenos.

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2. Definir perfectamente el material de partida. Muchas veces la metodologa de la separacin y purificacin condiciona etapas de produccin. Por ejemplo, pueden pu existir componentes del medio de cultivo (por lo general subproductos como agua de hidrolizado de maz, extracto de malta, sueros animales, albmina otros) que posean sustancias muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificacin rificacin del mismo. En este caso se debe eliminar ese componente del medio de cultivo. 3. Trazar diferentes esquemas tentativos de separacin y purificacin y llevarlos a etapas de laboratorio y piloto. Algunas reglas que se siguen para ello son: a) Elegir en etapas sucesivas procesos basados en diferentes propiedades fisicoqumicas. Por ejemplo si una primera etapa es cromatografa de intercambio inico (propiedad: carga) se puede seguir con una cromatografa de filtracin por geles (propiedad: tamao). b) Separar ar las impurezas que estn en mayor proporcin en las primeras etapas. Por esta causa la etapa de separacin siempre finaliza en una concentracin, ya que el agua es por lo general la impureza mayoritaria (mayor del 90% en cualquier proceso fermentativo). c) Luego de la concentracin usar en las primeras etapas de purificacin propiamente dicha un mtodo de alta resolucin (por ejemplo cromatografa de afinidad). Estos mtodos poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que e se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de muestra a tratar en las etapas posteriores. d) Dejar el proceso ms complejo (y por lo general ms caro) para el final. Se usan estos mtodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre p -purificada. purificada. En la Figura 3 podemos ver algunos mtodos usados en cada una de esas etapas

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UNIDADES DE OPERACIN EN LA RECUPERACIN DEL PRODUCTO

El propio microorganismo puede ser el producto final deseado. Sin embargo en la mayor parte de los procesos sos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente intra o extracelularmente. Ejemplos de metabolitos intracelulares incluyen a los cidos nucleicos, las vitaminas, las enzimas, y ciertos antibiticos, como la sisomicina o la griseofulvina. lvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares incluyen a los aminocidos, el cido ctrico, el alcohol, algunas enzimas (proteasas y amilasas) y la mayor parte de antibiticos (penicilina, estreptomicina, etc.).En unos pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las clulas como en el filtrado del cultivo (por ejemplo: la flavomicina y la vitamina B12). La primera etapa en la recuperacin del producto es, la separacin de la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante. Para este propsito propsito existen varios mtodos, que incluyen la floculacin, flotacin, filtracin, o centrifugacin. Si va a ser aislado un metabolito intracelular, debe ser liberado antes de las clulas. Una vez que el metabolito ha sido separado de las clulas, la seleccin seleccin de etapas adicionales de purificacin depender del producto deseado.

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Las ltimas etapas en la recuperacin del proceso implican precipitacin, cristalizacin, y/o desecacin.

FLOCULACIN Y FLOTACIN
Las clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m sedimentan solo muy lentamente y son difciles de precipitar incluso con la centrifuga. En algunos casos (por ejemplo: tratamiento de residuos) puede utilizarse la floculacin para producir grandes agregados regados que sedimentan mucho ms rpidamente. En la mayor parte de los casos se aade un agente floculante, como una sal inorgnica, un polielectrolito orgnico o un hidrocoloide mineral. Dependiendo del agente utilizado el proceso de floculacin puede ser se reversible o irreversible. El proceso de floculacin est tambin influido por la naturaleza de las clulas y los constituyentes inicos y por su concentracin. El proceso reverso a la floculacin es la flotacin que es ms fcil de conseguir introduciendo ndo gas en el liquido. Las clulas se adsorben a las burbujas de gas y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

SISTEMAS DE FILTRO
Lo ms frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperacin, la separacin de la biomasa y el filtrado del cultivo, se lleve a cabo por algn tipo de proceso de filtracin. Los dos principales tipos de filtros son denominados filtros profundos pro y filtros absolutos. Un filtro profundo se construye a partir de una matriz filamentosa como lana de vidrio, papel de filtro o asbestos, llevndose a cabo el proceso de filtracin debido a que las partculas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partculas q van a ser filtradas son frecuentemente ms pequeas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida q pasan a travs de los intersticios retorcidos del filtro. Los filtros absolutos son membranas membranas en las que el tamao de los poros es ms pequeo que las partculas q van a ser filtradas. Las partculas son por consiguiente separadas sobre las superficies de los filtros. Los hongos filamentosos se filtran ms frecuentemente a travs de filtros profundos, pro como pao a veces en presencia de ayuda filtrante. Por su parte los cultivos bacterianos deben ser filtrados con filtros absolutos. En cualquier caso la eficiencia de la filtracin est influenciada por numerosos factores, como el tamao de los microorganismos, microorganismos, su morfologa, pH, viscosidad, presencia de capas de mucosas, temperatura y presencia de otros organismos como posibles contaminantes. A medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una capa que reduce la velocidad de filtracin f En los procesos clsicos de purificacin utilizados en la industria de antibiticos, la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vaco. En la parte exterior de aparato se enrolla un pao o un cordel y el vaco vaco se produce desde el interior CARRERA CAVALLO MARTINEZ OLGUIN SEVILLA 7

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Recuperacin de productos en Biotecnologa del tambor. Para aumentar la eficiencia del proceso de filtracin, se utiliza una ayuda filtrante, como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia de la filtracin, se utiliza una cuchilla automtica para raspar continuamente continuamente del filtro de la biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtracin. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser lavada a medida que gira el tambor, las eficiencias de filtracin tpicas para mecanismo de

este te tipo se muestran en la tabla.

Los filtros de tambor a vacios son especialmente buenos para suspensiones que contengan una alta concentracin de slidos (20%-60%de (20% 60%de volumen de micelio). Otro tipo de filtro ms adecuado para soluciones en las que la concentracin concentracin de slidos es ms baja es el filtro de prensa en el que una pila de placas porosas se utilizan como soporte para un filtro, sea de tela o una membrana. El volumen de la cmara dentro de las placas determina la capacidad de biomasa de este tipo de d filtro. Aunque el micelio (de hongo o de actinomicetos) puede ser separado con un filtro de tambor, las bacterias unicelulares se separan del medio generalmente utilizando filtros de membrana.

En la figura se compraran dos tipos de proceso de filtracin, filtrac el esttico y el de

contracorriente. Debido a que los procesos de filtracin dependen estrictamente del tamao de poros y el tamao de las partculas, la obstruccin de filtros es un problema.

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Recuperacin de productos en Biotecnologa El mtodo de contracorriente se desarrollo para reducir la la tendencia a las obstrucciones. En este mtodo la solucin se bombea en contracorriente a travs de una membrana. El filtrado pasa a travs de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene .Con el mtodo de contracorriente contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en comparacin con la filtracin esttica. Dependiendo del tamao de partculas que sean filtradas se reconocen tres tipos principales de procesos de filtracin: osmosis inversa para partculas de 0,0001-0,001 0,0001 m, ultrafiltracin para partculas 0,001-0,1 0,001 m y micro filtracin para partculas de 0,1 a 10 m. Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y osmosis inversa se dan generalmente en trminos del peso molecular cular nominal de las substancias separadas (peso molecular del tamao de corte). La osmosis inversa implica generalmente substancias de pesos moleculares menores de 1000. La smosis inversa es una tcnica altamente eficaz para tratamientos de deshidratacin, concentracin/separacin de sustancias de bajo peso molecular en solucin, o tratamiento de desechos. Posee la habilidad de concentrar slidos disueltos o en suspensin. El permeado contiene una muy baja concentracin de slidos disueltos. La smosis inversa es tpicamente utilizada para la desalinizacin de agua de mar. La ultrafiltracin a substancias de pesos moleculares mayores de 1000. 1000 La ultrafiltracin es un proceso de fraccionamiento selectivo utilizando presiones de hasta 145 psi (10 (1 bar). La ultrafiltracin se utiliza ampliamente en el fraccionamiento de leche y suero, y en fraccionamiento proteico. Concentra slidos en suspensin y solutos de peso molecular mayor a 1000. El permeado contiene solutos orgnicos de bajo peso molecular y sales. El proceso de micro filtracin concierne principalmente a la separacin de clulas o fracciones celulares. La micro filtracin es un proceso de flujo de baja presin a travs de membrana para la separacin de coloides y partculas suspendidas en el rango de 0.05 - 10 micrones. La micro filtracin se utiliza para fermentaciones, clarificacin de caldo y clarificacin y recuperacin de biomasa. Tambin sabe aparecer, segn el tipo de fabricante un cuarto tipo denominado nano filtracin. La nano-filtracin tracin se selecciona cuando smosis inversa o ultrafiltracin no son opciones correctas para una separacin. La nanofiltracin puede utilizarse en aplicaciones tales como desmineralizado, mineralizado, remocin de color, y desalinizacin. En concentraciones de solutos orgnicos, slidos en suspensin, e iones polivalentes, el permeado contiene iones monovalentes y soluciones orgnicas de sustancias de bajo peso molecular, como alcohol. Se utilizan membranas fabricadas con esteres de celulosa, polivinilfluoruros, polivinilfluoruros policarbonatos, polisulfonas y celulosa. Las membranas se preparan en forma de cassette, como mdulos en espiral, como manojos de tubos 1-2 1 2 cm de dimetros o como capilares como se muestra en la figura.

