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Clonación de genes para la caracterización de la respuesta a cromo hexavalente y eventual mejora

Clonación de genes para la caracterización de la respuesta a cromo hexavalente y eventual mejora de cepas fúngicas nativas de sitios contaminados

Díaz Hernández, L. Unidad Académica de Biología Experimental Universidad Autónoma de Zacatecas Gutiérrez Corona, F. Romo Rodríguez, S. B. P. Departamento de Biología División de Ciencias Naturales y Exactas Universidad de Guanajuato

RESUMEN

La cepa Ed8 de A. niger var. tubingensis es nativa de suelos contaminados con cromo

hexavalente, posee resistencia al metal y la capacidad de transformarlo en Cr (III). En el

laboratorio se han clonado los genes m1pd y gox de la cepa Ed8, codificantes de la

Manitol 1 fosfato deshidrogenasa (M1PD) y Glucosa oxidasa (GOX), respectivamente.

También, se han obtenido construcciones moleculares para interferir con la función de

dichos genes en la cepa Ed8, mediante la estrategia de silenciamiento génico por RNA de

interferencia, con el fin de conocer el papel de los correspondientes productos en la

resistencia a cromo hexavalente y/o la capacidad de reducirlo a Cr (VI) de la cepa.

Con el objetivo de contar con un protocolo para introducir de manera eficiente las

mencionadas construcciones en el genoma de la cepa Ed8, en este proyecto de verano se

avanzó en el establecimiento de un protocolo de transformación de esferoplastos. Se

determinaron las condiciones para la obtención de esferoplastos mediante tratamiento

con una enzima lítica y se estableció la concentración mínima inhibitoria de higromicina,

tanto para los esferoplastos (300 µM) como para conidias (70 µM). También, se realizó

un experimento de PCR para validar la utilidad de oligonucleótidos diseñados para distinguir el vector

un experimento de PCR para validar la utilidad de oligonucleótidos diseñados para distinguir el vector de silenciamiento pSilent–1 de construcciones moleculares derivadas del mismo, conteniendo fragmentos del gen gox de la cepa Ed8.

INTRODUCCIÓN

Los compuestos de cromo son contaminantes ambientales debido al amplio uso del metal en diversas actividades industriales. Los estados de oxidación más estables encontradas en la naturaleza son el cromo trivalente Cr (III) y el cromo hexavalente Cr (VI). Este último, que se encuentra comúnmente en forma de cromatos (CrO4 2 ) y dicromatos (Cr2O7 2 ), es un fuerte agente oxidante que es considerado la forma mas toxica del metal, siendo mutagénico y carcinogénico en humanos y mutagénico en bacterias (Losi y col.,1994). Por estudios previos del grupo de trabajo, se aislaron cepas de hongos filamentosos nativas de sitios contaminados con cromo hexavalente, algunas de las cuales eran resistentes al ión y mostraban la capacidad de transformarlo en Cr (III) (Espino Saldaña, 2002; Acevedo Aguilar y col., 2006). Entre dichas cepas esta Ed8, cuya identificación mediante estudios moleculares y morfofisiológicos indicó que es un aislado de Aspergillus niger var tubingensis (Fernàndez Perrino y col. 2007; Coreño Alonso y col., 2009). Se ha observado que en la cepa Ed8 incubada con Cr (VI) ocurre incremento en la producción de metabolitos como el manitol y el ácido glucónico (Acevedo Aguilar, 2008; Coreño Alonso, 2009). La evidencia sobre la relación de estos cambios con las características fenotípicas de resistencia a Cr (VI) y/o la capacidad de su transformación a Cr (III) por la cepa Ed8, puede provenir de estudios de manipulación de la producción de los metabolitos mencionados por procedimientos de genética molecular. Con este fin, en el laboratorio se ha avanzado en la clonación de

los genes m1pd [codificante de la Manitol 1–Fosfato Deshidrogenasa ( M 1 PD ), implicada

los genes m1pd [codificante de la Manitol 1–Fosfato Deshidrogenasa (M1PD), implicada en la síntesis de manitol] (Castillo Nava, 2009) y gox [codificante de la Glucosa Oxidasa (GOX) implicada en la síntesis de ácido glucónico] de la cepa Ed8 (Rodríguez Preciado, 2010) y se han obtenido construcciones moleculares para interferir con la función de dichos genes en la cepa Ed8, mediante la estrategia de silenciamiento génico por RNA de interferencia (Romo Rodríguez, 2010).

Justificación

La introducción de construcciones moleculares en la cepa Ed8 de A. tubingensis requiere de la implementación de un procedimiento de transformación genética y de procedimientos moleculares de verificación de las construcciones realizadas y de análisis de transformantes.

