Universidade Estadual de Feira de Santana Engenharia de Alimentos Departamento de Cincias Exatas Disciplina: Qumica orgnica II Exa 411 Docente:

: Carla Mendes

Separao cromatogrfica de pigmentos de folhas verdes

Feira de Santana Ba Agosto, 2012

Universidade Estadual de Feira de Santana Engenharia de Alimentos Departamento de Cincias Exatas Disciplina: Qumica orgnica II Exa 411 Docente: Carla Mendes Discentes: Edinara Lacerda Queiroz e Samanta Sousa Silva

Cromatografia

Relatrio de aula prtica da disciplina Qumica orgnica II do curso de engenharia de alimentos, ministrado pela docente Carla Mendes, requerido como atividade avaliativa.

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Feira de Santana Ba Agosto, 2012

RESUMO A cromatografia um mtodo de separao fsico- qumica dos componentes de uma mistura, realizado atravs de uma migrao destes componentes entre duas fases que esto em contato, a fase mvel e a fase estacionria, uma das fases permanece estacionria, enquanto a outra se move atravs dela. A tcnica cromatogrfica possui uma grande variabilidade de aplicaes, podendo ser utilizada para purificao de compostos, separao dos componentes de uma mistura e para estabelecer a identidade de compostos.

OBJETIVO Observar a separao das substncias que compem o extrato de coentro, sendo elas as clorofilas a, b e os carotenos a partir da anlise das bandas obtidas nas cromatografias em camada delgada (CCD) e cromatografia em coluna (CC).

INTRODUO A cromatografia um mtodo simples e de grande aplicao na qumica, devido a sua facilidade de executar a separao e identificao de compostos. A tcnica envolve uma srie de processos de separao de misturas e acontece pela passagem de uma mistura atravs de duas fases: uma estacionria (fixa) e outra mvel que esto intimamente ligadas. A fase mvel pode ser um gs, um lquido ou um fluido super crtico e a fase estacionria fixa pode ser colocada em uma coluna ou numa superfcie slida. A interao dos componentes da mistura com estas duas fases influenciada por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e especficos efeitos de afinidade e solubilidade. Os termos cromatografia e cromatograma surgiram em 1906, quando o botnico russo Mikhail Tswett descreveu suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas e de gemas de ovo, utilizando uma coluna de vidro empacotada com CaCO3 e ter de petrleo, a separao foi visualizada atravs de faixas coloridas na coluna.

H diversas formas de cromatografia e estas podem ser classificadas, levando-se em conta alguns critrios como a forma fsica do sistema, a fase mvel empregada, a fase estacionria empregada e o mtodo de separao. De acordo com a forma fsica do sistema a cromatografia pode ser classificada como cromatografia em coluna e cromatografia planar, a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), e as cromatografias por centrifugao e em camada delgada (CCD) so os tipos de

cromatografia em coluna. Quanto a fase mvel utilizada a cromatografia pode ser classificada como: cromatografia gasosa, cromatografia lquida ou cromatografia supercrtica (CSC). Quanto fase estacionria, diferem entre fases estacionrias lquidas, slidas e quimicamente ligadas. Quando a fase estacionria composta por um lquido, ele pode estar adsorvido em um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so considerados isoladamente, como fases quimicamente ligadas, por serem diferentes dos outros dois em seus mecanismos de separao. Quanto ao modo de separao cromatografia pode ser por partio, adsoro, excluso, e troca inica. Na cromatografia em camada delgada (CCD) a separao das substncias ocorre pela migrao das mesmas sobre uma camada delgada de adsorvente que est retido numa superfcie plana por meio da fase mvel, que neste caso pode ser um lquido ou uma mistura deles. Esta uma tcnica de adsoro slido-lquido, onde a separao dos componentes da mistura acontece pela diferena de afinidade dos mesmos pela fase estacionria. Os principais fenmenos que governam a CCD so a adsoro e a absoro ou partio, a adsoro acontece com fase estacionria slida, neste caso a slica gel e a alumina. Outros adsorventes como celulose, a poliamida e a diatomcea tambm so utilizados nesta tcnica. Na cromatografia em camada delgada uma camada fina de adsorvente espalhada em uma placa de vidro, aps seca e ativada, uma pequena amostra de mistura aplicada na extremidade desta cromatoplaca com auxlio de um capilar, depois a placa e colocada na posio vertical dentro de um recipiente, devidamente tampado, com uma quantidade de eluente. O eluente ir ascender pela cromatoplaca, durante este processo os componentes da mistura sero separados. As substncias mais polares iro avanar pela placa mais lentamente que as menos polares, cada uma delas ter um comportamento segundo as suas caractersticas como solubilidade e poder de adsoro. A cromatografia em camada delgada uma tcnica de fcil execuo e compreenso e de baixo custo, por isso amplamente utilizada em reaes orgnicas e purificao de compostos.

A cromatografia em coluna um mtodo utilizado para isolamento, purificao e separao de compostos orgnicos, quando a fase estacionria utilizada um lquido a separao cromatogrfica acontece por partio, quando a fase estacionria um slido a separao acontece por adsoro, de uma forma ou de outra, a cromatografia em coluna se baseia na diferena das polaridades dos componentes da mistura. Durante o procedimento utilizada uma coluna com uma substncia polar (fase estacionria), empacotada com um solvente orgnico, o adsorvente pode ser colocado na coluna seco ou suspendido em um solvente adequado. Os adsorventes normalmente utilizados so a slica gel, a alumina, o carbonato de clcio, o xido de magnsio, entre outros. Os principais eluentes so: teres de petrleo, ter etlico, clorofrmio, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, gua destilada ou misturas dos eluentes.

FLUXOGRAMA Parte I Obteno do extrato orgnico de folhas verdes: Folhas verdes: 30g
Apresentar uma colorao verde escura.

Triturar em um almofariz Diclorometano Transferir o lquido para um bquer de 100 mL Levar capela

Separao por cromatografia em camada delgada.

a) Preparo das placas cromatogrficas: 06 placas de vidro desengorduradas

Gel de slica 60 G: 3g gua destilada: 10 mL

Espalhar a suspenso sobre a placa de vidro Repousar as placas e deixar secar ao ar b) Seleo da fase 03 solventes puros para ser usados como fase mvel c) Preparo da cuba cromatogrfica Fase mvel: 20 mL

Bquer de 250 mL contendo papel filtro Tampar com placa de filtro

Altura no pode ultrapassar 1,5 cm.

d) Aplicao da amostra na placa e desenvolvimento do cromatograma Estufa a 110C

Ativar as placas cromatogrficas por 30 min.

1,5 cm borda inferior 0,5 cm borda superior

Marcar as placas, ainda quentes, nas bordas laterais Tubo capilar

01 gota de soluo de extrato orgnico

Na parte inferior e central da placa

Introduzir a placa dentro da cuba cromatogrfica Tampar a cuba Esperar a fase mvel atingir a marca de chegada Medir (em cm) as distncias percorridas pela fase mvel e por cada banda observada. Guardar o extrato orgnico em local apropriado Parte II Pesar o extrato orgnico

a) Empacotamento da coluna cromatogrfica Fixar a coluna verticalmente Gel de slica 60G: 9g Hexano

Agitar com basto de vidro Hexano

Torneira fechada At completar do volume

Coluna Suspenso de slica Com auxlio do funil de vidro

Torneira aberta

No deixar a coluna secar

Passar vrias vezes hexano na coluna Fechar a torneira aps o empacotamento

b) Aplicao do extrato na coluna cromatogrfica Extrato lquido Abrir a torneira da coluna at o nvel se aproximar da superfcie da slica Pipeta Pasteur
A soluo no deve tocar nas paredes da coluna No deixar a coluna secar

Transferir a soluo concentrada do extrato para o topo da coluna Abrir lentamente a torneira at a soluo do extrato ser totalmente adsorvida na slica

