LA BIOLOGA MOLECULAR Y EL ADN MOLECULAR BIOLOGY AND THE DNA

REINALDO VELASCO MOSQUERA1

PALABRAS CLAVE:
ADN, enzimas de restriccin, marcadores moleculares, PCR, diversidad gentica.

RESUMEN
El presente Artculo es una descripcin de los aspectos ms importantes que se conocen del ADN desde que Watson y Crick presentaron su modelo estructural y de la simultnea evolucion de la biologa molecular, aspectos que han permitido conocer el comportamiento de esta molcula tan esencial para la vida y cmo ella ha servido para resolver problemas en diferentes campos como el de la crimi-nalistica y en estudios de diversidad gentica especialmente a partir del decubrimiento de las enzimas de restriccin y los denominados marcadores moleculares, la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) y otras tcnicas basadas en ella, las cuales emplean el concepto de ADN polimorfico.

KEY WORDS:
DNA, restriction enzymes, molecular markers, PCR, genetic diversity.

ABSTRACT
This article is a description of the most important aspects that are known of the DNA since Watson and Crick presented its structural model and of the simultaneously evolution of the molecular biology, aspects that have allowed to know the behavior of this molecule so essential for the life and how she has been good to solve problems in different fields like that of the judicial camp and in studies of genetic diversity especially since the discovery of the restriction enzymes and the denominated molecular markers, the PCR (Polimerase Chain Reaction) and other techniques based on her, which use the concept of polimorphic DNA.

____________ Recibido para evaluacin: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicacin: 27 de febrero de 2004. 1 MSc., Especialista en Biotecnologa, Profesor Asociado Departamento de Agroindustria, Grupo de Investigacin ASUBAGROIN FCA Unicauca

Correspondencia: Reinaldo Velasco Mosquera. , e_mail: rvelasco@unicauca.edu.co

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INTRODUCCION
La Biologa molecular es la ciencia que se ocupa del estudio de las bases moleculares de la vida; es decir, relaciona las estructuras de las biomolculas con las funciones especficas que desempean en la clula y en el organismo. Por tanto su objetivo fundamental es la comprensin de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la informacin gentica se transmita eficientemente de unos seres a otros y se exprese en los nuevos individuos. Para ello requiere de la secuenciacin de los cidos nucleicos, del diagnstico molecular, de la produccin de fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, entre otras disciplinas (1).

rial gentico se ha duplicado. Este material incluye toda la informacin necesaria para el control de las funciones vitales de las clulas y del organismo. Durante la divisin celular, las dos clulas hijas reciben igual dotacin gentica; de este mismo modo se reparte el material hereditario a la descendencia, cuando se reproduce un organismo. Cada nucletido est formado por una molcula de azcar desoxirribosa (no posee O en el sitio 2, nicamente un H), una base orgnica nitrogenada (pirimidinas, como en el caso de la citosina y la timina, o purinas, como en el caso de la adenina y la guanina) y un grupo fosfato. Los nucletidos se enlazan entre s por enlaces covalentes fosfodiester entre el grupo fosfato ubicado en el sitio 5 con el grupo OH ubicado en el sitio 3 del nucletido anterior. El enlace covalente es una unin en la cual dos electrones son compartidos por dos tomos. En este tipo de enlace, cada electrn del par compartido es atrado por los ncleos involucrados en el enlace, lo cual hace que sea un enlace muy fuerte, que dependiendo del tipo de tomos involucrados puede tener una energa desde los 263 kJ/mol para un enlace C-P hasta 460 kJ/mol para un enlace O-H (2). Esto hace que la molcula de ADN sea particularmente estable en condiciones tanto intra como extracelulares. Los enlaces covalentes que unen a cada subunidad de nucletido son qumicamente estables y no son susceptibles de experimentar ruptura hidroltica en el medio acuoso de la clula. Esto establece una forma segura y duradera de almacenamiento de la informacin gentica, que no debe alterarse ni daarse de generacin en generacin. Es por esta razn que se ha extrado ADN de especimenes de museo y muestras arqueolgicas de varios millones de aos (3). La cadena orientada en el sentido 5 3 recibe el nombre de codificante porque es la que tiene la informacin y la cadena antiparalela que va en el sentido 3 5 el de cadena molde, porque es en esta cadena en la que se hibridiza el ARN. Una vez terminada una cadena, en el extremo 5 queda un grupo fosfato y en el extremo 3 un grupo OH. Esta disposicin lleva las bases orgnicas al interior de la doble hlice. Las bases adyacentes de la misma

