Ingenier a y Ciencia, ISSN 17949165 Volumen 3, n umero 6, diciembre de 2007, p aginas 4162

Aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango com un (Mangifera indica L.) en la obtenci on de az ucares fermentables
Usage of the common mango agroindustrial waste (mangifera indica L.) in the destraction of fermentables sugars L. F. Mej a Giraldo1 , H. A. Mart nez Correa2 , 3 J. E. Betancourt Guti errez y C. E. Castrill on Casta no4
Recepci on: 14-feb-2007 /Modicaci on: 16-jul-2007 /Aceptaci on: 25-jul-2007 Se aceptan comentarios y/o discusiones al art culo

Resumen
El residuo del mango com un (Mangifera indica L.) es un material vegetal que contiene gran cantidad de tejido lignocelul osico, el cual puede ser aprovechado para la obtenci on de metabolitos fermentables y productos de la fermentaci on. En este trabajo se aplicaron tratamientos de hidr olisis al residuo del mango com un con el n de hacer la conversi on de sus polisac aridos a unidades de az ucares fermentables. Se aplic o hidr olisis acida a tres concentraciones diferentes de acido sulf urico diluido. Tambi en, se aplic o hidr olisis enzim atica con Especialista Ciencia y Tecnolog a de Alimentos, lfmejia@usb.edu.co, profesor, Universidad de San Buenventura, Santiago de CaliColombia. 2 MSc Ingenier a Qu mica, hamarinez@palmira.unal.edu.co, profesor, Universidad Nacional de Colombia, PalmiraColombia. 3 Ingeniero agroindustrial, jbetancourtgu@palmira.unal.edu.co, egresado, Univesidad Nacional de Colombia, PalmiraColombia. 4 Ingeniero Agroindustrial, cecastrillonc@palmira.unal.edu.co, egresado, Univesidad Nacional de Colombia, PalmiraColombia. Universidad EAFIT
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Aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango com un (Mangifera indica L.) en la obtenci on de az ucares fermentables dos tipos de enzimas comerciales a diferentes concentraciones en las condiciones de trabajo est andar. De igual manera se aplic o hidr olisis t ermica a dos temperaturas diferentes. A cada tratamiento aplicado se le efectuaron pruebas de concentraci on de az ucares totales, concentraci on de az ucares reductores, porcentaje de celulosa y hemicelulosa residual, datos con los cuales se determinaron los mejores tratamientos y se procedi o a efectuar combinaciones de los mejores tratamientos de hidr olisis. El tratamiento m as signicativo de las pruebas individuales fue el de hidr olisis acida a 0,50 % v/v de acido sulf urico a 80 C por una hora. En los tratamientos combinados el resultado m as signicativo fue el tratamiento en el que se combinaron la hidr olisis enzim atica (como pretratamiento) m as una hidr olisis t ermica e hidr olisis acida. Por razones de seguridad en el uso de reactivos, as como eliminaci on de efectos colaterales adversos para la fermentaci on alcoh olica posterior, se seleccion o el procedimiento que involucra la hidr olisis t ermica como pretratamiento y la hidr olisis enzim atica como tratamiento principal, como el tratamiento de mejor aplicaci on en la producci on de metabolitos fermentables a partir de residuos de mango com un con nalidad producci on de alcohol posteriormente. Estudios posteriores han permitido abordar la hidr olisis por v a microbiana con Aspergillus niger y Trichoderma viride, as como la fermentaci on alcoh olica postratamiento hidrol tico usando los estudios previos. La hidr olisis y fermentaci on alcoh olica simult aneas, y m as recientemente y en ejecuci on la simultaneidad de los procesos adicionando una levadura recombinante que tiene capacidad de fermentar az ucares de cinco carbonos. Palabras claves: residuo de mango com un o mango hilacha, az ucares, celulosa, hemicelulosa, lignina, pectina, hidr olisis acida, hidr olisis enzim atica, hidr olisis t ermica, fermentaci on alcoh olica.

