GUIA LABORARORIO MICROBIOGA Titulo del Laboratorio: Identificacion de Microorganismos y Antibiograma.

Nombre de la carrera: Medicina Nivel del curso: VI Nivel

Nombre de los docentes responsables: TM Maria Ester Aliaga Lopez TM Lina Castillo Catalan Fecha de ejecucin: 21 y 22/04/2011 1.- Objetivo del laboratorio: 2.- Introduccin 3.- Desarrollo de la actividad 4.- Tipo de evaluacin_ 4.1.- Quz de entrada : Objetivo : alumno este informado de la teora para realizar la actividad

4.2.- Informe de la actividad realizada a entregar en el laboratorio siguiente Objetivo: Evaluar aprendizaje del laboratorio realizado

DESARROLLO

1.- Objetivo del laboratorio: Proporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de los mtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento e identificacin de los principales agentes patgenos para el hombre y su estudio de susceptibilidad a los antibiticos ,a partir de muestras clnicas, lo que le permitir actuar correctamente en su prctica mdica en el campo de las enfermedades infecciosas - 2.- Introduccin: El primer paso del diagnstico microbiolgico comienza con la obtencin de la muestra clnica adecuada. Para ello es preciso conocer los posibles agentes etiolgicos de las enfermedades infecciosas y los mecanismos patognicos de los mismos. La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso que se pretende diagnosticar, teniendo siempre en cuenta que en determinadas infecciones, muestras no relacionadas directamente con la focalidad clnica, pueden tener tambin un buen rendimiento microbiolgico. El sndrome clnico y los posibles agentes etiolgicos implicados condicionan no slo el tipo de muestra a enviar sino tambin su procedimiento de obtencin y el transporte al laboratorio. En la tabla 1 se resumen los distintos tipos de muestras adecuadas en funcin de las infecciones ms comunes. Igualmente, la informacin clnica es la que permite al laboratorio aplicar las tcnicas diagnsticas disponibles de manera ms eficiente. Por ello es fundamental que el microbilogo est en estrecha comunicacin con los clnicos y que participe activamente en el proceso diagnstico del paciente. A su vez, el laboratorio de microbiologa debe poner a disposicin de los clnicos toda la informacin necesaria sobre las posibilidades diagnsticas que el laboratorio ofrece. Tabla 1.- Muestras clnicas recomendadas para el diagnsitico microbiolgico de las infecciones ms comunes

Tipo de infeccin Bacteriemia

Muestra Hemocultivos

Comentarios

Infecciones cardiovasculares y asociadas a dispositivos intravasculares (IV) Endocarditis Infeccin del catter Pericarditis Sistema nervioso central Meningitis Abscesos cerebrales Tracto respiratorio Faringoamigdalitis Sinusitis Exudado farngeo Aspirado sinusal No vlidos los exudados nasales LCR Aspirados de abscesos Hemocultivos/Vlvula/Verrugas Catter IV, piel pericatter, conexin del catter Lquido pericrdico

Otitis media Otitis externa Neumonia

Timpanocentesis Exudado odo externo Esputo, muestras obtenidas por fibrobroncoscopia, puncin transtorcica aspirativa, puncin transtraqueal, broncoaspirado

Empiema y abscesos pulmonares Lquido pleural, aspirados de abscesos Nasofarngeo Nasal Infecciones oculares Conjuntivitis Queratitis Endoftalmitis Infecciones gastrointestinales Diarrea Infecciones intraabdominales Peritonitis Abscesos intraperitoneales y abscesos viscerales Colecistitis Tracto urinario Infeccin urinaria Orina (miccin media, sonda) Orina obtenida mediante puncin suprapbica Tracto genital lceras genitales Ndulos genitales Uretritis Vulvovaginitis Cervicitis Prostatitis Piel y tejidos blandos Imptigo, foliculitis, erisipela, celulitis, lceras, infecciones gangrenosas, abscesos cutneos, heridas y quemaduras Hueso y articulaciones Artritis Osteomielitis Lquido sinovial Biopsia sea o exudado Preferiblemente aspirados tomados con jeringa y biopsias de tejido. Son menos recomendables las muestras tomadas con torundas Raspado de la lcera Aspirado del ndulo Exudado uretral Exudado vaginal Exudado endocervical Secrecin prosttica Acompaada de orina pre y post masaje prosttico Deteccin de S.agalactiae (tambin exudado rectal ) Diagnstico de bacteriuria por anaerobios y de ITU en nios Lquido peritoneal Aspirados de abscesos Lquido biliar Heces/Biopsia intestinal/ Aspirado duodenal Exudado conjuntival/raspado Raspado corneal Lquido intraocular Diagnstico tosferina/Infecc. vricas Deteccin de S. aureus