EL ADN
La presentacin del modelo estructural del cido desoxirribonucleico (ADN) por Francis Harry Comton Crick y James Dewey Watson en 1953, fue el verdadero inicio de la biologa molecular. La importancia de este hecho se debe, por un lado a que es la molcula que transmite la informacin hereditaria de generacin en generacin, y por otro a que la propia estructura muestra cmo lo logra. La qumica de la molcula de ADN tiende a ser ms bien simple, considerando la enorme cantidad de informacin almacenada y su misin trascendental en la clula. Es una molcula de doble cadena de nucletidos, arreglados en forma antiparalela y complementaria, unidas entre s por puentes de hidrgeno entre los nucletidos: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). La A de una cadena se aparea siempre con la T de la cadena complementaria mediante dos enlaces de hidrgeno, y la G con la C mediante tres enlaces de hidrgeno. Los puentes de hidrgeno ocurren entre un tomo de hidrgeno enlazado con un tomo electronegativo (O, C, N) y un segundo tomo electronegativo. Los puentes de hidrgeno tienen una energa de estabilizacin de 10-30 kJ/mol (2). Durante la replicacin o duplicacin, las dos hebras simples se separan y cada una de ellas forma una nueva hebra complementaria, incorporando bases, la A se unir a la T de la hebra molde, la G lo har con la C y as sucesivamente. De esta manera se obtiene otra molcula de ADN, idntica a la original y por tanto, el mate-

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hebra se apilan unas sobre otras (como peldaos de una escalera en espiral), esto permite la formacin de interacciones hidrofbicas, en las que la presencia de agua obliga a los grupos no polares a distribuirse ordenadamente para evitarla, las cuales tienen una energa de estabilizacin de 5-30 kJ/mol, e interacciones de van der Waals, formadas entre molculas con dipolos transitorios inducidos por fluctuacin de electrones, ocurriendo entre cualquier par de tomos que esten muy cercanos, estas ultimas tienen una energa de stabilizacin de 1-5 kJ/mol (2). El lenguaje empleado para almacenar la informacin en el ADN consiste en el alfabeto de las cuatro letras: A, T, G y C. El formato para almacenarla es una secuencia lineal de los nucletidos en ADN que vara en tamao y secuencia con cada especie. Por ejemplo, el genoma humano completo tiene 1 metro de longitud y contiene un nmero estimado de 3 mil millones de pares de nucletidos. Una molcula de ADN de E. Coli mide cerca de 2 cm de largo y contiene alrededor de 4 millones de pares de nucletidos.

en sitios especficos, permitiendo cortar el ADN en fragmentos menores, ms consistentes e identificables, por lo cual es ms fcil aislar los fragmentos que por tan el gen que interesa a los bilogos moleculares (4). Aunque la Ciencia posea las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su aplicacin en la resolucin de casos judiciales solo se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del Interior Britnico solicit la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Gentica de la Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalstica fueron resueltos gracias a la tcnica de los RFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin). Jeffreys descubri la existencia de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restriccin generaban fragmentos de longitud variable. Estudios posteriores realizados por el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el tamao de estos fragmentos se deban a que estas regiones consistan en un determinado nmero de repeticiones en tndem de una secuencia central, la cual variaba de unos individuos a otros (1). El primer locus de ADN polimrfico fue descubierto por Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de ms de 15 longitudes diferentes en una pequea muestra de individuos. Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen ras, en el pseudo gen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en tndem de una secuencia de oligonucletidos (11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependan del nmero de dichas repeticiones y se les denomin VNTR (Variable Number of Tandem Repeat). Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se observ que stos podan ser aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clsicos, que consistan en el estudio de antgenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), protenas sricas, enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores poda incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por poseer una combinacin gentica igual o diferente a la del vestigio biolgico hallado en el lugar de los hechos.