Abstract
The common mango waste (Mangifera indica L.) is a vegetable material containing a high level of lignocelluloses tissue which can be used to obtain fermentable metabolites and fermentation products. In this study hydrolysis treatments were applied to the common mango in order to make the conversion of its polysaccharides to fermentable sugar units. Acid hydrolysis was applied to three dierent concentrations of dilute sulphuric acid. An enzymatic hydrolysis with two types of commercial enzymes to dierent concentrations in standard work conditions, was also applied. In addition, a thermic hydrolysis was applied at two dierent temperatures. At each treatment, the following tests were applied: total sugar concentration, reduced sugar concentration, and percentage of cellulose and hemicellulose residuals. Based on the data obtained from the tests, the best treatments were identied and so the best combinations of the best hydrolysis treatments were carried out. The most signicant treatment for individual tests was acid hydrolysis at 0, 50% v/v sulphuric acid at 80 C for one hour. In the combined treatments the most

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relevant result was the treatment that combined the enzymatic hydrolysis (as pretreatment) plus a thermic hydrolysis and acid hydrolysis. For security reasons in the reagents use, as well as in the elimination of collateral adverse eects for further alcoholic fermentation, a procedure involving thermic hydrolysis as pretreatment and enzymatic hydrolysis, was chosen as the main treatment with the most appropriate application in the fermentable metabolites production from common mango waste in order to produce alcohol. Further studies have allowed approaching the hydrolysis via microbial with Aspergillus niger and Trichoderma viride, as well as the alcoholic fermentation post-treatment hydrolytic using previous studies. The simultaneous hydrolysis and alcoholic fermentation, and recently performing the simultaneity of the processes, adding a recombining yeast that has the capacity to ferment sugars from ve carbons. Key words: mangos waste, sugars, cellulose, hemicellulose, acid hydrolysis, enzimatic hydrolysis, thermic hydrolysis, alcoholic fermentation.

Introducci on

El estudio presentado es un pre ambulo del proyecto Aprovechamiento de los residuos agroindustriales en la producci on de metabolitos de alto valor agregado, el cual puede ser un gran elemento de partida para la mejor utilizaci on de los recursos y la disminuci on de la contaminaci on ambiental generada por la industria colombiana, y en particular por la agroindustria de pulpas y jugos. Los resultados mencionados corresponden al estudio continuo que se inici o en el a no 2002 y que contin ua en desarrollo, present andose los avances logrados hasta el 2005. La utilizaci on de materiales lignocelul osicos viene siendo investigada intensamente, debido a que estos representan el mayor componente de los residuos agr colas y desechos agroindustriales en el mundo, y constituyen una fuente abundante y segura de recursos renovables y energ a. Sin embargo, actualmente en Colombia estos residuos est an siendo subutilizados en la mayor a de los casos causando serios problemas de contaminaci on ambiental por la deciencia en disposici on nal, a pesar de que son potencialmente buenos para ser utilizados como materia prima en la producci on de az ucares, alimento para animales, biomasa microbiana, producci on de acidos org anicos y alcoholes, entre otros.
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En el departamento del Valle del Cauca se procesan aproximadamente 351,5 toneladas/semana de mango com un por parte de la agroindustria de pulpas y jugos, generando un problema serio de contaminaci on ambiental con los residuos obtenidos. Solamente en el despulpado de mango se generan cerca de 50 55 % de residuos, es decir, aproximadamente 193,32 toneladas/semana, representados en c ascara, semillas, restos de pulpa y bra [1]; este rubro ha aumentado en un 30 %, valores revisados a septiembre de 2006. Este proyecto genera las condiciones adecuadas para el aprovechamiento de residuos en la producci on de residuos fermentables con el n de producir insumos con mayor valor agregado como es el caso del etanol. La obtenci on de combustibles l quidos a partir de biomasa agr cola ha despertado gran inter es en los u ltimos a nos. La necesidad de encontrar carburantes para motores de explosi on que no dependan del petr oleo es evidente, adem as de ser una alternativa importante para disminuir la contaminaci on ambiental. La utilizaci on de diversos residuos agr colas es una propuesta lo sucientemente importante para producir biocombustibles y as reducir la dependencia exclusiva en este sentido de la ca na de az ucar, generando con ello valor agregado, permitiendo el desarrollo social de las comunidades comprometidas con el uso racional de materias primas y los residuos. Estos residuos son materiales constituidos en su mayor parte por tejidos lignocelul osicos, los cuales se deben someter previamente a diferentes tipos de tratamientos hidrol ticos para poder aprovecharlos favorablemente en la producci on de compuestos susceptibles de fermentaci on (glucosa, fructosa, manosa, xilosa, entre otros) elementos esenciales para la producci on de diferentes compuestos de alto valor agregado.