MÉTODOS Y MATERIALES

Microorganismos y medios de cultivo

Se utilizó la cepa resistente a cromato de Aspergillus niger var. tubingensis Ed8, aislada previamente (Espino Saldaña, 2002; Acevedo Aguilar y col., 2006). El medio de crecimiento para la obtención de conidias es el medio mínimo Lee (Lee y col., 1975) al que se le añade dextrosa al 0.25%. Para la obtención de germínulas a ser usadas para la obtención de esferoplastos se usò el medio de cultivo YED (extracto de levadura, 1 %; Dextrosa, 1 % ; Hepes, 20 mM y a justando el pH a 8 con NaOH 1M). 1) Obtención de germínulas. Se inocularon conidias frescas de la cepa Ed8 en 50 ml de medio YED, a una concentración de 5x10 5 con/ml, y se incubo durante 8 hrs a 29°C y 200 rpm de agitación. Se corroboro la aparición de germínulas al microscopio.

2) Obtención de esferoplastos. Se filtraron las germínulas en un filtro tipo monodur. Después fueron

2) Obtención de esferoplastos. Se filtraron las germínulas en un filtro tipo monodur. Después fueron transferidas a solución OM (1.2 M MgSO4 + 0.1 M Na2HPO4); a esta solución se le agregaron enzimas líticas de Rhizoctonia solani a una concentración final de 2.5% y la mezcla se incubo por 3 hs a 29°C y 60 rpm de agitación. Se corroboró la aparición de esferoplastos al microscopio. Una vez que se observaron los esferoplastos formados, estos se filtraron en filtros monodur y el filtrado conteniendo los esferoplastos se centrifugo a 3000 rpm a 4°C durante 30 min. Se retiro el sobrenadante y se recuperaron los esferoplastos con solución STC (15% sorbitol, 0.75% CaCl2.2H2O, 1M Tris HCl pH 7.5), se agrego 10% de PEG y 1% de DMSO para su almacenamiento. 3) Tinción con calcoflúor. Una alícuota de los esferoplastos producidos se mezclo en una dilución 1:1 con el colorante Calcoflúor white al 0.1%. La mezcla anterior se observo al microscopio con un filtro para calcoflúor. 4) Reacción en cadena de la polimerasa. Para las reacciones de amplificación se uso la enzima DreamTaq™ DNA Polymerase de Fermentas. Los oligonucleótidos para amplificar al vector pSilent–1 usados fueron SilF1(Directo– 5´ CAAGCATCGATACCGTCG 3´) y SilR1 (Reverso– 5´ TTAAGTGGATCCGGGGCC 3´). Las condiciones de amplificación fueron 94°C por 30 seg, 55°C por 30 seg, 72°C por 1 min, 30 ciclos. Los vectores usados para la amplificación fueron pSilent–1 y pSil–SGOXc. 5) Obtención de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de higromicina para esferoplastos. La obtención de la CMI se realizo mediante la adición de aproximadamente 10 5 de estas células mezcladas con top agar a cajas de medio mínimo; después de 12 horas de incubación se agregó una capa de top agar con diluciones del antibiótico que iban desde los 260 hasta los 320 µg/ml. Después de 5–7 días de incubación, se registraron los resultados de ausencia o presencia de colonias en las cajas.

D ISCUSIÓN DE RESULTADOS 1. Preparación de esferoplastos Con el fin de avanzar en el

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

1. Preparación de esferoplastos

Con el fin de avanzar en el establecimiento de un protocolo de transformación para la cepa ambiental Ed8 de A. tubingensis, se establecieron las condiciones para la obtención de esferoplastos. Primeramente se determinaron las condiciones adecuadas para la obtención de germìnulas, determinándose que a las 8 hrs de cultivo en medio YED alrededor del 90% de las esporas inoculadas inicialmente presentaban el tubo germinativo. Estas germínulas se colocaron en una solución de enzimas líticas de Rhizoctonia solani con actividad de glucanasa, esto con el fin de eliminar los componentes de la pared celular. Se observo que a las 3 hs de contacto con dicha solución ya se apreciaba la aparición de posibles esferoplastos; como se muestra en la Figura 1A, los esferoplastos se tiñen con calcoflúor de manera difusa, probablemente debido a que después del tratamiento en la superficie celular aun quedan fragmentos de pared. También, se observa que las conidias no digeridas no se tiñen con el calcoflúor (Fig. 1B.).

no digeridas no se tiñen con el calcoflúor (Fig. 1B.). Figura 1. Tinción de esferoplastos con

Figura 1. Tinción de esferoplastos con calcoflúor. A) Microscopía de campo claro 40x; B) El mismo campo observado por microscopía de fluorescencia con filtro para calcoflúor. Se observa que solo el esferoplasto (‹) se tiñó de manera difusa con la solución de calcoflúor, mientras que la espora («) no presenta la tinción.

2. Determinación de la CMI para higromicina en esferoplastos Se sembraron alrededor de 10 5

2. Determinación de la CMI para higromicina en esferoplastos

Se sembraron alrededor de 10 5 protoplastos en cajas de medio mínimo conteniendo como soporte osmótico sacarosa y suplementado con diferentes concentraciones de higromicina. Como se muestra en la Fig. 2B, a 250 µg/ml de higromicina el crecimiento disminuye, hasta que es completamente inhibido en medio con 300 µg/ml del antibiótico (Fig. 2C). En base a estas observaciones, la concentración de 300 µg/ml de higromicina podrá ser utilizada para seleccionar transformantes mediante tratamiento con vectores conteniendo como marcador de selección el gen de resistencia a higromicina.

A) B) C)
A)
B)
C)

Figura 2. Protoplastos.

3. Amplificación de fragmentos en los plásmidos pSilent–1 y pSil–SGOXc

En el laboratorio ya se contaba con el vector de silenciamiento pSilent–1 y con la construcción pSil–SGOXc, esta última basada en el vector pSilent–1 pero que además cuenta con la inserción de fragmentos del gen gox, necesarios para que se lleve a cabo el silenciamiento de este gen en la cepa Ed8 de A. tubingensis (Romo, 2010). Se diseñaron oligonucleótidos iniciadores (SilF1 y SilR1) los cuales amplifican un fragmento del vector pSilent–1 y que flanquean a los sitios multiclonaje en donde se insertaron las secuencias génicas para el silenciamiento. Mediante PCR con los oligonucleótidos SilF1 y SilR1 se realizó la amplificación de la región mencionada usando como templado DNA

del vector pSilent–1 o de la construcción pSil– SGOX c. Como se muestra en la

del vector pSilent–1 o de la construcción pSil–SGOXc. Como se muestra en la Figura 3, los oligonucleótidos amplifican los fragmentos esperados para cada uno de los plásmidos mencionados; para el caso de la construcción pSil–SGOXc, se observa la amplificación de un fragmento de alrededor de 800 pb, correspondiente a la inserción de un fragmento de 600 pb del gen gox dentro del vector pSilent–1 y 200 pb correspondientes al vector pSilent–1. Por otra parte, como se esperaba, con el vector pSilent–1 el producto amplificado es de alrededor de 200 pb (carril 2). Con lo anterior se demuestra que este par de oligonucleótidos es útil para los fines que fueron diseñados.

es útil para los fines que fueron diseñados. Figura 3. Amplificación por PCR de fragmentos de

Figura 3. Amplificación por PCR de fragmentos de los vectores pSilent–1 y pSil–SGOXc. Carril 1, productos de la reacción usando como templado DNA del plásmido pSil–SGOXc; carril 2, productos de amplificación usando como templado DNA del vector pSilent–1; carril 3, marcadores de tamaño molecular (tamaños indicados a la derecha).

CONCLUSIONES

1. En la cepa Ed8 de A. tubingensis los esferoplastos pueden ser formados mediante

tratamiento con enzimas líticas de Rhizoctonia solani

2. Es factible la distinción del vector pSilent–1 de construcciones derivadas del mismo,

como pSil–SGOXc, mediante el uso de los oligonucleótidos SilF1 y SilR1. Estos también

podrán ser aplicados para la verificación de transformantes de la cepa Ed8 conteniendo diferentes construcciones.

podrán ser aplicados para la verificación de transformantes de la cepa Ed8 conteniendo diferentes construcciones.

BIBLIOGRAFÍA

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Proyecto de Servicio Social, Departamento de Biotecnología, UAM –Iztapalapa e IIBE , Facultad de Química,

Proyecto de Servicio Social, Departamento de Biotecnología, UAM–Iztapalapa e IIBE, Facultad de Química, Universidad de Guanajuato. Lee, K.L., Buckley, H.R. y Campbell, C.C. (1975). «An aminoacid liquid synthetic medium for the development of mycelial and yeast forms of Candida albicans». J Med Vet Mycol 13:148–153 Losi, M.E. Amrhein, C. y Frankenberger, W.T.J. (1994). «Environmental biochemistry of chromium». Rev Environ Contam Toxicol. 136:91–131. Romo Rodríguez, P. (2010). Alteración genética de posibles moléculas involucradas en la tolerancia y/o reducción de Cromo VI en la cepa Ed8 de Aspergillus niger var. tubingensis. Tesis doctoral (en proceso). Posgrado en Biología Experimental, Universidad de Guanajuato.