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Cuando se selecciona un sistema de filtracin deben considerarse numerosos parmetros. Entre ellos est el tamao de poro y la selectividad de la partcula, la velocidad a la que se pasa el fluido a travs, cuando se estn filtrando soluciones viscosas, la facilidad con la que se pueden ser limpiados los filtros y el nmero de veces que puede ser reusado el filtro. Otros factores a considerar son el coste del sistema de filtros, el rea de superficie que presenta la membrana, el volumen muerto de filtro (que determina cuanto producto se perder) y la posibilidad de esterilizar el sistema. Otro factor que reduce frecuentemente la eficiencia de un filtro es la presencia de agentes antiespumantes que se utilizan frecuentemente en las fermentaciones a gran escala. Los siguientes datos son tpicos de un proceso pro industrial para la Escherichia coli a partir de un caldo de cultivo: volumen de trabajo 4m3 velocidad de filtracin 25-80 25 L /hm2 tiempo del proceso 12h factor de concentracin 1:10

La prxima tabla presenta datos para los proceso de filtracin de varios organismos con varios tipos de filtros.

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Los siguientes son costes tpicos para filtracin de un proceso industrial a gran escala: Produccin de 1 m3 de material retenido: membrana ($420), inversin de capital ($1600), mano de obra ($570) energa a ($230) Produccin de 1 m3: membranas ($14), inversin de capital ($60), mano de obra ($3), energa ($8)

CENTRIFUGACIN
A) Introduccin: La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una fuerza centrfuga. . La fuerza centrfuga es provista por una mquina llamada centrfugadora o centrifuga (en esta mquina se colocan los tubos de ensayo que contienen a la mezcla), la cual imprime a la mezcla un

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movimiento de rotacin que origina una fuerza que produce la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad. Los componentes ms densos de la mezcla se desplazan desplazan fuera del eje de rotacin de la centrfuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia el eje de rotacin. De esta manera los qumicos y bilogos pueden aumentar la fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitacin del sedimento en la base del tubo de ensayo de manera ms rpida y completa. Luego se efecta una filtracin o una decantacin. Este procedimiento, es muy til cuando el slido que esta disuelto en el lquido es muy fino y no sedimenta.

B) Concepto del Funcionamiento: El centrifugado es una sedimentacin acelerada, ya que la aceleracin de la gravedad se sustituye por la aceleracin centrfuga, ( ^2)*R, donde es la velocidad angular de giro de la centrifugadora y R es la distancia al eje de la centrifugadora.

Puesto que la velocidad angular de giro ( ) puede ser de miles de revoluciones por minuto, se alcanzan aceleraciones mucho mayores que la gravedad. El centrifugado, adems de ser ms rpido que la sedimentacin, permite separar componentes que la mera sedimentacin no podra separar.

Ejemplo de uso de centrifugacin para fraccionamiento celular (en este caso ultracentrfuga).

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C) Descripcin del Equipo (elementos bsicos):

Las centrfugas son equipos mdicos utilizados en los laboratorios, clnicas y otros, para la separacin de solutos de sus solventes. Por ejemplo en la rama de laboratorio clnico, para el anlisis de sangre, por lo general es necesario separar el plasma de los otros componentes para poder ser analizado. Existen varios tipos bsicos: centrfugas de separacin de sueros o plasma de baja velocidad (Macrocentrfuga, entre 2,000 y 6,000 R.P.M. aproximadamente), centrfugas ce para microhematcritos (Microcentrfuga entre 10,000 y 18,000 R.P.M. aprox.) y las ultracentrfugas (de 20,000 hasta 75,000 R.P.M.) para la separacin de protenas. Tambin pueden ser catalogadas basndose en otras caractersticas, como: grandes, medianas y pequeas; o de piso, de mesa, refrigeradas, etc. De acuerdo a su rotor (araa) y a sus tubos porta muestras tambin pueden ser catalogadas, pues existen diversas formas y tamaos. Las partes principales de una centrfuga tpica son las siguientes:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Tapadera Cmara o gabinete Base Interruptor de encendido Marcador de tiempo Tacmetro

7. 8. 9. 10.

Freno Control de velocidad El rotor Los Porta muestras

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Existen 2 tipos de rotores: -De ngulo fijo: Los tubos se alojan con un ngulo fijo respecto al eje de giro. Se usan habitualmente para volmenes grandes. El caso extremo es el de los rotores verticales en que los tubos se sitan paralelos al eje de giro. Los rotores de ngulo fijo se emplean principalmente palmente para sedimentar materiales hasta que formen una masa muy compacta en el fondo del tubo (pellet) y despus por decantacin, separar fcilmente el sobrenadante del sedimento. Resultan muy eficaces para este propsito debido a que el material se mueve mueve nicamente un corto trecho hasta la pared del tubo de la centrfuga, aqu se acumula y resbala rpidamente hasta el fondo del tubo. -Basculantes: Los tubos se hallan dentro de unos cestillos que cuelgan. Estos cestillos estn unidos al rotor con un eje y cuando la centrfuga gira, se quedan suspendidos en direccin perpendicular a la del rotor.