Metodolog a

El material utilizado en la realizaci on del trabajo fue el residuo del mango com un (Mangifera indica L.) proveniente de la industria despulpadora de frutas, que comprende la c ascara o pericarpio y residuos de bra y pulpa. La materia prima se someti o a secado con el n de remover el agua para conservaci on del material y aplicar tratamientos de hidr olisis sobre el material rehidratado. El secado del material se prolong o hasta extraer aproximada-

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mente el 70 % de la humedad. El proceso de secado se realiz o en un secador de bandejas con aire caliente a una temperatura de 45 C. A la materia prima seca, se le realizaron pruebas como: az ucares totales (M etodo de Antrona), az ucares reductores (M etodo DNS), contenido de bra, con el n de obtener datos iniciales (testigo) para comparar con los datos que se obtuvieron del proceso hidrol tico, adem as de un an alisis proximal para caracterizar el residuo de mango. El material seco fue molido en molino de discos y tamizado para obtener un tama no de part cula a trav es de tamiz N. 60, el cual diluye sin problemas en el agua y facilita la hidr olisis por la ampliaci on del area de contacto [2]. Para determinar la proporci on de hidrataci on del material seco para tratamientos de hidr olisis, se realizaron ensayos con soluciones de 2,5; 5; 10 y 20 % p/v de materia seca, se decidi o que la mejor condici on de la muestra para la hidr olisis es la soluci on al 2,5 % p/v, con la cual se trabajaron las pruebas experimentales del proyecto.

2.1

An alisis Proximal

En el an alisis proximal se determinaron los porcentajes de prote na bruta, cenizas totales, grasa bruta, extracto libre de nitr ogeno (carbohidratos) y agua. Determinaci on del contenido en materia seca (AOAC 1990. 934,01) [3] Determinaci on del contenido de cenizas (AOAC 1990. 942,05) [3] Determinaci on del contenido en grasa (m etodo soxhlet, AOAC 1990. 920,39) [3] Determinaci on del contenido en prote na bruta (m etodo de Kjeldahl) Determinaci on del contenido de bra (m etodo Ankom)
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Determinaci on de az ucares totales (m etodo de antrona - Dubois, 1956) [4]. Fundamento: la reacci on de antrona constituye la base de un m etodo conveniente para la determinaci on de hexosas, aldopentosas y acidos hexour onicos, bien sea que est en libres o formando parte de los polisac aridos. La soluci on azulverdosa muestra la absorci on m axima a 625 nm. La lectura se realiz o en un espectrofot ometro de tipo UV1603 SHIMADZU. Determinaci on de az ucares reductores (m etodo DNS - Miller, 1959) [5]. Fundamento: el acido 3,5 dinitrosalic lico en presencia de calor reduce el acido 3amino5 nitrosalic lico por los az ucares reductores presentes, desarroll andose un color amarillo caf e el cual es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 575 nm. Este m etodo permite medir las unidades reductoras presentes en los az ucares. La lectura se realiz o en un espectrofot ometro de tipo UV1603 SHIMADZU. 2.1.1 Hidr olisis acida. La hidr olisis acida se llev o a cabo con acido sulf urico diluido, adicionado a la soluci on 2,5 % p/v de materia prima a temperatura de 80 C y por un tiempo de una hora. En el proceso de hidr olisis acida se realizaron pruebas preliminares, debido a que se ten an diferentes concentraciones de acido (0,25; 0,50; 0,75; 1; 2; 3; 4 y 5 %), y se determinaron las tres concentraciones m as ecientes en la hidr olisis, en cuanto a producci on de az ucares reductores se reere. 2.1.2 Hidr olisis enzim atica. La hidr olisis enzim atica se efectu o con dos tipos de enzimas comerciales: Celluclast 1,5 L y Pectinex ultra SPL (Novo Nordisk Ferment). La primera enzima es una celulasa que act ua sobre la celulosa y la hidroliza, y la segunda es una pectinasacelulasa que desdobla los complejos de pectina y celulosa. Las concentraciones de las enzimas (Celluclast y Pectinex ultra SPL) se determinaron con base en las especicaciones y par ametros de la cha t ecnica de cada enzima comercial las cuales contienen informaci on acerca de la actividad, rangos de temperatura y pH, concentraci on y tiempo, en la cual la enzima presenta condiciones optimas de actividad en un sustrato determinado. En el caso de Pectinex Ultra SPL, la enzima no ten a un rango de concentraci on para la utilizaci on denido, raz on por la cual se decidi o hacer pruebas con concentraciones tales como: 200, 400 y 600

