Biotemas, 22 (3): 77-83, setembro de 2009 ISSN 0103 1643

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Efeito fungitxico de leos essenciais sobre Colletotrichum gloeosporioides, isolado do maracujazeiro amarelo
Ismail Teodoro Souza Jnior1* Nilza Lima Pereira Sales2 Ernane Ronie Martins2
Departamento de Fitossanidade, FAEM, Universidade Federal de Pelotas CEP 96010-970, Pelotas RS, Brasil 2 Instituto de Cincias Agrrias, Universidade Federal de Minas Gerais UFMG *Autor para correspondncia agrojunior1@yahoo.com.br
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Submetido em 31/10/2008 Aceito em 17/03/2009

Resumo
O presente trabalho objetivou avaliar o efeito de diferentes concentraes de leos essenciais sobre o fungo Colletotrichum gloeosporioides. Os leos essenciais foram obtidos a partir da parte area das plantas Lippia sidoides, Ocimum gratissimum, Lippia citriodora, Cymbopogon citratus e Psidium guayava var. pomifera. Aps a incorporao dos leos em meio gar-gua e BDA (batata, dextrose e gar), nas concentraes de 1L/ mL, 3L/mL 5L/mL e 10L/mL e a testemunha a 0L/mL (leo/meio de cultura), avaliou-se a inibio da germinao dos condios e a inibio do crescimento micelial, respectivamente. Os resultados demonstraram que a partir da concentrao de 1L/mL, os leos essenciais de todas as espcies vegetais tiveram efeito sobre a germinao dos condios, com inibio de 100%. As espcies Lippia sidoides, Ocimum gratissimum, Lippia citriodora, Cymbopogon citratus inibiram em 100% o crescimento micelial do fungo. O leo da Psidium guayava var. pomifera mostrou inibio crescente sobre o miclio do C. gloeosporioides com o aumento das concentraes desse leo essencial. Unitermos: controle alternativo de doenas, crescimento micelial, germinao de condios

Abstract
Fungitoxic effect of concentrations of essential oils on Colletotrichum gloeosporioides, isolated from the passion fruit. This study aimed to evaluate the effect of different concentrations of essential oils on the fungus Colletotrichum gloeosporioides. The essential oils were obtained from shoots of the plants Lippia sidoides, Ocimum gratissimum, Lippia citriodora, Cymbopogon citratus and Psidium guayava var. pomifera. After the incorporation of oil in water-agar and PDA medium, in concentrations of 1L/mL, 3L/mL 5L/mL and 10L/ mL and witness at 0L/mL (oil/the culture medium), the inhibitions of conidia germination and mycelial growth, respectively, were evaluates. The results showed that from the concentration of 1L/mL, essential oils of all plant species had an effect on conidia germination, with an inhibition of 100%. The species Lippia sidoides, Ocimum gratissimum, Lippia citriodora and Cymbopogon citratus inhibited the growth of the fungus mycelium by 100%. The oil of Psidium guayava var. pomifera had progressive control over the mycelium of C. gloeosporioides, in accordance with the increase in concentrations of essential oil. Key words: alternative control of diseases, germination of spores, mycelial growth
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Introduo
O maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.), uma planta originria da Amrica Tropical, se adaptou muito bem s condies de ambiente do Brasil. Sendo este, atualmente, o primeiro produtor mundial, seguido do Peru, Venezuela, frica do Sul, Sri Lanka e Austrlia (Viana et al., 2003). As plantas de maracuj podem ser afetadas por vrias doenas causadas por fungos, bactrias, vrus e nematides. Dentre as doenas fngicas que ocorrem na parte area, pode-se citar a antracnose, verrugose, mancha de Alternaria e mancha de Septoria. A antracnose causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides Penz e sua forma perfeita Glomerella cingulata (Stonem.) Spaud & Schrenk, constitui-se em uma das doenas de maior expresso econmica para a cultura do maracujazeiro amarelo. A sua ocorrncia d-se praticamente em todas as regies produtoras no Brasil e tambm em diversos pases. Ataca todos os rgos areos da planta como folhas, botes florais, gavinhas, ramos e frutos (Ruggiero, 1998). Doenas em plantas tm contribudo significativamente na reduo da produo e do fornecimento de alimentos populao. Assim sendo, a utilizao do manejo ecolgico de doenas preconizada com o objetivo de reduzir o uso de fungicidas, uma vez que estes causam danos ao homem e o meio ambiente (Talamini e Stadnick, 2004). O uso indiscriminado de agrotxicos provoca o acmulo de substncias nocivas no solo e na gua, leva o surgimento de populaes de fitopatgenos resistentes aos compostos qumicos alm do desequilbrio ambiental, pela falta de seletividade dos produtos utilizados. O registro do aumento no consumo de agrotxicos foi de 276,2% no perodo compreendido entre 1964 e 1991, comportamento esse no associado expanso da rea cultivada (Campanhola, 2003), sugere a busca de ferramentas efetivas e economicamente viveis de controle de doenas em plantas. Importante preocupao se deve ter tambm em relao aos produtores orgnicos, os quais no possuem muitas alternativas para o controle de doenas, uma vez que a grande maioria dos produtos no pode ser utilizada. Aliado a esses fatos, atualmente com o crescimento da
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exigncia dos consumidores por alimentos livres de agrotxicos, vrias pesquisas esto sendo realizadas voltadas para a busca de produtos fitossanitrios naturais. Os leos essenciais vegetais so considerados fontes para o desenvolvimento desses novos produtos naturais. Entretanto, sabe-se que grande parte da flora brasileira ainda no foi estudada, sendo a descoberta de novos compostos qumicos, a partir de plantas, capazes de controlar o desenvolvimento de fitopatgenos, de grande importncia (Stangarlin et al., 1999). A utilizao de produtos naturais no controle de doenas de plantas tem se tornado um meio eficiente para a reduo do uso indiscriminado de defensivos. A explorao da atividade biolgica dos metablitos secundrios dos extratos brutos e dos leos essenciais de plantas surge como uma forma potencial de controle alternativo de doenas das plantas cultivadas. Vrios extratos brutos e leos essenciais de plantas j foram testados sobre fungos fitopatognicos em diversos trabalhos (Takatsuka et al., 2003; Balbi-Pea et al., 2006; Pereira et al., 2006). Diante do exposto, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito direto do leo essencial de alecrimpimenta ( Lippia sidoides Cham . ), alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum L.), capim-santo (Cymbopogon citratus Stapf.), cidro (Lippia citriodora Kunth.), e goiabeira vermelha (Psidium guayava var. pomifera L.) sobre a germinao dos condios e sobre o crescimento micelial do fungo Colletotrichum gloeosporioides, buscando-se as concentraes inibitrias mnimas (CIM).

Material e Mtodos
Isolamento do patgeno
O fungo C. gloeosporioides foi isolado a partir de folhas de maracujazeiro, apresentando sintomas tpicos da doena. Pedaos de tecido foliar de 0,5mm de dimetro foram retirados de leses, na regio entre a rea lesionada e a rea sadia. Esses fragmentos foram superficialmente desinfetados com lcool 70% durante 30 segundos e hipoclorito de sdio 2,0% durante 30 segundos e enxaguados trs vezes em gua destilada

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estril. Em seguida, estes pedaos de tecido foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura BDA (batata, dextrose e gar) sendo incubadas por 15 dias, sob fotoperodo de 12h e temperatura de 25C, em estufa incubadora. Aps esse perodo, discos de 0,5mm foram retirados dos bordos das colnias e transferidos para tubos contendo meio de BDA. A manuteno dos isolados foi realizada pelo armazenamento dos tubos em geladeira a 5C (Ribeiro e Bedendo, 1999).

Obteno dos leos essenciais

Para a obteno dos leos essenciais vegetais, foram utilizadas folhas frescas de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum L.), capim-santo (Cymbopogon citratus Stapf), cidro (Lippia citriodora Kunth.), e goiaba vermelha (Psidium guayava var. pomifera L.). Para a extrao dos leos essenciais foi empregado o aparelho de Clevenger, utilizando o mtodo de hidrodestilao por arraste com vapor dgua (Craveiro et al., 1981). Foram utilizadas 150g da parte area de cada espcie vegetal, que foram colocadas em balo de vidro, cobrindo com gua destilada at 2/3 do balo. O tempo para o processo de extrao dos leos foi de 3h ininterruptas, sendo que, ao final, o leo foi separado da gua por separao lquidolquido. Decorrido esse tempo, os leos essenciais foram armazenados em frascos no freezer.

gar-gua, sendo que a testemunha consistiu apenas de placas contendo apenas o meio. Os leos essenciais foram adicionados ao meio gar-gua a 45C e em seguida vertidos em placa de Petri, onde, imediatamente aps, foi adicionado 500L da suspenso de condios. As placas foram incubadas sob fotoperodo de 9h e temperatura de 25C. A avaliao foi realizada determinando-se a porcentagem de germinao de 100 esporos, nove horas aps o incio da incubao, contando-se o nmero de esporos germinados e no germinados ao microscpio ptico em trs diferentes pontos da placa de Petri, no aumento de 40x no microscpio. O ensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 5x5 (cinco leos essenciais x cinco concentraes), com quatro repeties (Silva e Bastos, 2007).

Determinao das concentraes de leos essenciais sobre o crescimento micelial do fungo

A atividade antifngica das concentraes dos leos essenciais foi avaliada atravs da inibio do crescimento miceliano do patgeno. Utilizaram-se cada leo essencial das espcies vegetais nas concentraes de 1L/mL, 3L/mL, 5L/mL e 10L/mL em meio de cultura BDA. A testemunha consistiu do disco do fungo cultivado em meio BDA. O ensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5x5 (cinco plantas x cinco concentraes). Para cada tratamento leo/concentrao foram empregadas quatro repeties. Desta forma, o leo essencial das plantas foi primeiramente adicionado ao meio BDA fundente com temperatura mxima de 45C, e em seguida vertido em placas de Petri de 9cm de dimetro. Cada placa foi inoculada, no centro, com um disco de 5mm de dimetro, contendo miclios da cultura monosprica (Grigoletti Jnior e Lau, 1999). As placas foram incubadas temperatura de 25C sob fotoperodo de 12h. A avaliao do efeito das diferentes concentraes de leo essencial sobre o crescimento miceliano foi realizada quando o crescimento miceliano da testemunha cobriu totalmente a superfcie do meio de cultura. A leitura do experimento foi feita medindo-se o dimetro da rea de crescimento
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Determinao das concentraes de leos essenciais sobre a germinao dos condios

A atividade antifngica das diferentes concentraes dos leos essenciais foi avaliada microscopicamente, pela observao por meio da inibio da germinao dos condios do fungo. A suspenso de condios foi obtida adicionando-se gua destilada estril s culturas fngicas em placas de Petri e, posteriormente, filtrandose esse contedo em gaze. A concentrao de esporos dessa suspenso foi determinada com auxilio de hemacitmetro (cmara de Neubauer) e ajustada para 2x105 condios.mL-1. As concentraes utilizadas de cada um dos leos foram 1L/mL, 3L/mL, 5L/mL e 10L/mL em meio

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miceliano em dois eixos ortogonais (mdia das duas medidas diametricamente opostas). Com a mdia dos resultados obtidos foi determinada a ao fungitxica dos leos atravs da concentrao inibitria mnima (CIM), expressa em microlitros por mililitros (L/mL), que representa a mais baixa concentrao necessria para causar total inibio do crescimento micelial dos fungos (Silva e Bastos, 2007). Foram realizadas avaliaes, calculando-se a porcentagem de inibio do crescimento dos tratamentos em relao testemunha, utilizando-se a frmula: PIC = Onde:
Dimetro da test = dimetro da testemunha Dimetro do trat = dimetro do tratamento

de alecrim-pimenta possui como principal componente o timol (60%), que tem conhecida ao bactericida e antimictica (Goodman e Gilman, 1978). O leo essencial presente nas folhas de goiabeira rico em bisaboleno e outros sesquirtepenos, alm de acetais dietoximetano e dietoxietano que do o aroma aos frutos (Lorenzi, 2002). O leo essencial de cidro contm geraniol, citral, mirceno, dentre outros (Martins et al., 2002). TABELA 1: Porcentagem de germinao dos condios de Colletotrichum gloeosporioides com diferentes concentraes dos leos essenciais de diferentes espcies vegetais.
leos essenciais Alecrim-pimenta Alfavaca-cravo Capim-santo Cidro Goiaba Concentrao L/mL 0 0b 0b 0b 0b 0b 1 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 3 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 5 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 10 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a

(dimetro da test dimetro do trat) x 100 dimetro da test

Os dados obtidos nesse estudo foram submetidos anlise de varincia, e as mdias comparadas pelo

teste de Tukey a 5% de probabilidade sendo esta realizada utilizando-se o programa SASM-Agri (Canteri et al., 2001).

*Mdias seguidas da mesma letra nas linhas no diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade

Resultados e Discusso
Efeito das concentraes de leos essenciais sobre a germinao de esporos do fungo C. gloeosporioides
Os resultados observados mostraram que todos os leos essenciais e todas as concentraes testadas inibiram em 100% a germinao dos esporos de C. gloeosporioides (Tabela 1). Sete dias aps a avaliao, verificou-se que os esporos permaneceram sem germinar, no ocorrendo, conseqentemente, o crescimento micelial do fungo e, comprovando-se, portanto, o efeito fungicida dos leos essenciais e no somente fungisttico. Esses resultados podem ter sido influenciados pela presena de vrios compostos com ao antimicrobiana. As folhas de alfavaca-cravo apresentam 3,6% de leo essencial, sendo que 73,3% eugenol, 12,1% de 1,8 cineol, 2,3% de -cariofileno, 2,1% de (Z)-ocimeno (Lorenzi, 2002). O leo
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Trabalhos relatando o efeito de leos essenciais de plantas sobre a germinao de esporos de espcies do gnero Colletotrichum, bem como as concentraes mnimas inibitrias ao fungo, so escassos na literatura. Bastos e Albuquerque (2004), testando o leo essencial de pimenta-de-macaco ( Piper aduncum ) sobre os condios de C. musae, observaram 100% de inibio da germinao dos esporos utilizando concentraes do leo acima de 100g/mL. Pesquisas recentes, sobre o efeito de diferentes concentraes de leos essenciais em outros patossistemas foram realizadas. Silva e Bastos (2007), avaliando in vitro, a atividade fungitxica de diferentes concentraes do leo essencial extrado de dez espcies de Piper coletadas na regio Amaznica, encontraram 100% de inibio na germinao de basidisporos de Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa do cacaueiro. A inibio total da germinao foi observada para os leos de P. dilatatum, P. callosum e P. marginatum var. anisatum , nas concentraes de 0,4, 0,5 e 0,5L/mL em meio BDA, respectivamente. Medice et al. (2007), observaram que os leos essenciais de eucalipto citriodora (Corymbia

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citriodora), citronela (Cymbopogon nardus), nim (Azadirachta indica) e tomilho (Thymus vulgaris) nas concentraes 1%, 0,5%, 1,0% e 0,3% respectivamente, inibiram em 100% a germinao dos uredinsporos de Phakospsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem da soja, em meio gua-gar. Em experimento realizado por Salustiano et al. (2006), onde foi avaliada a atividade de extratos de folhas e do leo essencial da candeia ( Eremanthus erythopappus) sobre a germinao de uredinsporos de ferrugens, Puccinia psidii, Hemileia vastatrix , Phakopsora pachyrhizi, e Cerotelium fici e sobre o crescimento micelial de Cilindrocladium scoparium, os autores verificaram que uredinisporos de todas as ferrugens no germinaram quando submetidos ao tratamento. Foi observado tambm, inibio de 52% do crescimento micelial de C. scoparium com uso de extrato metanlico, com conseqente reduo da produo de esporos. Ambos os tratamentos, infuso a 10% e leo essencial a 1%, reduziram em 25% o crescimento micelial do fungo, reduziram em 28% e 34%, respectivamente, a produo de esporos. Os leos essenciais de Cymbopogom citratus, Eucalyptus citriodora e Ageratum conyzoides inibiram completamente a germinao de esporos do fungo Dydimella bryoniae, causador de danos s folhas e frutos de melo (Fiori, 2000). No trabalho realizado por Pereira (2006), onde foi avaliado o efeito de diferentes doses do leo essencial de tomilho na germinao de Cercospora coffeicola, causador da cercosporiose do caf, e os autores observaram que o leo essencial apresentou efeito txico aos condios, nas concentraes de 500, 1000 e 2000ppm, com reduo na germinao de 27%, 30% e 45%, respectivamente.

crescimento micelial do fungo a partir da concentrao 1L/mL. Os leos essenciais da maioria das plantas nas concentraes testadas inibiram o crescimento micelial em 100% comparando-se com a testemunha (0L/mL) (Tabela 2). O leo de goiaba vermelha foi o nico que mostrou inibio crescente do miclio de C. gloesporioides, conforme o aumento das concentraes do mesmo, apesar de no ter diferido entre si, pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (Tabela 2). Os leos utilizados neste trabalho j foram testados em outros trabalhos, onde tambm foi demonstrado o seu potencial. Pessoa et al. (1996), utilizando o leo essencial de alecrim-pimenta a 10%, observou inibio do crescimento micelial dos fungos Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloesporioides e Rhizopus sp. em testes in vitro. Em outro trabalho Vivas et al. (2006) constataram que o efeito do leo essencial de capim-santo promoveu inibio em 100% do crescimento micelial do fungo Colletotrichum acuntatum, nas concentraes superiores a 100L/mL. TABELA 2: Porcentagem de inibio do crescimento miceliano de C. gloeosporioides com diferentes concentraes de leos essenciais de diferentes espcies vegetais
leos essenciais Alecrim-pimenta Alfavaca-cravo Capim-santo Cidro Goiaba 0 0b 0b 0b 0b 0b Concentrao L/mL 1 3 5 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 44 a 50 a 67 a 10 100 a 100 a 100 a 100 a 69 a

*Mdias seguidas da mesma letra nas linhas no diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.

Efeito das concentraes de leos essenciais sobre o crescimento micelial do Colletotrichum gloeosporioides in vitro
Todas as concentraes dos leos essenciais das espcies vegetais analisadas exerceram inibio do

O efeito de alguns dos leos utilizados nesse trabalho tambm j foi observado sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides por outros autores, como Guimares et al. (2007), que avaliaram o efeito do leo essencial de capim-santo e de seus componentes (citral e mirceno). A concentrao mnima inibitria encontrada foi de 500ppm, para o leo essencial e tambm para o citral, inibindo em 100% o crescimento micelial

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do fungo. No entanto, observou-se que o mirceno apresentou baixa atividade, onde, na concentrao500 ppm, foi observada inibio de apenas 22,17% do crescimento micelial. Comprovou-se desta forma, que o efeito fungitxico do leo essencial se deu pela ao do componente citral. Pereira et al. (2007), testando diferentes concentraes de leo essencial de C. citratus e E. citriodora sobre os fungos C. musae e C. gloeosporioides, causadores da podrido da banana, encontraram inibio em 100% do crescimento micelial do C. gloeosporioides na concentrao de 1000L/L a 1500L/L e do C. musae na concentrao de 1500L/L. Na concentrao de 1500L/L o leo essencial de E. citriodora proporcionou inibio de 61% do C. gloeosporioides e 84% do C. musae. A quantidade e a composio qumica dos leos essenciais so influenciadas por diversos fatores, entre eles, a idade da planta, o tipo de tecido, o tipo de solo onde a planta cultivada e o seu habitat, fatores climticos, fatores genticos e horrios de coleta do material vegetal (Silva, 2006). Uma perspectiva para aplicao dos resultados deste trabalho est na elaborao de produtos fitossanitrios naturais para o sistema orgnico de produo agropecuria. O Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento (Brasil, 1999) define os produtos orgnicos como todos aqueles produtos em que se adotam tecnologias que aperfeioem o uso de recursos naturais e scio-econmicos, respeitando a integridade cultural e tendo por objetivo a auto-sustentao no tempo e no espao, a maximizao dos benefcios sociais e a minimizao da dependncia de energias no renovveis. Assim, devido eficincia de controle do fungo com o uso de leos essncias, mais trabalhos devero ser realizadas, testando-se novas concentraes dos leos essenciais sobre o crescimento miceliano de C. gloeosporioides avaliando-se a atividade e estabelecendo concentraes inibitrias seguras dos leos.

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Revista Biotemas, 22 (3), setembro de 2009