Se usan en la centrifugacin zonal (o en bandas) a travs de gradientes de densidad preformados (normalmente de sacarosa o glicerol) o bien para par separar partculas con coeficientes de sedimentacin muy similares. La sacarosa es el material ms comnmente usado debido a su pureza, bajo coste y su no interferencia con la mayora de las mediciones qumicas, pticas o enzimticas. Si la macromolcula en estudio es un enzima o una protena inestable, se usa con frecuencia el glicerol puesto que muchas protenas son ms estables y se desnaturalizan ms difcilmente en presencia de glicerol.
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Los porta muestras son son una especie de recipientes donde se colocan col las muestras. Su tamao depende de la aplicacin para la que est diseado el equipo: Banco de sangre, hematocrito, etc. Estos componentes pueden ir variando dependiendo de la complejidad y calidad del equipo. D) Usos: En el laboratorio las centrfugas se usan generalmente en procesos como la separacin por sedimentacin de los componentes slidos de los lquidos biolgicos y, en particular, en la separacin de los componentes de la sangre: glbulos rojos, glbulos blancos, plasma y plaquetas, entre otros, otros, y para la realizacin de mltiples pruebas y tratamientos.
La centrifugacin no se utiliza slo para separar partculas solidas de la fase lquida sino tambin para la separacin de Fluido/Fluido y Fluido/Fluido/Partcula. La separacin Fluido/Partcula es la de mayor importancia, aunque la separacin Fluido/Fluido se utiliza en la produccin de penicilina. Se utilizan dos tipos distintos de centrifugas segn su funcionamiento: Centrifuga de filtro o tamiz: En este caso la separacin se produce a medida que las partculas son forzadas contra un material filtrante.

Centrifuga de deflectores: En este tipo de centrifuga la separacin se produce debido a la diferencia de densidad entre las partculas y el liquido.

En los dos casos el producto puede ser separado continua o discontinuamente. CARRERA CAVALLO MARTINEZ OLGUIN SEVILLA 15

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Tambin existen diferentes tipos de centrifugas segn el rango de velocidades de giro: giro Centrfugas de baja velocidad, velocidad de sobremesa o clnicas. De pequeo tamao y normalmente sin refrigeracin. Alcanzan una velocidad mxima de 6.000 rpm. tiles para la separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles. Centrfugas de alta velocidad. velocidad Alcanzan zan velocidades mximas entre 18.000 y 25.000 rpm (pueden generar alrededor de 60.000 g). Son refrigeradas y normalmente tienen sistema de vaco para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Este mismo sistema de vaco permite que puedan tener un control ms exacto de la temperatura que aquellas que no hacen vaco. Son tiles en la separacin de fracciones celulares, pero insuficientes para la separacin de ribosomas, virus o macromolculas en general.

Ultracentrfugas. . Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeracin para refrigerar no slo la cmara del rotor donde estn las muestras sino tambin el motor y adems sistemas auxiliares de vaco para alcanzar un altsimo nivel de vaco. Pueden generar ms de 600.000 g, las cuales son suficientes para separar protenas pequeas. Las ultracentrfugas se dividen en: analticas y preparativas. La diferencia ms importante entre ellas es que la analtica cuenta con un sistema ptico para visualizar la sedimentacin de la muestra en tiempo real lo que permite la obtencin de datos precisos de propiedades de sedimentacin (coeficientes de sedimentacin, pesos moleculares) siendo ste el objetivo primordial y no la purificacin de la muestra para un uso posterior, que s sera el objetivo de la preparativa, , til para aislar partculas de bajo coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus, macromolculas), siendo este tipo el inmensamente mayoritario de ultracentrfuga. centrfuga. E) Seleccin de una Centrfuga:

Cabe destacar que han sido comercializadas una amplia variedad de centrifugas para procesos de centrifugacin a gran escala; en la siguiente tabla se dan las posibilidades de los principales tipos:
Separador Parmetro Slidos % Fuerza centrfuga Mxima Capacidad de separacin de agua Capacidad de separacin de pequeas partculas Facilidad de limpieza (tipo deflector) 1-30 5000-15000 Media Decantador (tipo deflector) 5-80 1500-4500 Media Tubo de Centrfuga 1-5 13000-17000 Buena

Buena Buena

Moderada Buena

Muy Buena Muy Buena

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Teniendo en cuenta la amplia variedad de centrfugas existentes en el mercado debemos tener en cuenta ciertas consideraciones para la correcta seleccin de las mismas en un proceso biotecnolgico, dichas consideraciones dependen del tipo de trabajo a realizar. Para la separacin de Fluidos/Partculas se deben considerar los siguientes factores: 1) La pureza necesaria de la fase fluida. 2) La recuperacin que se necesite de la fase fluida. fluida 3) La recuperacin que se necesite de la fase particulada. 4) El contenido en humedad permisible de las partculas. 5) Para separaciones Fluido/Fluido los principales factores a considerar son: 6) La pureza que se necesita del lquido ms ligero o ms pesado. 7) La recuperacin que se requiera de la fase ms ligera o ms pesada.

DESINTEGRACIN DE LOS MICROORGANISMOS

A) Introduccin:
En algunos casos la recuperacin de los productos requiere que los microorganismos sean fragmentados por procedimientos qumicos, fsicos o biolgicos. El fraccionamiento subcelular es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen como objetivo obtener fracciones fra puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana (membrana total, plasmtica, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos, poros nucleares, etc.) Existe gran variedad de mtodos de fragmentacin (o desintegracin), algunos de los ms usados son esquematizados en el diagrama 1-1. 1

B) Usos y Seleccin del Mtodo Desintegrador:

La seleccin de uno u otro mtodo depende principalmente de la naturaleza de las clulas. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varan ampliamente en lo rpidamente que pueden ser rotas. Por ejemplo, las bacterias ias Gram Positivas y las levaduras son mucho ms difciles de romper que las bacterias Gram Negativas o los hongos filamentosos. Incluso dentro de un microorganismo las clulas varan significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo del estado fisiolgico. En la siguiente figura podemos apreciar las diferencias celulares que existen entre una bacteria Gram Positiva y otra Gram Negativa:

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La pared celular y la membrana celular son las que determinan la dificultad de ruptura de la bacteria. La seleccin de una u otra tcnica tambin depender de las caractersticas del producto que se desea purificar, tales como: Resistencia a: Mediosalcalinos. alcalinos. Solventes. Detergentes. Enzimas. Temperatura Esfuerzo de corte. La tcnica utilizada determinar el tamao de los desechos que se producirn.

A continuacin se darn las caractersticas bsicas de cada mtodo, las cuales influirn en la correcta seleccin.
Mtodos Fsicos Ultrasonidos: - Utilizan ondas de presin de ultrasonido. Una onda de presin de ultrasonido es toda onda cuya frecuencia de vibracin es superior a la capacidad auditiva del ser humano. Las ondas audibles tienen frecuencias de vibracin entre 20 y 16000 Hz, por lo tanto las ondas ultrasnicas se encontrarn por encima de 16000 Hz, pudiendo llegar a 1 GHz de frecuencia.

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El mecanismo de destruccin celular por ultrasonido est asociado con el proceso de cavitacin. Este consiste en la formacin y crecimiento crecimiento de burbujas en una zona de baja presin que luego viajan a zonas de mayor presin e implotan, debido a la accin de las intensas ondas sonoras, produciendo un desgaste de la superficie donde colapsan (que es la pared celular). mente utilizada en laboratorios pero no es adecuada a escala industrial -Esta tcnica es ampliamente por su alto coste. Ciclos de congelacin/descongelacin: -Requiere Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y descongelamiento. El lquido al congelarse a -56 56 C forma cristales muy finos que rompen la clula cuando esta se descongela rpidamente a 37C. El lquido al congelarse (-56C) ( provoca la formacin de cristales muy finos que rompen la clula cuando se descongela rpidamente (37C). Se ha visto que la congelacin lenta no funciona tan bien como la rpida. La congelacin rpida lesiona ms especficamente las membranas celulares produciendo lisis celular.

-Tcnica poco efectiva. Molinos de bolas: -Se Se mezclan las clulas con bolas de vidrio y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reaccin con refrigeracin.

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Homogeneizadores: -El El material biolgico se somete a una fuerte f presin hidrosttica (500 atmsferas) y la presin se libera bruscamente permitiendo que qu el lquido salga por una vlvula.

Mtodos Qumicos Tratamiento con lcalis o cidos: -Se Se produce la saponificacin de los lpidos de las membranas. -Siempre Siempre y cuando el producto sea estable a pH extremos -(Hormona (Hormona de crecimiento humano recombinante NaOH pH 11). Tratamiento con solventes orgnicos: -Los Los solventes orgnicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo los lpidos presentes en ellas. -Riesgo Riesgo de desnaturalizacin de las protenas (Aislamiento de enzimas en levaduras). Tratamiento con detergentes:

-La La efectividad del mtodo radica en la qumica del detergente, ya que son anfipticos, por lo que forman micelas con los lpidos de las membranas, desestabilizndolas.

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Mtodos Biolgicos Lisis Enzimtica

-El tratamiento enzimtico consiste en la utilizacin de enzimas que pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio.

-Bacterias Gram (+): lisozima -Bacterias Gram (-): lisozima+AEDT -Levaduras: (1,3)-glucanasa, glucanasa, (1,6)-glucanasa, (1,6) mananasa, quitinasa, autolisis

Los tratamientos enzimticos son muy especficos y las condiciones para la lisis suaves pero -Los son caros.