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ppm; con base en experiencias previas de hidr olisis en maceraci on de jugos de frutas pulposas [6]. Para la enzima comercial Celluclast 1,5 L, se ten a un rango espec co de 400 a 1000 ppm de concentraci on, seg un la cha t ecnica. Por tal raz on, se realizaron pruebas a concentraciones diferentes de enzima: 400, 600 y 800 ppm en la soluci on de mango com un.

2.1.3 Hidr olisis t ermica. Se efectuaron con autoclavado (mezcla l quido vapor) y a temperatura de ebullici on a presi on atmosf erica durante una hora. Este procedimiento se efectu o teniendo en cuenta dos temperaturas de prueba (T1 = 98 C, presi on atmosf erica y T2 = 125 C, 1,4 bar). Despu es de cada tratamiento se efectuaron pruebas de concentraci on de az ucares reductores, concentraci on de az ucares totales y determinaci on de bra (celulosa y hemicelulosa) en porcentaje. Cada experimento se realiz o por triplicado, los datos obtenidos en el dise no experimental se les aplic o un an alisis de varianza (GLMANOVA) a trav es del programa SAS, adicionalmente se realiz o una prueba de signicancia posterior al an alisis de varianza denominada Prueba de DUNCAN con el n de vericar las diferencias de los tratamientos aplicados al material. En el an alisis de varianza, para deducir la incidencia de un tratamiento en las variables de respuesta el factor P r > F debe ser menor de 0,05, este valor indica la signicancia de los datos. En la prueba de signicancia para medias de DUNCAN la categorizaci on de los tratamientos deben poseer letras distintas para demostrar las diferencias signicativas entre tratamientos, o letras iguales para indicar la similitud de los datos de un tratamiento a otro.

Resultados

Caracterizaci on del residuo de mango com un (Mangifera indica L.) El an alisis proximal se presenta en la tabla 1. Se puede apreciar que el contenido de carbohidratos es alto, lo cual lo hace un material de excelentes condiciones para la obtenci on de metabolitos fermentables, en la medida que estos est an constituidos principalmente por celulosa.

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Tabla 1: caracterizaci on del residuo de mango com un (Mangifera indica L.) Composici on Materia Seca Humedad Prote na Extracto Et ereo Cenizas Carbohidratos Celulosa Hemicelulosa pH Porcentaje ( %) 31,45 68,55 7,03 5,5 3,48 15,44 14,21 4,88 4,2

3.1

Pruebas preliminares

3.1.1 Pruebas preliminares para hidr olisis acida. En la gura 1 se puede observar que las tres concentraciones en las cuales se obtiene mayor cantidad de az ucares reductores son a 0,25; 0,50 y 0,75 %, raz on por la cual se eligieron para practicar el tratamiento de hidr olisis acida y compararlos con los resultados de los dem as tratamientos.
0,5000 0,4500 0,4000 0,3500 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000
H 25 0, A_ H 50 0, A_ H 75 0, _ A H 1 A_ H 2 A_ H 3 A_ H 4 A_ H 5 A_

mg AR/mg material seco

Concentracion de acido (%)

Figura 1: concentraci on de az ucares reductores vs. concentraci on de acido sulf urico