En la clnica, la rpida y correcta identificacin del microorganismo o microorganismos causantes de una infeccin puede ser trascendental para la implantacin del tratamiento adecuado. De ah la importancia de las pruebas que se seleccionen para llegar a dicha identificacin. El mtodo ms extendido para llegar a la identificacin de microorganismos se basa en la realizacin de una batera de pruebas bioqumicas, a travs de las cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee, caractersticas de resistencia a determinadas sustancias, etc... La identificacin es tanto mejor cuanto mayor es el nmero de caracteres investigados. Para realizar correctamente las pruebas bioqumicas es fundamental tener colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros. Las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana las podemos clasificar atendiendo a varios criterios: PROCESOS RESPIRATORIOS QUE UTILIZAN LAS BACTERIAS PARA LA OBTENCIN DE ENERGA A) PRUEBA DE LA CATALASA * Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el perxido de hidrgeno o agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. ElH2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares; si se acumulara sera txica para la bacteria. B) PRUEBA DE LA OXIDASA * Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto de color. El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos aerobios. * Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado sobre tiras o discos de papel de filtro. Identificacin presuntiva PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCDICO La mayora de las bacterias son capaces de metabolizar la mayora de los hidratos de carbono, ya sea por va oxidativa o fermentativa. A) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER * Fundamento: observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la va butanodilica. Si es as, se forma un producto intermedio (acetona) que forma un complejo de color rojizo con el -naftol. B) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER (TSI) * Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar: a. La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono especfico (en este caso glucosa, lactosa o ambas)incorporado en un medio de crecimiento bsico.

b. Produccin o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono. c. Produccin de cido sulfhdrico (SH2). El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos bioqumicos de ambos son los mismos.

C) PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los Estreptococos del grupo D y Enterococos, que tienen esta propiedad, de otros Estreptococos, que no pertenecen a dicho grupo. PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTICO Se investiga la presencia en los microorganismos de enzimas con actividad proteoltica. A) PRUEBA DE LA COAGULASA * Fundamento: se pretende comprobar la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por accin de la enzima coagulasa. La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana). La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible. B) PRODUCCIN DE HEMLISIS * Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios que contienen sangre, pueden producir alrededor de las colonias unas zonas de hemlisis variables, segn se origine una destruccin parcial o total de los eritrocitos. Las sustancias responsables de estos fenmenos son exotoxinas, liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas. C. PRUEBA DEL INDOL * Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptfano (aminocido) en indol ms alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reaccin del indol producido con el reactivo pdimetilaminobenzaldehido. E) PRUEBA DE LA UREASA * Fundamento: mediante esta prueba determinamos la capacidad del microorganismo de desdoblar la urea en CO2 y amonaco por accin de la enzima ureasa. Se visualiza el proceso debido a que la alcalinidad que se produce origina un cambio de color en el indicador que lleva incorporado el medio. Esta prueba se puede realizar en tubo con medio slido o sobre discos de papel de filtro. PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS SUSTANCIAS A) TEST DE LA OPTOQUINA

* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina. B) TEST DE LA BACITRACINA * Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina. INVESTIGACIN DE SUSTANCIAS ENERGTICAS NUTRITIVAS A) PRUEBA DE LA UTILIZACIN DE CITRATOS * Fundamento: mediante esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono. El medio incluye citrato de sodio como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato como nica fuente de carbono tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonaco, llevando a la alcalinizacin del medio. El medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH cido,verde a pH neutro y azul a pH alcalino. Inters: La batera clsica para la identificacin de enterobacterias esta formada por: TSI LIA MIO Citrato Simmons UREA

El antibiograma
Por qu realizar un antibiograma? El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones teraputicas individuales. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevencin en los hospitales. Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico. Cundo realizar un antibiograma? Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad dagnstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infeccin.

Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin entre el bacterilogo y el clnico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbilogo no podr determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clnicos que le aporta el mdico. Por ejemplo, una bacteria no patgena puede ser responsable de la infeccin de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de signos clnicos puede ser tambin determinante para la realizacin de un antibiograma (por ejemplo: la infeccin urinaria con un nmero reducido de grmenes).