C) Usos y Conceptos de Funcionamiento:

A continuacin se da una breve descripcin de algunos de los usos ms importantes de los mtodos de desintegracin y sus fundamentos de funcionamiento:

Para la extraccin de clulas de levadura se utiliza la autolisis. Las enzimas autolticas endgenas de las clulas de la levadura llevan a cabo la destruccin de su propia pared celular. Otra tcnica es la plasmlisis siguiendo la adicin de una concentracin alta de

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Recuperacin de productos en Biotecnologa cloruro sdico. La desintegracin por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Industrialmente ustrialmente los mtodos ms empleados de desintegracin celular suponen la accin mecnica, por ejemplo, los molinos de bolas, los cuales llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la accin de bolas de vidrio. En este mtodo las clulas y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reaccin. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una clula contra las paredes de la vasija. La eficiencia de este proceso depende de varios factores factore como: la concentracin de clulas, velocidad de flujo a travs del molino, relacin bolas de vidrio/clulas y la orientacin del aparato (horizontal o vertical). Otro enfoque es el uso de homogeneizadores, en los que el material biolgico se coloca bajo una fuerte presin hidrosttica (500 atm aproximadamente) y la presin se libera bruscamente permitiendo que el lquido salga por una vlvula, dependiendo del organismo y del metabolito deseado pueden romperse del 10 % al 60 % de las clulas. En este caso cas la eficiencia del proceso depende la presin aplicada, y generalmente, el valor ptimo se encuentra entre 450 y 600 atm.

D) Evaluacin de la eficiencia de los mtodos de disrupcin

Mtodos directos: Consisten en contar el nmero total de clulas no rotas. Recuentos en cmara. Contadores electrnicos. Recuentos en placa. Utilizacin de centrfugas analticas. Mtodos indirectos Consisten en determinar el grado de liberacin al medio externo de algn metabolito celular luego de que las membranas celulares son destruidas (determinacin de protenas solubles, actividades enzimticas, etc.).

Clculo del Rendimiento Alcanzado Se determina el rendimiento alcanzado en funcin de la eficiencia de los mtodos realizados, s, teniendo en cuenta no solo la disrupcin celular o el porcentaje de producto recuperado, sino tambin las condiciones operativas que se necesitaron para llevarlo acabo.

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CROMATOGRAFA
Algunas de las etapas ms caras en la recuperacin del producto implican el uso de mtodos cromatogrficos. Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de materiales biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparacin de materiales material farmacuticos, reactivos de diagnostico y para investigacin. En muchos casos deben utilizarse varios tipos de mtodos cromatogrficos, uno despus del otro. La separacin se produce generalmente en una columna: una fase estacionaria (generalmente una resina) resina) se utiliza para adsorber el producto que es luego eludo con una fase mvil (liquida). El lquido de elusin puede tener una densidad nica o puede utilizarse un cambio gradual de densidad (gradiente de densidad). Utilizando un detector adecuado a la la salida de la columna, pueden determinarse las fracciones eludas que contienen el producto deseado. Los detectores adecuados utilizan la absorcin en la luz visible o UV, o la conductividad. Los mtodos ms utilizados son: a) Filtracin en gel (cromatografa (cromatograf de tamizado molecular) Las molculas de diferentes tamaos pueden ser separadas mediante el paso a travs de geles con diferente tamao de poro. Las molculas grandes no penetran en el gel y pasan directamente a travs de la columna saliendo con el frente frente de elucin. Las molculas pequeas penetran ms o menos profundamente en el gel y su movilidad resulta por tanto retardada respecto del frente del solvente. Pueden desarrollarse curvas patrn que relacionan el peso molecular con la posicin de la elucin. eluci A escala industrial la filtracin en gel se utiliza principalmente para separa las sales y las impurezas de bajo peso molecular. A escala ms pequea se utiliza para fraccionar y purificar molculas de protena (ej. insulina). Los geles ms ampliamente utilizados son los tipos Biogel P y A de BioRad y la serie Sephadex S, G y LH de Pharmacia b) Cromatografa de adsorcin En cromatografa de adsorcin la separacin supone interacciones interacciones hidroflicas o hidrofbicas bicas (fuerzas de Van der Waal) Waal) entre el portador y el material biolgico. La elucin y el fraccionamiento se consiguen mediante soluciones de mayor o menor polaridad o fuerza inica. inica Los materiales de adsorcin incluyen los silicatos, la almina, carbn activado, etc. c) Cromatografa de e intercambio inico Las macromolculas con grupos inicos pueden ser separadas por cromatografa de intercambio inico. . Estas se absorbe al portador y se eluye mediante una solucin de fuerza inica definida. Dependiendo de la naturaleza de la fuerza inica ini de la solucin eluyente la separacin puede ser bastante especfica. . La cromatografa de intercambio CARRERA CAVALLO MARTINEZ OLGUIN SEVILLA 24