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3.1.2 Pruebas preliminares para hidr olisis enzim atica. La concentraci on de enzima de mayor rendimiento en producci on de az ucares reductores (gura 2) es 600 ppm, pero con respecto a la concentraci on de 200 ppm y 400 ppm, no se presenta una alta diferencia. Esta cercan a en el valor de los datos de az ucares reductores, y el alto costo de las enzimas son razones sucientes para decidirse por la concentraci on de 200 ppm, ya que la producci on de az ucares reductores es muy similar en los tres tratamientos. El mayor contenido de az ucares reductores se obtiene con 800 ppm de la enzima, pero las otras dos concentraciones de enzima tienen producci on similar de az ucares reductores, por lo cual no existen diferencias marcadas entre los tres tratamientos. Por esta raz on y debido al alto costo del tratamiento con enzimas, se decidi o utilizar la menor concentraci on de enzima, es decir, 400 ppm para la comparaci on con otros tratamientos (gura 3).
0,3720 0,3700 0,3680 0,3660 0,3640 0,3620 0,3600 0,3580 200 400 600

mg AR/mg material seco

Concentracion de enzima (ppm)

Figura 2: concentraci on de az ucares reductores versus Concentraci on de enzima Pectinex Ultra SPL

3.1.3 Pruebas preliminares para hidr olisis t ermica. No se practicaron pruebas preliminares al m etodo de hidr olisis t ermica y se realizaron las pruebas denitivas con las variables propuestas inicialmente (T1 = 98 C y T2 = 125 C).
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mg AR/mg material seco

0,2920 0,2900 0,2880 0,2860 0,2840 0,2820 0,2800 400 600 800

Concentracion de enzima (ppm)

Figura 3: concentraci on de az ucares reductores versus Concentraci on de enzima Celluclast 1,5 L

3.2

An alisis estad stico

Respecto a los datos obtenidos experimentalmente para las variables de respuesta (az ucares reductores, az ucares totales, % celulosa y % hemicelulosa), tabla 2, se presenta un nivel de conabilidad por encima del 99 %, es decir, son altamente signicativos con respecto a cada tratamiento practicado. Se escogieron los mejores tratamientos preliminares en cada caso para su an alisis. Los datos de valor medio (media estad stica) con la misma letra no presentan diferencias signicativas.
Tabla 2: an alisis Duncan para hidr olisis acida, enzim atica y t ermica
Tratamiento Sin tratamiento H2 SO4 0, 25 % H2 SO4 0, 50 % H2 SO4 0, 75 % Pectinex 200 ppm Celluclast 400 ppm 98 C 125 C Valor medio Valor medio Valor medio Valor medio (mg Az. Re- (mg Az. % de % de Hemiductores/mg totales/mg Celulosa celulosa materia seca) materia seca) 0,23347 0,34850 0,46053 0,29890 0,37743 0,28853 0,31120 0,31913 E B, C A D B D D C, D 0,67367 0,44577 0,51127 0,49590 0,41653 0,42367 0,51807 0,48260 A C, D B B, C D D B B, C 14,2167 6,3833 3,1733 1,9833 11,1500 10,1767 12,3467 11,1900 A D E E B, C C B B, C 4,8867 4,5300 1,9700 1,8367 3,6533 2,3533 2,0800 2,0233 A A, B C C B C C C

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Entre las variables de respuesta, las de mayor relevancia son los az ucares reductores y la celulosa, ya que son los mejores indicadores de la degradaci on y conversi on de tejido lignocelul osico en az ucares fermentables y cantidad de celulosa residual, guras 4 y 5.
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
o nt ie m ta tra

mg AR, AT/mg ms

A H

0,

25

A H

0,

5 A H

0,

75 2 00

pp

m as cl t4 00

pp

m T H

98

C T H

5 12

in

u el C Concentraciones mg AR mg AT

ex tin c Pe

Figura 4: concentraci on de az ucares en los tratamientos

3.2.1 Hidr olisis acida. En la hidr olisis acida, espec camente a concentraci on de 0,50 %, se presenta la mayor producci on de az ucares reductores, lo cual la hace la de mayor eciencia en cuanto a producci on de metabolitos fermentables se reere. Los az ucares reductores tienden a reducir su concentraci on por encima de la concentraci on de acido sulf urico al 0,50 %, debido a que el acido en mayor concentraci on degrada los az ucares fermentables. Los az ucares totales tienden a reducirse cuando aumenta la concentraci on de acido, formando compuestos diferentes derivados de la degradaci on de azucares del material. Estos compuestos ( acidos org anicos, compuestos arom aticos, entre otros) pueden tener una alta incidencia sobre procesos fermentativos que se lleven a cabo en el material hidrolizado, provocando inhiVolumen 3, n umero 6

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16 14 12 10

8 6 4 2 0
Sln tratamiento HA 0,25 HA 0,50 HA 0,75
o o

T ra t a m ie nt os

Pectinex 200 ppm

Celuclast 400 ppm

HT 98 C

HT 125 C

Celulosa %

Hemicelulosa %

Figura 5: porcentaje de celulosa y hemicelulosa en los tratamientos

bici on e inactividad de los microorganismos [7]. Seg un el an alisis estad stico (GLMANOVA), se presentan diferencias signicativas entre los tres tratamientos de hidr olisis acida, con mayor signicancia para la hidr olisis a 0,50 % de concentraci on de acido sulf urico, tabla 2. El contenido de hemicelulosa en el material desciende a medida que se eleva la concentraci on de acido sulf urico, ya que a mayor concentraci on de acido el tratamiento tiende a ser m as agresivo degradando mayor cantidad de hemicelulosa. De igual manera se representa la din amica de reducci on de contenido de celulosa, la cual alcanza su mayor degradaci on a una concentraci on de 0,75 % de acido sulf urico, pero los az ucares reductores a esta concentraci on son menores. Esta variaci on muestra que el a cido sulf urico a mayor concentraci on degrada mayor cantidad de celulosa y no necesariamente convirti endolos a az ucares, sino que los transforma en otro tipo de compuestos tales como acido ac etico, furfural e hidroximetilfurfural y compuestos arom aticos derivados de la lignina que pueden inhibir un eventual proceso de fermentaci on posterior [8]. Seg un el an alisis estad stico (GLMANOVA), se presentaron diferencias

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signicativas en la reducci on de celulosa y hemicelulosa en los tratamientos con hidr olisis acida a 0,25 y 0,50 %, y no se present o diferencia signicativa entre los tratamientos de 0,50 y 0,75 % en cuanto a reducci on de celulosa y hemicelulosa, tabla 2. 3.2.2 Hidr olisis enzim atica. Desde el punto de vista de la hidr olisis enzim atica, la mayor producci on de az ucares reductores la tuvo la enzima Pectinex Ultra SPL a 200 ppm, debido a la hidr olisis de la pectina presente en el residuo del mango com un, como en todas las dem as frutas. En el proceso de hidr olisis enzim atica, las dos enzimas tuvieron una concentraci on similar de az ucares totales. La conversi on de pectina a acido galactur onicos se reporta como az ucares totales seg un la t ecnica de detecci on utilizada, lo cual no es del todo cierto considerarlos como az ucares fermentables [6]. Seg un el an alisis estad stico (GLMANOVA) se presentaron diferencias signicativas entre los dos tratamientos enzim aticos, en cuanto a az ucares reductores, obteniendo mayor signicanc a el tratamiento con Pectinex Ultra SPL, tabla 2. El porcentaje de degradaci on de celulosa fue menor en el tratamiento con Pectinex, ya que la enzima ataca prioritariamente la pectina y en menor medida la celulosa. La enzima Celluclast 1,5 L, actu o selectivamente sobre la celulosa obteniendo rendimientos superiores a la enzima Pectinex en la hidr olisis de esta mol ecula. La celulosa que se degrad o, en su mayor a, se convirti o en az ucares reductores, ya que la celulosa es una enzima de alta selectividad que garantiza la conversi on o despolimerizaci on de la celulosa y la hemicelulosa, en su mayor a, a unidades fermentables de glucosa [9]. La enzima Celluclast, tuvo mayor selectividad en el momento de actuar sobre la hemicelulosa, ya que esta enzima es espec ca para la degradaci on de celulosa y complejos de celulosa y hemicelulosa [10]. Seg un el an alisis estad stico (GLMANOVA), no se presentaron diferencias signicativas entre los tratamientos enzim aticos, en cuanto a celulosa se reere, pero en cuanto a hemicelulosa, si hubo mayor signicancia en el tratamiento con Celluclast 1,5 L, tabla 2. 3.2.3 Hidr olisis t ermica. El tratamiento t ermico present o una producci on de az ucares reductores a un mayor que el tratamiento con la enzima Celluclast. El tratamiento con alta temperatura (125 C) y presi on (1,4 bar) tuvo el mayor rendimiento en cuanto a az ucares reductores con respecto al trataVolumen 3, n umero 6

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miento a 98 C y presi on atmosf erica. Se aprecia que la reducci on de az ucares totales es menor, lo cual indica que el tratamiento no es tan severo en cuanto a degradaci on de az ucares se reere, es decir, no se produce alta cantidad de compuestos diferentes a los az ucares, sobre todo en la hidr olisis a 98 C. Seg un el an alisis estad stico (GLMANOVA) no se presentaron diferencias signicativas entre los tratamientos de hidr olisis, en cuanto a az ucares reductores, raz on por la cual se sugiere trabajar el tratamiento a 98 C por razones de ahorro energ etico, tabla 2. Este tratamiento t ermico, generalmente, es utilizado como pretratamiento para aplicar posteriormente la hidr olisis enzim atica, debido a que separa el complejo celulosahemicelulosa facilitando la acci on de las enzimas sobre cada mol ecula [10]. El tratamiento t ermico no es tan severo, sobre todo, en la hidr olisis a 98 C. Por esta raz on se nota que en los tratamientos t ermicos la celulosa no resulta tan afectada por la temperatura, lo contrario sucede con la hemicelulosa que si resulta degradada o hidrolizada por el tratamiento t ermico, es decir, el tratamiento de hidr olisis t ermica tiene efectos m as notables sobre la hemicelulosa y en menor medida sobre la celulosa, tablas 2 y 3.
Tabla 3: resultados estad sticos entre los mejores tratamientos de hidr olisis mg AR/ mg ms H.A 0,50 % 0,46053 A H.E Pectinex 200 ppm 0,37743 B H.T 98 C 0,31320 C Tratamiento mg AT/ % Celulosa mg ms 0,51127 B 3,1733 A 0,41653 C 11,1500 B 0,51807 B 12,3467 B % Hemicelulosa 1,9700 A 3,6533 B 2,0800 A

Con base en los datos obtenidos se seleccionaron los tres mejores tratamientos, en los cuales se nota una mayor producci on de metabolitos fermentables (az ucares reductores) y mayor hidr olisis de celulosa y hemicelulosa; en el tratamiento de hidr olisis acida corresponde a la concentraci on de 0,50 % de acido sulf urico, en el tratamiento enzim atico a la enzima Pectinex Ultra SPL que obtuvo altos niveles de producci on de az ucares reductores y en el trata miento t ermico una temperatura de 98 C tuvo una buena respuesta, raz on por la cual puede ser utilizado como pretratamiento para hidr olisis posteriores. En la hidr olisis t ermica la diferencia entre los dos tratamientos no tuvo

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una alta signicancia, por lo cual se seleccion o como mejor tratamiento aquel que demande menor consumo de energ a y equipamiento especial. Con los tratamientos seleccionados se realizaron una serie de combinaciones para determinar cual presentaba mejores resultados en producci on de metabolitos fermentables. 3.2.4 Tratamientos Combinados. La combinaci on de los tratamientos fue la siguiente: Tratamiento 1. Hidr olisis enzim atica + (Hidr olisis acida + Hidr olisis t ermica) 1. Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5 y T = 40 C, t = 20 minutos. 2. H2 SO4 0,50 % v/v + T = 98 C, t = 1 hora. Tratamiento 2. Hidr olisis acida + Hidr olisis t ermica 1. H2 SO4 0,50 % v/v + T = 98 C, 1 hora. Tratamiento 3. Hidr olisis t ermica + Hidr olisis enzim atica 1. T = 98 C, t = 1 hora 2. Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5, T = 40 C, t = 20 minutos. La aplicaci on de tratamientos combinados es una alternativa viable para lograr mayor producci on de az ucares reductores, ya que se mejoran las condiciones de hidr olisis por la acci on de pretratamiento, mejorando los efectos de la hidr olisis principal, tabla 4.
Tabla 4: datos experimentales para tratamientos combinados Tratamiento T1 T2 T3
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mg AR/ mg ms 0, 5464 A 0, 4697 C 0, 5338 B

mg AT/ % Celulosa % Hemicelulosa mg ms 0, 5704 C 2, 85 C 2, 09 B 0, 4977 D 3, 14 C 2, 06 B 0, 5876 B 9, 8 B 1, 99 B