LA BIOLOGIA MOLECULAR
Podra parecer que purificar molculas de ADN es tarea fcil, sin embargo en la prctica es bien difcil conseguir una molcula bien definida de ADN natural de cualquier organismo, excepto los virus ms simples. Esto se debe a la gran complejidad que presenta esta molcula, la cual como ya se dijo es una cadena compuesta de desoxinucletidos normalmente apareada con otra cadena con secuencias complementarias formando hlices dobles, las cuales a su vez estn enrolladas y rodeadas de protenas diversas (4). Cuando los bilogos moleculares intentan aislar una cadena de ADN desnuda, esta es tan larga y delgada que se rompe aleatoriamente en mltiples pedazos hasta con el tratamiento ms suave. Por esta razn la extraccin de ADN que se haga de mltiples clulas idnticas, as mismo producir mltiples copias de cualquiera de los genes de dicho ADN, pero cada copia se hallar en un fragmento de distinta longitud. Durante muchos aos este problema fue un obstculo para el estudio de los genes. En los aos sesenta se descubrieron las restrictasas (endonucleasas de restriccin), enzimas que cortan las cadenas de ADN

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En un principio la manera de estudiar los marcadores VNTRs se hizo por medio de la tcnica llamada hibridacin con sondas o Southern blot. Esta tcnica consta bsicamente de las siguientes etapas (1): 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Digestin del ADN con enzimas de restriccin tras conseguir extraer un ADN de alta molecularidad. Separacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa. Desnaturalizacin de los fragmentos separados y cortados. Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijacin de las mismas por medio de calor (80C). Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico para bloquear los lugares de unin inespecficos que pudiera haber en la membrana. Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos (32P normalmente). Hibridacin de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal. Revelado en placa radiogrfica e interpretacin de los resultados.

Informacin aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad discriminativa al aparecer mltiples bandas. No obstante, las mono-locus son ms especficas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor tamao. Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario a la sonda est intacto. Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las mono-locus son exclusivas de una especie, se ha utilizado con frecuencia en humano. A pesar de que el anlisis SLP ha sido y es bastante til en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicacin a la Criminalstica ya que presenta una serie de inconvenientes como son:

8.

Las sondas utilizadas pueden ser de dos tipos:

Sondas Mono-locus (SLP): son especficas para una regin de un determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucletidos y presentan mayor variabilidad que las sondas multilocus. Como resultado se observan una o dos bandas por individuo, segn sea homocigoto o heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o DNA profiling Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatlites presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucletidos que se repiten mltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por persona. Este patrn de mltiples bandas se conoce como huella gentica multilocus o DNA fingerprint.

La cantidad de ADN que se necesita est entre 20 y 100 ng, cantidad difcil de conseguir en casos de criminalstica en los que los indicios biolgicos encontrados son mnimos. En cuanto a la calidad del ADN, en la prctica forense es muy difcil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un anlisis con sondas mono-locus. El tiempo requerido para este tipo de anlisis es de dos o tres das. El hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hace que normalmente, con el primer anlisis se consuma la totalidad de la muestra, con lo que se dificultan contra pericias y una posterior revisin del caso.

LA PCR
Kary B. Mullis, quien trabajaba desde 1979 en Cetus Corporation, de Emeryville, California, dice que: saba que una tcnica que permitiese fcilmente identificar el nucletido presente en una posicin determinada de una molcula de ADN sera muy til, sobre todo en los casos de gran complejidad del ADN y con pe-

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de parmetros como son:

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quea cantidad disponible de esta molcula. No vea por qu no se poda utilizar la enzima polimerasa de ADN en una variante del mtodo de secuenciacin con ddNTPs y dise un cndido experimento para someter esa idea a comprobacin. Pasaron meses mientras preparaba mi primer experimento para comprobar si la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) funcionaba. Cuando estuvo todo listo, acomet mi tipo favorito de experimento: el que slo necesita un tubo de ensayo y en el que la respuesta es positiva o negativa. Multiplicara la PCR la secuencia de ADN seleccionada? La respuesta fue s (4). La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se volvi rpidamente una de las tcnicas ms ampliamente usadas en biologa molecular por una buena razn: es rpida, es un medio relativamente barato y simple de producir cantidades relativamente grandes de copias de ADN a par tir de cantidades muy pequeas de molculas de material de ADN, incluso si la fuente de ADN es de relativamente pobre calidad. Las tcnicas basadas en PCR emplean el concepto de polimorfismo o de ADN polimorfico: poli = muchas; mrfico = formas. Y se refiere a que existen secuencias de ADN que son relativamente variables entre diferentes individuos o especies. Algunas regiones de ADN dentro de un genoma pueden ser sumamente conservados (no variar) entre los individuos de una especie o entre especies de una misma familia. Ese ADN conservado no ser til para la utilizacin de mtodos analticos que emplean el ADN para encontrar diferencias entre los individuos. Alternativamente, algunos de los intervalos de ADN dentro del genoma tienden a variar moderada o extremadamente entre los individuos. Estos intervalos variables de ADN sern ms informativos al usar el ADN para distinguir a los individuos uno de otro o para distinguir las especies una de otra.

sentes en todos los individuos, pero que poseen la caracterstica de ser altamente variables o polimrficos entre los mismos. El anlisis de un determinado nmero de estas secuencias o fragmentos de ADN permite inclusive identificar a un ser humano con una probabilidad muy cercana al 100%. Adems de ser muy poli-mrfico, el ADN que se utiliza para este tipo de identificaciones, es un ADN no codificante o no expresivo, por lo que no revela caractersticas feno-tpicas de los individuos; este hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creacin de las bases de datos genticas (5). Para analizar dichos polimorfismos del ADN se utilizan una serie de tcnicas que estn en continua evolucin, consiguiendo que cada vez la identificacin por medio del ADN sea ms precisa y rpida. Se parte entonces de unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir, de regiones polimrficas del ADN. As, analizando un determinado nmero de regiones polimrficas, la probabilidad de que dos individuos sean genticamente iguales es prcticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos). El estudio de indicios biolgicos por PCR ha permitido la resolucin de un gran nmero de casos en Criminalstica que hasta entonces eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su anlisis por RFLP . Con el uso de la PCR muestras tan mnimas como pueden ser un pelo con raz, una minscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un anlisis de identificacin gentica (1). En estudios de diversidad gentica se emplean tanto la PCR como una serie de tcnicas basadas en ella. Hoy en da estas tcnicas son muy empleadas, no obstante no hay una comprensin adecuada de los principios que rigen estas tcnicas, ni el papel que desempean los reactivos qumicos empleados en su ejecucin. En un prximo artculo se presentar una revisin bibliogrfica acompaada de un anlisis terico de lo biolgico, lo qumico y las probabilidades, para compendiar esta informacin que est diseminada en diferentes textos y artculos cientficos.

APLICACIONES
La identificacin con ADN o huella gentica se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN pre-

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REFERENCIAS
(1) Entrala C. BIOTECNOLOGIA. Laboratorio de ADN forense, Depto. de Medicina Legal. Universidad de Granada, Espaa. 2000. (2) Chang R. QUIMICA. Cuarta edicin. McGraw Hill. Mxico. 1992. (3) Moore S., Sargeant L.L., King T.J., Mattick J.S., Hetzel D.J., THE CONSERVATION OF

DINUCLEOTIDE MICROSATELLITES AMONG MAMMALIAN GENOMES ALLOWS THE USE OF HETEROLOGOUS PCR PRIMER PAIRS IN CLOSELY RELATED SPECIES. Mammalian Genome 3,452-456. 1991. (4) Mullis K.B., THE POLYMERASE CHAIN REACTION, Birkhauser, Boston 1994 (5) Cornide M.T., DIVERSIDAD GENETICA Y MARCADORES MOLECULARES. CNIC, La Habana, 2000