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Recuperacin de productos en Biotecnologa inica encuentra un amplio uso en la purificacin de antibiticos a partir de caldos de fermentacin. Tambin es ampliamente utilizada en purificacin a gran escala de protenas. Los materiales inicos mas ampliamente utilizados para el intercambio inico para intercambio ercambio catinico catinico son Dowex HCR y OCR, Amberlita IR y IRC y Lewatit Lewa S. Los intercambiadores aninicos aninicos usados son Dowex SAR y MSA , la Amberlita IRA y el Lewatit M. d) Cromatografa de afinidad La cromatografa de afinidad es un mtodo absolutamente especfico para la purificacin de los materiales biolgicos. El material deseado se une especfica y reversiblemente a un ligando que ha sido fijado a un portador inerte. Por ejemplo, un nucletido de adenina (NAD) puede ser purificado permitiendo que se una a un portador que contiene una deshidrogenasa. El antibitico bactracida puede ser utilizado como ligando para asp-, asp ser-, cis- y metaloproteasas de una mezcla cruda. e) Isoelectroenfoque Mediante isoelectroenfoque las protenas pueden ser purificadas utilizando gradientes de pH en asociacin con intercambio inica en geles. As, se produce un gradiente lineal de pH y las protenas de separan de acuerdo acuerdo a su punto isoelctrico. La separacin de las protenas por este mtodo es muy buena. Pero slo pueden ser manejados volmenes pequeos.

EXTRACCIN
Muchos productos pueden ser purificados mediante extraccin con solventes. Se establece un sistema de dos fases utilizando un solvente que sea inmiscible con el caldo acuoso de fermentacin. Una vez que se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. Idealmente el producto debera ser se transferido cuantitativamente a la fase solvente. La extraccin con solventes ha sido ampliamente utilizada en la industria de antibiticos, por ej para la penicilina se utiliza como solvente el acetato de amilo o de butilo. Para la purificacin de enzimas enzimas en estado activo no pueden ser utilizados solventes orgnicos pero se pueden utilizar sistemas acuosos de dos fases, preparados en una solucin de sales con polmeros hidroflicos. hidroflicos. En ambas fases el agua extrae el componente principal, pero ambas fases no son miscibles. Las clulas permaneces en una de las fases y la enzima es transferida a la otra fase sin prdida de actividad. El interfern n humano de fibroblasto puede ser concentrado 70 veces utilizando este mtodo, mtodo, con un rendimiento del 100% a la vez que se consigue una reduccin del volumen de cuatro veces.

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Una variante interesante de este procedimiento es la extraccin con soluciones supercrticas. Este enfoque se utiliza en la extraccin de la cafena de las judas del caf y del lpulo en cervecera, ra, pero tambin puede ser utilizado para la extraccin de pigmentos e ingredientes del olor de los materiales biolgicos. Las ltimas etapas en la recuperacin del proceso implican cristalizacin, precipitacin y/o desecacin.

CRISTALIZACIN Y PRECIPITACIN: PRECIPIT

El valor de la mxima solubilidad de una sustancia en un determinado disolvente es un valor lmite en unas condiciones de presin y temperatura dadas. Por tanto, y siempre que estemos en condiciones de equilibrio, cualquier proceso que tienda a aumentar la concentracin de una disolucin saturada (de slido en lquido) provocar la aparicin del exceso de slido. Si el slido se forma de un modo rpido, desordenado, en muchos puntos simultneamente (ncleos de cristalizacin), y las partculas son, en consecuencia, co de tamao muy pequeo, hablaremos de un proceso de precipitacin. Si, por el contrario, el slido se forma de un modo lento, ordenado, en pocos ncleos, con la aparicin de partculas polidricas de tamao apreciable (a veces a simple vista) de morfologa caracterstica (cristales), hablaremos de un proceso de cristalizacin. La diferencia fundamental entre uno y otro proceso se encuentra en la velocidad con la que se llevan a cabo y en el grado de control que se ejerza sobre las variables que en l intervengan, ms que en el grado de cristalinidad de las muestras obtenidas. Otra diferencia importante es que la precipitacin se limita a la formacin en medio acuoso de slidos inicos poco solubles mediante alguna reaccin qumica, mientras que la cristalizacin puede referirse a una gama ms amplia de solutos (inicos, covalentes,..), de disolventes (polares o apolares) y de procesos (fsicos y qumicos).