Sensibilidad bacteriana a los antibiticos Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa,1) las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o semiautomatizados), 2)E-Test, 3)Metodo de Kirby Bauer(difucion en agar. Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco.

Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la CLSI: *Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento a la doss habitual. *Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento. *Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posologa).

3.- Desarrollo de la actividad AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA. El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biolgicas,suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que se est investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo slido contenido en una placa de Petri.

Los medios ms usados en el laboratorio, comprenden el de agar sangre de cordero 5%, y agar MacConkey. *Se observarn en las placas los tipos de colonias que han crecido en la superficie del medio y se anotarn las caractersticas ms importantes que puedan ser tiles en una identificacin preliminar, se anotara en el informe final. **Se realizar la coloracin de Gram y se proceder de acuerdo al resultado a la identificacin del Microorganismo. ***Con los cultivos donde se observen cocos Grampositivos,segn coloracin de Gram.si estn en disposicin de racimos o en diplococos o cadenas, hacer prueba de catalasa, para diferenciar estafilococos de estreptococos. **** Observar hemolisis, (Alfa, beta o gamma). *****Cocos Gram positivos con disposicin en racimos , catalasa (+), hacer prueba de coagulasa y urea. ******Cocos Gram (+) con disposicin en diplo o cadenas,catalasa (-)efectuar test de bacitracina, sembrar medio de bilis esculina, tolerancia a la sal, test de optoquina. Si al Gram se observan bacilos Gram negativos en disposicin irregular, efectuar batera para enterobactereas e interpretar segn tabla proporcionada por ayudantes.

ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS EN EL LABORATORIO

OBJETIVOS: Conocer y realizar los mtodos de estudio de sensibilidad en los antimicrobianos o antibiograma Realizar antibiograma por el mtodo de Kirby y Bauer a diferentes cepas bacterianas Interpretar los antibiogramas realizados

Discutir y analizar la importancia del estudio de sensibilidad de las bacterias de importancia clnica ACTIVIDADES:

 Se cuenta con cepas bacterianas con 24 horas de incubacin para realizar los antibiogramas a) Preparar un inculo en caldo Mller Hinton correspondiente a 1 x 108 UFC/ml, comparndolo con el Standard de Mac Farland 0.5. Control de turbidez. b) A partir del inculo sembrar con trula una placa de agar Mller Hinton, cubriendo completamente su superficie con la siembra. c) Dejar secar por 10 minutos y depositar sobre la superficie del agar sembrado un multidisco para cocceas gram positivas o bacilos gram negativos segn corresponda d) Incubar por 18 a 24 horas en estufas de cultivo a 35 C.

e) Leer los antibiogramas realizados segn tablas estandarizadas del CLSI 2010. f) Interpretar los resultados de los antibiogramas valorando su importancia en el estudio de agentes bacterianos patgenos

ANEXO PRUEBAS BIOQUIMICAS IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

PRUEBAS DIFERENCIALES MICROBIOLOGICAS PARA COCACEAS GRAM POSITIVAS (CGP) Prueba de Catalasa: Diferencia entre Staphylococcus y Streptococcus

Catalasa Positiva (Staphylococcus)

Catalasa Negativa (Streptococcus)

Prueba de Coagulasa: Diferencia entre Staphylococcus coagulasa positiva o negativa

Coagulasa Negativa Prueba de Bilis Esculina

Coagulasa Positiva Prueba de Tolerancia a la Sal

Genero Staphylococcus Streptococcus grupo D Enterococcus faecalis

Prueba de Esculina B/E Negativa Positiva Positiva

Bilis

Prueba de Tolerancia a la Sal (NaCl 6,5%) Positiva Negativa Positiva

DIFERENTES TIPOS DE HEMOLISIS EN AGAR SANGRE

PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS (BGN) Batera Bsica TSI LIA MIO CITRATO SIMONS UREA DE CRISTHENSEN

INDOL POSITIVO

INDOL NEGATIVO

CITRATO (+) KLEBSIELLA

CITRATO(-) E.COLI

PNEUMONIAE

REACCIONES TSI (+)

LIA

(-) UREA

REACCIONES MIO

HALOS DE SENSIBILIDAD METODO DE DIFUCION EN AGAR(KIRBY BAUER) AGAR MUELLER HINTON

AGAR SANGRE

E- TEST
Vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color ms claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses ms oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio.