GUA No 9: ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS I. EL PROBLEMA El carcter nico de cada aminocido se debe a la estructura del grupo R.

. En los polipptidos los grupos R de los aminocidos a menudo se denominan cadenas laterales y pueden variar desde un tomo de hidrgeno, hasta estructuras complejas como el grupo guanidina, el propsito de esta prctica es identificar algunos aminocidos que presentan grupos caractersticos en las cadenas laterales utilizando ensayos cualitativos y especficos para cada funcin. II. FUNDAMENTO TERICO Los aminocidos tienen un papel primordial en la formacin de los seres vivos, puesto que constituyen los bloques fundamentales con que se forman las protenas.. Entre las principales reacciones de identificacin de los aminocidos se encuentran las siguientes: A. Reaccin con la ninhidrina El grupo alfa-amino de los aminocidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayora de los aminocidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y caf para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reaccin tambin identifica los grupos alfa-amino libres presentes en pptidos y protenas. (caracteriza a todos los aminocidos) Fundamento: Todas las aminas primarias (y por lo tanto tambin los alfa-aminocidos) reaccionan con la ninhidrina en presencia de calor dando dixido de carbono, amoniaco y un aldehdo que contiene un El amoniaco reacciona con otra molcula de ninhidrina formando un compuesto azul violceo denominado prpura de Ruhemmans. B. Reaccin de Milln El anillo fenlico tiene un comportamiento caracterstico frente a las sales de Mercurio a pH cido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenlico de la tirosina y las protenas que la contienen. (caracterizacin del aminocido tirosina) Fundamento: Los compuestos mercricos en medio fuertemente ntrico (reactivo de Millon) se condensan con el grupo fenlico del aminocido tirosina, formando complejos de color rojizo. Los compuestos mercricos en medio fuertemente ntrico (reactivo de Millon) se condensan con el grupo fenlico del aminocido tirosina, formando complejos de color rojizo. El precipitado se torno blanco lechoso y se separo la parte blanca que dando bajo del tubo y arriba de el reactivo de Millon. C. Reaccin Xantoprotica Los anillos aromticos presentes en algunos aminocidos reaccionan con cido ntrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reaccin permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptfano. (caracterizacin de aminocidos aromticos) Fundamento: Se produce la nitracin del anillo bencnico presente en los aminocidos tirosina, fenilalanina y triptofano, obtenindose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formacin del cido picrmico o trinitrofenol) Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro. En el caso de esta reaccin nuestro tubo arrojo un precipitado blanco con grumos. D. Reaccin de Sakaguchi El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos. (caracterizacin del aminocido arginina) Fundamento: El grupo guanidino del aminocido arginina se condensa con el alfa-naftol del reactivo, y luego forma un complejo coloreado con el hipoclorito de sodio. E. Reaccin de Ehrlich La presencia de anillos aromticos fenlicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminocidos se puede identificar mediante la reaccin con cido sulfanlico y nitrito de Sodio por formacin de sales de

Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo as detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando pptidos y protenas. F. Reaccin de Hopkins Cole El anillo indlico presente en la cadena lateral de los alfa-aminocidos libres o haciendo parte de pptidos y protenas se puede reconocer mediante reaccin con el cido glioxlico a pH cido, puesto que forma complejos de coloracin violeta o amarillo violeta, permitiendo as identificar al triptfano. (caracterizacin del aminocido triptfano) Fundamento: El grupo indol del aminocido triptfano se condensa con el cido glioxlico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequea cantidad de cido sulfrico concentrado puro, aumenta la sensibilidad de la reaccin G. Reaccin con acetato de Plomo alcalino Los Aminocidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formacin de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino. III. TEMAS DE CONSULTA El preinforme debe contener los siguientes aspectos: Investigar la clasificacin de los aminocidos desde los siguientes puntos de vista: Esenciales y no esenciales para el hombre, cidos y bsicos en forma molecular, polares con carga y sin carga, apolares. Estudiar las estructuras, nombres y abreviaturas para los veinte aminocidos que son usados en la biosntesis de protenas. Para cada aminocido seale la cadena lateral o el grupo R e identifique las funciones presentes. Defina protenas Estudie que aminocidos estn presentes en las siguientes protenas1: Colgeno, albmina, IV. MATERIALES Y REACTIVOS Las soluciones estn propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por ejemplo 10 ml de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 8 grupos se requieren mximo 80 ml de ninhidrina. Materiales 15 Tubos de ensayo 2 Pipetas graduadas de 1 ml. 2 Pipetas graduadas de 2 ml. 2 Pipetas graduadas de 5 ml. 2 Vasos de precipitados de 250 ml. 1 Vasos de precipitados de 600 ml. 1 Embudo ordinario

1 Erlenmeyer de 125 ml. 1 Gradilla para tubo de ensayo 1 Pinza metlica para tubo de ensayo 1 Placa refractaria 1 Aro con nuez Material general Soportes

Para prevenir la contaminacin de los reactivos: las soluciones que no estn en frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el monitor debe estar pendiente, que las pipetas no sean intercambiadas durante al prctica. Reactivos por cada grupo de trabajo: 10 ml de cido sulfrico concentrado 12 ml de cido ntrico concentrado 10 ml de cido actico concentrado Se requiere la preparacin de los siguientes reactivos: 10 ml de Reactivo de ninhidrina : disolver 100 mg. de nilhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y completar a 100 ml con agua destilada 10 ml de Reactivo de millon:.disolver 1 g de mercurio en 1 ml. De cido ntrico concentrado, calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 ml con agua 5 ml de Reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. De bromo en 100 ml. De NaOH al 5% 10 ml de Reactivo de Hopkins cole: cido actico impurificado con trazas de cido glioxlico Soluciones 30 ml de Hidrxido de sodio 40%. 20 ml de Hidrxido de sodio 10 %. 10 ml de Hidrxido de amonio 10% 20 ml de cido clorhdrico 2%. 20 ml de Acetato de plomo 10%. 20 ml de Sulfato de cobre 0.5%. 10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco). 10 ml de cido sulfanlico 0.5% en HCl. 50 ml de Alfa-naftol 0.15%.

15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los siguientes aminocidos Cistena metionina. Glutamina asparragina. Lisina ornitina. Tirosina. Fenil-alanina. Prolina.

Arginina. Histidina.

Triptfano. Alanina.

Albmina de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relacin 1: 10 con agua destilada Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 ml. de agua caliente y filtrar a travs de gasa doble V. PROCEDIMIENTO A. Ensayo con ninhidrina Rotule cinco tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina, problema, albmina de huevo, y protena de trigo. A cada uno de los tubos de ensayo agregue 1 mL. de las respectivas sustancias que indica el rtulo usando agua destilada para el tubo marcado como blanco. Adicione a cada tubo 1 mL. de reactivo de Ninhidrina, caliente en bao de agua a ebullicin por 10 min. Observe los colores desarrollados y anote los resultados. B. Ensayo de Millon Rotule 6 tubos de ensayo identificados cada uno como: blanco, tirosina, fenil-alanina, problema, albmina de huevo y protena de trigo. A cada uno de ellos agregue 2 mL. de la solucin correspondiente y 1 mL. de reactivo de Millon. Caliente en bao de agua en ebullicin por 10 min. observe los colores desarrollados y anote los resultados. C. Ensayo Xantoprotico Rotule 6 tubos de ensayo de la misma manera que para el ensayo de Millon. Agregue a cada tubo 2 mL. de la solucin correspondiente y 2 mL. de cido ntrico concentrado. Caliente en bao de agua a ebullicin, la aparicin de una coloracin amarilla es una prueba positiva para aminocidos aromticos. Deje enfriar y agregue a cada tubo de ensayo 1.5 mL. de NaOH 40%, el cambio de color a anaranjado confirma la prueba. D. Reaccin de Sakaguchi Rotule 5 tubos de ensayo como: blanco, arginina, problema, albmina de huevo y protena de trigo. Agregue a cada uno 5 mL. de las soluciones correspondientes, enfre en bao de hielo por 10 min. y luego adicione 1 mL. de NaOH 40%, deje enfriar 10 min. ms y luego agregue 5 mL. de -naftoly 3 gotas de Reactivo de Sakaguchi, la aparicin de un color rosado o rojo es prueba positiva para el grupo guanidinio. E. Reaccin de Ehlrich En 5 tubos de ensayo rotulados como: blanco, triptfano, problema, albmina de huevo, protena de trigo. Agregue a cada tubo en el siguiente orden: 1 mL de cido sulfanilico 0.5% y 1 mL. De Nitrito de sodio, mezcle bien y deje en reposo durante 15 min. luego a cada tubo agregue 1 mL. De la solucin correspondiente al rtulo. Mezcle y adicione a cada tubo 0.5 mL. de NH4OH 10%. Observe y anote los resultados. F. Reaccin de Hopkins Cole Rotule 5 tubos de ensayo como: blanco, triptfano, problema, albmina de huevo y harina de trigo. Adicione a cada uno 2 mL. de la solucin correspondiente y 2 mL. del reactivo de Hopkins Cole. Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y cuidadosamente, sin mezclar 1 mL. de cido sulfrico concentrado, la formacin de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para el triptfano. G. Reaccin con acetato de Plomo alcalino Rotule 6 tubos de ensayo como: blanco, metionina, cisterna, problema, albmina de huevo y protena de trigo. En cada uno agregue 2 mL. de la solucin correspondiente, 2 mL. de NaOH 10% y 0.5 mL. de acetato de Plomo al 10%. Caliente en bao de agua a ebullicin por 5 min. La formacin de un precipitado gris oscuro o negro es prueba positiva para aminocidos azufrados. VIII. BIBLIOGRAFA BOHINSKI. 1991 Bioqumica. 5ed., Pearson. Mxico. Mathews Van Holde . 2004 Bioqumica. 3 Ed Pearson. Espaa Fesenden and fesenden. 2002. Qumica orgnica. Interamericana. Mxico

PROTENAS FUNDAMENTO Las protenas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrgeno. La mayora de ellas contienen adems azufre, y algunos fsforos. Sus molculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas molecularmente y tienen alto peso molecular. La molcula proteica esta compuesta de una combinacin de aminocidos por condensacin. Las pro teosas, peptonas, pptidos y aminocidos son derivados de las protenas formados en sntesis e hidrlisis. Hay ciertas reacciones coloreadas que dan las protenas y dependen de los aminocidos presentes en la molcula proteica. Todas dan la reaccin de BIURET. Esta es debida al grupo NH - CO. Las que contienen tirosina dan las reacciones Xantoproteica y de Millon, las que contienen triptofano dan la reaccin de este nombre, y las que contienen cistina dan la reaccin de la cistina (azufre). OBJETIVO Ver la presencia de protenas y su importancia dentro de los organismos vivos y su mecanismo de accin a nivel molecular. GENERALIDADES Las protenas Son biomolculas formadas bsicamente por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. Pueden adems contener azufre y en algunos tipos de protenas, fsforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polmeros de unas pequeas molculas que reciben el nombre de aminocidos y seran por tanto la monmera unidad. Los aminocidos estn unidos mediante enlaces peptdico. La unin de un bajo nmero de aminocidos da lugar a un pptido; si la n: de aa. Que forma la molcula no es mayor de 10, se denomina oligopptido, si es superior a 10 se llama polipptido y si la n: es superior a 50 aa. Se habla ya de protena.

LOS AMINOCIDOS Los aminocidos se caracterizan por poseer un Grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2).

Las otras dos valencias del carbono se saturan con un tomo de H y con un grupo variable denominado radical R. Segn ste se distinguen 20 tipos de aminocidos. ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS La organizacin de una protena viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposicin de la anterior en el espacio. ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria es la secuencia de aa. De la protena. Nos indica qu aas. Componen la cadena polipeptdica y el orden en que dichos aas. se encuentran. La funcin de una protena depende de su secuencia y de la forma que sta adopte.

ESTRUCTURA SECUNDARIA La estructura secundaria es la disposicin de la secuencia de aminocidos en el espacio. Los aas., a medida que van siendo enlazados durante la sntesis de protenas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposicin espacial estable, la estructura secundaria. Existen dos tipos de estructura secundaria: la a(alfa)-hlice la conformacin beta

Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre s misma la estructura primaria. Se debe a la formacin de enlaces de hidrgeno entre el -C=O de un aminocido y el -NH- del cuarto aminocido que le sigue.

En esta disposicin los aas. No forman una hlice sino una cadena en forma de zigzag, denominada disposicin en lmina plegada. Presentan esta estructura secundaria la queratina de la seda o fibrona. ESTRUCTURA TERCIARIA La estructura terciaria informa sobre la disposicin de la estructura secundaria de un polipptido al plegarse sobre s misma originando una conformacin globular. En definitiva, es la estructura primaria la que determina cul ser la secundaria y por tanto la terciaria.. Esta conformacin globular facilita la solubilidad en agua y as realizar funciones de transporte, enzimticas, hormonales, etc.

Esta conformacin globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminocidos. Aparecen varios tipos de enlaces: el puente disulfuro entre los radicales de aminocidos que tiene azufre. los puentes de hidrgeno los puentes elctricos las interacciones hidrfobas.

ESTRUCTURA CUATERNARIA Esta estructura informa de la unin, mediante enlaces dbiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptdicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptdicas recibe el nombre de protmero.

El nmero de protmeros vara desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o muchos como la cpsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60 unidades protecas. PROPIEDADES DE PROTEINAS Especificidad. La especificidad se refiere a su funcin; cada una lleva a cabo una determinada funcin y lo realiza porque posee una determinada estructura primaria y una conformacin espacial propia; por lo que un cambio en la estructura de la protena puede significar una prdida de la funcin.Adems, no todas las proteinas son iguales en todos los organismos, cada individuo posee protenas especficas suyas que se ponen de manifiesto en los procesos de rechazo de rganos transplantados. Desnaturalizacin. Consiste en la prdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha estructura. Todas las protenas desnaturalizadas tienen la misma conformacin, muy abierta y con una interaccin mxima con el disolvente, por lo que una protena soluble en agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita. CLASIFICACIN DE PROTENAS Se clasifican en: HOLOPROTENAS Formadas solamente por aminocidos HETEROPROTENAS Formadas por una fraccin protenica y por un grupo no protenico, que se denomina "grupo prosttico

HOLOPROTENAS

Globulares

Fibrosas

Prolaminas: Zena (maza),gliadina (trigo), hordena (cebada) Gluteninas: Glutenina (trigo), orizanina (arroz). Albminas: Seroalbmina (sangre), ovoalbmina (huevo), lactoalbmina (leche) Hormonas: Insulina, hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas...etc. Colgenos: en tejidos conjuntivos, cartilaginosos Queratinas: En formaciones epidrmicas: pelos, uas, plumas, cuernos. Elastinas: En tendones y vasos sanguneos Fibronas: En hilos de seda, (araas, insectos)

HETEROPROTENAS

Glucoproteinas

Lipoprotenas Nucleoprotenas Cromoprotenas

Ribonucleasa Mucoprotenas Anticuerpos Hormona luteinizante De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lpidos en la sangre. Nucleosomas de la cromatina Ribosomas Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxgeno Citocromos, que transportan electrones

METODO En las siguientes reacciones puede usarse albmina desecada preparar una solucin de ovo albmina agitando una pequea cantidad de polvo con agua. REACCIN DE BIURET Aadir 10 gotas de solucin de hidrxido de sodio y luego UNAS gotas de solucin dbil 3 gotas de sulfato de cobre. se produce un color violeta (una reaccin similar SE obtiene con el Biuret, sustancia obtenida calentando la urea de ah el nombre de esta reaccin, pero las protenas no contienen Biuret. Ejecutar la prueba de Biuret con una solucin acuosa de peptona. Se obtiene un color rosado. (caracterizacin de tripptidos en adelante) Fundamento: Los pptidos y protenas producen una reaccin coloreada muy usada para la valoracin de los mismos, llamada reaccin del Biuret. Las protenas por sus uniones peptdicas reaccionan con los

iones cpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2 ms uniones peptdicas para que se forme el complejo coloreado. REACCIN XANTOPROTEICA Aadir 2 gotas de cido ntrico a 2ml de albmina. Se obtiene un precipitado blanco. Calentar. Se vuelve amarillo enfriar bajo el grifo y aadir exceso de 6-10 gotas de hidrxido de amonio de o.88 % se vuelve naranja. REACCIN DE MILLON Aadir 2 gotas de de reactivo de MILLON (es una mezcla de nitrato mercuroso y mercurio en cido ntrico). Se obtiene un precipitado blanco. Hervir. Se vuelve rojo. REACCIN DEL TRIPTOFANO Aadir en exceso de cido actico glacial que ha sido expuesto a luz (y por tanto contiene cido glioxilico, del que depende la reaccin). Luego mediante un tubo de ensaye aadir cuidadosamente sulfrico concentrado. Se forma un anillo morado en la superficie de separacin (el color del anillo es muy leve, observar cuidadosamente). REACCIN DE ARGININA Aadir 2 gotas de de hidrxido de sodio seguido de unas gotas de alfa-naftol alcohlico y luego unas 3 gotas de hipoclorito de sodio. Se forma un color rojo. REACCIN DE CISTINA Aadir 2 gotas de solucin de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Aadir suficiente solucin de hidrxido de sodio para disolver este y luego hervir. La solucin se torna pardo obscura (debido a la formacin de sulfuro de plomo). REACCIN DE MOLISCH Aadir unas gotas de alfa- naftol alcohlico y agitar. Luego echar cuidadosamente con un embudo de separacin (el color del anillo formado es muy leve, observar cuidadosamente). Esta es una reaccin debida a la presencia de un grupo hidrocarbonato en la molcula proteica.

MATERIAL REACTIVOS Tubos de ensayo Sol. De ovo albmina Bao Maria Hidrxido de sodio Sulfato de cobre 1% Ac. Ntrico conc. Hidrxido de amonio de 0.88% Reactivo de Milln Ac. Actico glacial Beta - naftol alcohlico Hipoclorito de sodio Acetato de plomo Ac, sulfrico cinc.

OBSERVACIONES REACCIN DE BIURET La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico (CONH -) que se destruye al liberarse los aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, de frmula:

Debido a dicha reaccin fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovo albmina precipito a una coloracin violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reaccin positiva. A los 2 ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret Precipitando a una coloracin amarilla la reaccin nos torna negativa al no haber presencia de protenas. D) REACCIN DEL TRIPTOFANO

El grupo indol del aminocido triptfano se condensa con el cido glioxlico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequea cantidad de cido sulfrico concentrado puro, aumenta la sensibilidad de la reaccin. En este caso el precipitado fue la formacin de un anillo color morado en la superficie de separacin, reaccin positiva. E) REACCIN DE ARGININA El grupo guanidino del aminocido arginina se condensa con el alfa-naftol del reactivo, y luego forma un complejo coloreado con el hipoclorito de sodio. La reaccin nos precipito a un rojo ladrillo. Reaccin positiva. F) REACCIN DE LA CISTINA Esta reaccin dar positiva con aquellos aminocidos que presenten azufre en su estructura, como son la cistina, la cisteina y la metionina. La reaccin consiste en someter la muestra a una hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio. R-SH + 2 NaOH - R-OH + SNa2 + H2O De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo SNa2 + (CH3-COO)2 Pb - 2 CH3-COONa + SPb (precipitado) Al contacto con el acetato de plomo se forma una precipitacin lechosa al agregar hidrxido de sodio la precipitacin formada desaparece. Al contacto del bao Maria la coloracin cambia a pardo. G) REACCIN DE MOLISCH Todos los Glcidos por accin del cido sulfrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos compuestos furfricos reaccionan positivamente con el reactivo de Molish (solucin alcohlica de alfa-naftol). Al contacto con la albmina se obtuvo un precipitado blanco sin juntarse las sustancias al contacto con el agua caliente empieza a tornarse una coloracin amarillo huevo en forma de una bolita amarilla dejamos en bao Maria hasta lograr el precipitado rojizo reaccin positiva.

CONCLUSIONES Las protenas, debido al gran tamao de sus molculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formacin de cogulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 700C o al ser tratadas con soluciones salinas, cidos, alcohol, etc. La coagulacin de las protenas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalizacin por los agentes indicados, que al actuar sobre la protena la desordenan por la destruccin de su estructura terciaria y cuaternaria.

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