Torneira fechada

Colocar sobre o extrato uma camada de slica

c) Eluio do extrato na coluna cromatogrfica

08 frascos coletores rotulados

Torneira fechada Fase mvel selecionada na parte I Sobre a camada de slica

Abrir a torneira e no deixar a coluna secar

Iniciar a eluio das bandas Recolher o volume morto no primeiro frasco coletor Trocar de frasco quando a primeira banda atingir a placa de vidro sinterizado

At coletar a primeira banda no segundo frasco

Manter a fase mvel A segunda fase mvel escolhida Recolher as bandas seguintes, trocando o frasco e a fase mvel quando necessrio Mudar a fase mvel para a lavagem da coluna
At recolher a banda verde

Observar a colorao de cada frao cromatogrfica obtida Evaporar o solvente na capela

MATERIAIS E REAGENTES Equipamentos: Balana analtica; Bquer; Almofariz; Pistilo; Proveta; Pipeta Pasteur; Placas de vidro; Papel de filtro; Placa de Petri; Estufa; Tubo capilar; Pina metlica. Coluna cromatogrfica; Suporte universal; Basto de vidro; Funil de vidro; Erlenmeyer; Esptula; Frascos coletores.

Reagentes: Folhas de coentro; Diclorometano;

Slica 60 G; gua destilada; Acetona; Hexano.

Toxidade Reagentes Diclorometano Slica 60 G gua destilada Acetona Hexano Toxidez Ligeira irritao aos olhos, irritao a pele. Tem potencial cancergeno. Irritante aos pulmes, evitar inalar seu p muito fino. No possui irritante aos olhos. txica ao sangue, pulmes, rins e fgado. Irritante a pele e aos olhos. Pode causar dor de cabea, nuseas, tonteiras, perturbaes visuais e auditivas, quando exposto por muito tempo.

Tabela 01: toxidez dos reagentes utilizados.

PROPRIEDADES FSICAS Peso molecular (g/mol) Densidade (g.cm3) a 20C

Componente

Frmula qumica

Aparncia

Solubilidade Em gua 20 g/l (20C) e imiscvel em solventes orgnicos Totalmente solvel Miscvel em gua, etanol e ter etlico, clorofrmio e essncias Solvel em etanol e clorofrmio

P.F. (C)

P.E. (C)

Diclorometano

Cl2CH2

86, 95

Lquido incolor Slido branco Lquido incolor Lquido incolor Lquido incolor

1, 36

-97

39

Slica 60 G gua destilada

SiO2 H2O

60, 09 18, 01

1, 00 0,7700 0,8511

100

Acetona

C3H6O

58, 08

----

56,2

Hexano

C6H14

86, 18

0, 66

----

69

Tabela 02: propriedades fsicas.

DISCUSSO O extrato de coentro composto por grupos, carotenos e clorofilas, o mtodo de separao de compostos como este a cromatografia. No procedimento experimental, foram utilizadas as tcnicas de cromatografia em camada delgada, com o objetivo de identificar e determinar os componentes da mistura e determinar o solvente adequado para a cromatografia em coluna, que foi realizada posteriormente para obteno destes compostos. A slica gel 60 G, uma substncia polar, geralmente o adsorvente comercial mais utilizado. No caso de fases estacionrias polares, como o caso da slica, o solvente a ser utilizado como fase mvel deve ser de mdia ou baixa polaridade. Foram feitas trs cubas cromatogrficas para a CCD, com a seguinte ordem de eluentes: hexano, hexano acetona 8:2 e hexano ter 8:2. A escolha foi feita tendo-se em vista as diferentes polaridades dos eluentes. Aps as eluies os seguintes resultados foram obtidos: Placa 1 : hexano puro Na placa com hexano puro a eluio deu-se apenas no grupo dos carotenos, como o hexano uma substncia apolar, este tem afinidade com substncias tambm apolares, como o caso dos carotenos. Enquanto que as clorofilas como so polares no tiveram afinidade com a fase mvel, consequentemente no foram eluidas. Placa 2 : Hexano: Acetona (8:2) Esta placa apresentou maior resoluo, obtendo seis bandas cromatogrficas, com as cores amarelo, laranja, cinza, verde azulado, verde e verde claro, respectivamente. Este fato pode ser explicado pela afinidade entre as fases estacionria e mvel, pela polaridade do solvente. O grupo dos carotenos eluiram primeiro seguidos das clorofilas A e B, e aps estas a xantofila. Neste caso os componentes apolares eluiram primeiro, devido a maior concentrao de hexano no solvente, os compostos mais polares por possurem afinidade coma fase estacionria tambm polar, ficaram retidos e eluiram posteriormente. Placa 3: Hexano: ter etlico (8:2) A resoluo desta placa no se apresentou boa, eluindo apenas o grupo dos carotenos. Em comparao ao hexano puro, houve uma melhor eluio, porm o resultado no foi satisfatrio, eluindo apenas duas bandas, uma amarela clara e uma laranja, que representam o grupo dos carotenos.

Solvente Hexano Hexano ter etlico Hexano acetona

n0 de bandas cromatogrficas 1 2 3

Colorao das bandas cromatogrficas Amarelo Amarelo e laranja Amarelo, laranja, cinza, verde azulado, verde e verde claro

Tabela 03: resultado da cromatografia em camada delgada.

Rf - de um composto. definido como a razo entre a distncia percorrida pelo composto (dc) e a distncia percorrida pelo eluente (de).

fator de reteno pode ser alterado atravs de mudanas nas fases estacionria e/ou mvel; mudanas na temperatura, no volume ou na concentrao da substncia aplicada. Solvente Bandas cromatogrficas 1-Amarelo 2-Laranja 3-Cinza 4-Verde azulado 5-Verde 6-Verde claro 1-Amarelo 2-Laranja 1-Amarelo dc (cm) 0, 5 0, 6 0, 7 0, 4 1, 5 1, 2 0, 7 4, 2 1, 5 de (cm) Rf (dc/de) 0, 09 0, 11 0, 12 0, 07 0, 27 0, 22 0, 13 0, 78 1

Hexano: acetona

5, 5

Hexano: ter etlico Hexano

5, 4 1, 5

Tabela 04: Fator de reteno da cromatografia em camada delgada

Na cromatografia em coluna, o eluente utilizado inicialmente foi o hexano, e posteriormente, foi utilizada uma mistura de hexano- acetona em diferentes propores. Utilizando como eluente o hexano, assim como na cromatografia em camada delgada, a primeira banda a ser eluida foi a amarela, que corresponde ao grupo dos carotenos. Este fato j era esperado, j que como o solvente utilizado era de baixa polaridade, a primeira banda a ser eluida seria a que houvesse maior afinidade com a fase mvel, ou seja, a que, neste caso, possua o componente apolar. (Figura 1). A frao amarela foi recolhida em um frasco, que correspondeu a frao 1 e a frao 2, amarelo claro, foi recolhida num outro frasco. (Figura 2)

A medida que as fraes foram recolhidas, a polaridade do solvente ia sendo aumentada, para que as prximas fraes, mais polares, pudessem ser eluidas. O eluente agora utilizado foi uma mistura de hexano- acetona 9:1,e a frao a ser recolhida foi a cinza, que correspondeu a frao 2 .Em seguida o eluente utilizado foi uma mistura de hexano- acetona 8:2, com este eluente foram recolhidas as fraes verde escuro(frao 3), amarelo esverdeado (frao 4) e verde claro (frao 5), respectivamente, que corresponde ao grupo das clorofilas. Esta ordem de eluio j era esperada, devido aos resultados obtidos na CCD, e pode ser explicada levando-se em conta a afinidade ente as fases mvel e estacionria a polaridade do solvente utilizado. (Figura 3) Durante a realizao do procedimento, devido a baixa temperatura no laboratrio, a coluna apresentou algumas bolhas de ar, j que ela estava localizada prxima ao ar condicionado. Esta irregularidade pode causar problemas durante a separao dos componentes, o que torna o resultado no satisfatrio. Para solucion-lo, foi colocado um curativo na coluna, com algodo umedecido com solvente (diclorometano). O solvente voltil rouba calor da coluna, o que faz com que as bolhas sejam desfeitas. (Figura 4) Outro problema foi verificado durante o experimento, a coluna estava vazando, sendo assim, algumas partes da fase estacionria (slica gel) estava passando juntamente com as fraes que estavam sendo recolhidas, o que comprometeu o rendimento do procedimento experimental. Portanto no h como realizar uma anlise quantitativa do mesmo, j que as massas estaro com valores incorretos, logo, o rendimento possuir tambm resultado incorreto.

CROMATOGRAMAS Placa I Fase estacionria: Slica gel 60G Fase mvel: hexano puro

Placa II Fase estacionria: Slica gel 60G Fase mvel: Mistura hexano e acetona (8:2)

Placa III Fase estacionria: Slica gel 60G Fase mvel: Mistura hexano e ter (8:2)

CONCLUSO Este experimento proporcionou aos alunos uma vivncia da prtica de cromatografia, mostrando como simples a separao de compostos complexos novolteis e com ponto de ebulio no definido. A partir da cromatografia em camada delgada possvel identificar os componentes existentes no composto e o melhor solvente a ser utilizado para a eluio deste atravs da cromatografia em coluna.

QUESTIONRIO 1) Por que as folhas foram modas? As folhas foram muitas para que se aumentasse a superfcie de contato para que o solvente pudesse agir de uma forma melhor e ento extrair a maior quantidade possvel de extrato orgnico. 2) Aps a preparao do extrato das folhas observa-se a presena de duas fases. Explicar. As duas fases visualizadas aps a macerao das folhas de coentro so a fase orgnica, extrada pelo solvente, e fase aquosa originada da umidade natural das folhas da planta. 3) Qual a finalidade do uso da CCD neste experimento? A CCD tem como finalidade separao dos componentes da do extrato (caroteno e clorofila), alm de determinar o solvente apropriado para uma separao por cromatografia em coluna e verificar a eficincia de uma separao. 4) Qual a finalidade do papel de filtro dentro da cuba cromatogrfica? Explicar. O papel de filtro tem a funo de saturar o ambiente, ele fica umedecido com a fase mvel e promove a saturao da atmosfera da cmara com a fase mvel na forma de vapor. 5) O que Rf? Calcular os valores de Rf para as bandas. Explicar as diferenas encontradas. Rf o fator de reteno o qual a razo entre a distncia percorrida pela substncia em questo e a distncia percorrida pela fase mvel. Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano, 1 banda

Rf= 1,5cm/1,5cm = 1 Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano: acetona 8:2, 2 bandas

Rf1= 4,2cm/5,4cm = 0,78 Rf2= 0,7cm/5,4cm = 0,13 Solvente utilizado e bandas cromatogrficas: hexano:ter etlico 8:2, 6 bandas

6) Analisar os cromatogramas obtidos por CCD e classificar as fases mveis testadas quanto ao poder de resoluo e quanto ao poder de eluio. Indicar a melhor e a pior fase mvel para a separao dos pigmentos. Discutido durante a discusso dos resultados. 7) Considerando as estruturas qumicas dos grupos de compostos separados, as polaridades da fase estacionria e fase mvel, comparar e explicar os cromatogramas obtidos na parte I do experimento. Discutido durante a discusso dos resultados. 8) Se os componentes no fossem coloridos, como as bandas na CCD poderiam ser identificadas? Citar e explicar 2 mtodos. As bandas na CCD podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, fluorescncias e radioatividade. Mas os mtodos mais comuns para visualizao das bandas so os vapores de iodo e a luz UV, no primeiro mtodo, os vapores de iodo reagem com muitos compostos orgnicos formando complexos de cor marrom ou amarela. E sob a luz UV os compostos geralmente aparecem como manchas brilhantes de prata. 9) Por que a coluna foi empacotada com hexano? Este procedimento poderia ser realizado com a fase mvel selecionada na parte I do experimento? Qual a conseqncia disso? O hexano foi utilizado para o empacotamento da coluna para no comprometer o resultado, por se tratar de uma substncia apolar. Se fosse utilizado uma fase mvel selecionada na parte I do experimento poderia comprometer o resultado, pois elas possuem uma maior polaridade e poderiam se dissolver no solvente utilizado. 10) Por que a coluna no deve possuir bolhas e no deve secar? Se houver bolhas de ar dentro da coluna ou se o adsorvente secar a separao dos componentes da mistura ser dificultada, pois estes fatores causam a inclinao das bandas , separando parcialmente e no totalmente as substncias. As bolhas de ar so causadas pela baixa temperatura no ambiente, caso haja estas bolhas deve ser feito um

curativo na coluna, envolvendo-a com algodo umedecido com um solvente voltil, a fim de evitar estas irregularidades, o solvente retira calor da superfcie da coluna, desfazendo assim as bolhas. 11) Qual grupo de compostos eluiu primeiro na coluna? Qual grupo de compostos ficou mais retido? Explicar. O composto que eluiu primeiro na coluna foi as xantofilas, do grupo dos carotenos, e a que ficou mais retida foi o grupo da clorofila, isso por que os carotenos so mais apolares, e como a fase mvel utilizada inicialmente foi o hexano essas substncias tiveram maior afinidade eluindo primeiro, como as substncias do grupo das clorofilas possuem uma maior polaridades, elas tiveram afinidade com a fase estacionria ficando retidas, sendo eluidas conforme foi mudando a fase mvel, tornando-a mais polar, e assim, a afinidades dessas substncias com a fase mvel foi aumentando. 12) Comparar o comportamento observado das bandas na CC com o observado na CCD. Na cromatografia em coluna, o caroteno eluiu primeiro, pois este teve uma maior afinidade com a fase mvel. Na cromatografia em camada delgada os carotenos tambm eluiram primeiro devido a maior afinidade do mesmo com a fase mvel, visualizou-se na parte superior da placa as bandas amarelas que correspondem a este composto. Na cromatografia em coluna em seguida, eluram as bandas cinza e verde respectivamente, devido afinidade dos mesmos com a fase mvel e com a estacionria. Visualizamos ento que tanto na CC como na CCD as bandas eluram na mesma ordem, os carotenos (banda amarela) primeiro seguidos das clorofilas (bandas cinza e verde). 13) O que so eluio isocrtica e eluio por gradiente de polaridade? Que tipo de eluio foi realizado neste experimento? Por qu Eluio isocrtica a eluio realizada com a composio da fase mvel constante, ou seja, eluio com um nico solvente ou com uma mistura de solvente de composio constante. Eluio por gradiente de polaridade aquele em que a polaridade da fase mvel alterada com o tempo. Durante o experimento utilizou-se a eluio isocrtica, pois a polaridade da fase mvel utilizada, mesmo a da mistura, no se alterou durante o experimento.

14) Qual o mecanismo de separao dos dois grupos de compostos neste experimento? Explicar O mecanismo de separao foi pela interao entre as fases estacionria e mvel com os componentes da mistura, chamado de adsoro, que um processo de separao slidolquido baseado nas foras de atrao eletrostticas das substncias, o processo ocorre na interface entre o slido e a fase mvel, devido presena de grupos ativos na sua superfcie do mesmo. . 15) Em uma tabela, indicar as fraes obtidas, aspecto fsico, massa, fase mvel e rendimento percentual da separao. Quanto foi perdido do extrato na coluna cromatogrfica?

16) Explicar como as fraes cromatogrficas obtidas na separao por CC poderiam ser analisadas por CCD quanto pureza e quanto natureza qumica. As fraes obtidas por cromatografia em coluna poderiam ser analisadas por CCD utilizando placas com uma fase estacionria, as cubas cromatogrficas e uma fase mvel e para cada fase fazer o teste com uma placa e uma cuba cromatogrfica. Seria feita uma comparao com as fases e a polaridade da fase mvel com a fase estacionria. Caso houvesse mais de uma banda, observar-se-ia que esta no estava pura, e seriam feitas vrias anlises para cada fase, obtendo uma anlise em relao a natureza qumica e a pureza das fraes obtidas por cromatografia em coluna.