DESECACIN:
Para materiales biolgicos es esencial secar el producto final de manera tal que su actividad no se pierda. La desecacin implica esencialmente la transferencia de calor al producto hmedo y el desprendimiento de la humedad con una corriente de gas. La transferencia de calor puede ser por contacto directo, por conveccin o por radiacin. rad Existen en el comercio numerosos aparatos para llevar a cabo el proceso de secado. Incluyen secadores de conveccin (tales como secadores de pulverizacin, rotatorio y de bandas) y secadores por contacto (como secadores de capa fina o de cmara). En algunas industrias el producto final es un cultivo microbiano vivo (por ejemplo, cultivos para inoculacin en la industria lctea). Para preparar cultivos secos debe emplearse la tcnica de liofilizacin, ya que de esta forma los organismos vivos nunca estn sometidos directamente al calor. La liofilizacin tambin se utiliza en la preparacin de algunos productos farmacuticos (por ejemplo, la penicilina se liofiliza directamente en ampollas). CARRERA CAVALLO MARTINEZ OLGUIN SEVILLA 26

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Recuperacin de productos en Biotecnologa Aclararemos el concepto de liofilizacin: La liofilizacin es un proceso en el que se congela el producto y posteriormente se introduce en una cmara de vaco para realizar la separacin del agua por sublimacin. sublimacin De esta manera se elimina el agua desde el estado slido al gaseoso del ambiente sin pasar por el estado lquido. Esto se corrobora corrobora al observar el grfico del punto triple del agua:

Observamos que al disminuir la presin (vaco) a temperatura constante, el agua en estado slido pasar a estado gaseoso. De esta manera el microorganismo nunca se somete a un aumento de temperatura. . Los siguientes son modelos de equipos de liofilizacin:

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RENDIMIENTO:
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las substancias al proceso y del nmero de etapas de purificacin. En la siguiente tabla se muestran prdidas de rendimiento tpicas:

Producto de fermentacin Protena Antibiticos Enzimas extracelulares Enzimas intracelulares

Prdidas durante la recuperacin % 5 20-50 10 90

La fraccin del coste total atribuido a la purificacin esta en un promedio de alrededor del 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares puede ser tan alto como el 90%. En la siguiente tabla los datos para la purificacin del del cido glutmico demuestran la extensin en la que deben ser combinados y optimizados los mtodos de recuperacin. El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser tambin considerados consider en el clculo global.
Proceso

Cristalizacin directa Etapas del Caldo de proceso cultivo. Filtracin (Ph 7,5-8). Evaporacin del filtrado. Ajuste de PH. c.cristalino. Sal sdica cristalina Productos qumicos utilizados 3 equivalentes de cido. 1 equivalente de NAOH.

Rendimiento Intercambio % aninico 100 Caldo de cultivo. 90 Filtracin (Ph 7,5-8). 98 Adsorcin a un intercambiador aninico. Elucin con cido. 73 c. Cristalino. 88 Sal sdica cristalina. 3 equivalentes de cido. 1 equivalente de NAOH.

Rendimiento total

56.6

Rendimiento Intercambio % catinico 100 Caldo de cultivo. 90 Filtracin (PH 7,5-8). 7,5 95 Adsorcin A un cambiador catinico. 98 Elucin con 90 base. 93 Sal sdica cristalina. 3 equivalentes de cido. 2 equivalentes de NAOH. 70

Rendimiento % 100 90 98

95 93

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Debemos tener en claro que uno de los objetivos de la biotecnologa es la fabricacin de productos qumicos a partir de microorganismos para obtener un beneficio econmico. Bajo este punto vista el ingeniero debe focalizarse en el costo total del proceso de produccin. Y se sabe que el costo total ser: Produccin total real= Produccin total terica*Rendimiento total El Rendimiento total es la multiplicacin de todos los rendimientos involucrados inv en el proceso. Por ejemplo, consideremos el proceso de produccin del cido glutmico. Las bacterias producen su cido glutmico a partir de glucosa, algunas (Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum) lo producen en exceso y lo vierten al l medio de cultivo y de este se puede purificar. Los mtodos empleados para purificar son los ya nombrados en la tabla, es decir, cristalizacin, intercambio aninico e intercambio catinico. Entonces si se supone tener un rendimiento parcial de 0.95 sin considerar c la purificacin, y consideramos los valores de rendimiento de la tabla, podemos decir que el rendimiento total del proceso ser: Rendimiento total=0.95 * Rend. Cristalizacin * Rend.Int.Aninico * Rend Int.Catinico. Rendimiento total=0.95 * 0.566 * 0.7 * 0.78 Rendimiento total= 0.294 Baj de 0.95 a 0.294.

En este ejemplo podemos observar cun importante es la etapa de purificacin y cmo afecta sta al costo total del proceso de produccin. Es por todo odo esto que el ingeniero debe conocer en detalle los mtodos de purificacin y saber cules usar en cada proceso, buscando siempre maximizar el rendimiento total, para luego aumentar la produccin y as disminuir el costo total.

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BIBLIOGRAFA

Biotecnologa: Manual de microbiologa industrial Crueger-Crueger Crueger Microbiologa Industrial Alicia Hernndez Fundamentos De Tecnologa Qumica Vollrath Hopp http://es.wikipedia.org www.ru.all.biz www.monografias.com www.pce-iberica.es rica.es http://laboratorio laboratorio-quimico.blogspot.com.ar www.ub.edu www.javeriana.edu.co www.ugr.es

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