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En el caso del tratamiento que combina enzima y acido (tratamiento 1), el efecto sin ergico se reeja en la alta concentraci on de az ucares reductores al nal del procedimiento. La enzima act ua sobre la pectina y el complejo celulosahemicelulosa facilitando la acci on hidrol tica del acido directamente sobre la mol ecula de celulosa, guras 6 y 7. Este procedimiento conlleva a que el acido adicionado degrade alguna parte de los az ucares reductores formados en la hidr olisis enzim atica, lo cual reduce las expectativas potenciales de esta combinaci on. De manera similar que en el procedimiento individual de hidr olisis acida al 0,50 %, gran parte de los az ucares totales son degradados, por la acci on del acido, a compuestos diferentes que pueden resultar inhibidores de la fermentaci on.
0,8

mg AT, AR/mg ms

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Sin tratamiento 1

T ra t a m ie nt os

mg AR

mg AT

Figura 6: concentraci on de az ucares totales y reductores para los tratamientos combinados

Para el tratamiento que combina adici on de acido y temperatura de 98 C (tratamiento 2) no se encontraron diferencias signicativas con respecto al tratamiento con acido al 0,50 % y temperatura de 80 C, ya que las diferencias en la temperatura no variaron en gran medida los resultados. Para lograr una diferencia, se debe hacer un tratamiento con temperaturas demasiado elevadas (> 150 C) y menores tiempos de exposici on, lo cual trae consigo altos rendimientos en cuanto a az ucares reductores se reere [10].

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16 14 12 10
%

8 6 4 2 0 Sin tratamiento 1 2 3

Tratamiento
% Celulosa % Hemicelulosa

Figura 7: porcentaje de celulosa y hemicelulosa para los tratamientos combinados

El pretratamiento t ermico aplicado para efectuar hidr olisis enzim atica (tratamiento 3), result o una excelente estrategia para aumentar la proporci on de az ucares reductores formado aplicando enzima. El pretratamiento modic o o hidroliz o la estructura de celulosahemicelulosa, liberando unidades de hemicelulosa, las cuales son m as susceptibles a la hidr olisis t ermica. Este pretratamiento permiti o que la enzima adicionada (Pectinex Ultra SPL) actuara con mayor facilidad sobre la celulosa elevando la concentraci on de az ucares reductores, con respecto a la hidr olisis enzim atica sin pretratamiento t ermico. La selectividad de la enzima no permite altas degradaciones de az ucares reductores ya obtenidos en el tratamiento t ermico y su posible conversi on a otro tipo de compuestos diferentes a az ucares. Entre los tratamientos T1 y T3, seg un el an alisis estad stico (ANOVA), no se presentaron diferencias signicativas, en cuanto a producci on de hemicelulosa, y se presentaron diferencias signicativas importantes en cuanto a la degradaci on de celulosa, esto debido a la utilizaci on de acido sulf urico en el primer tratamiento. Los tratamientos T1 y T3 presentan similitud en la producci on de az ucares fermentables. Desde el punto de vista econ omico, el
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tratamiento m as favorable es T3 que involucra la utilizaci on de pretratamiento t ermico e hidr olisis enzim atica, a diferencia de T1 que involucra los mismos tratamientos que el anterior y la adici on de acido sulf urico. En cuanto a tiempo de hidr olisis los dos tratamientos son equivalentes, ya que ambos necesitan de 80 minutos de reacci on (60 minutos para hidr olisis acida o t ermica, y 20 minutos para hidr olisis enzim atica).

Conclusiones

Para establecer con claridad las conclusiones del presente estudio, es necesario diferenciar los resultados por cada tratamiento practicado y evaluar el objetivo principal de obtener metabolitos fermentables. El residuo del despulpado del mango com un (Mangifera indica L.) es un sustrato potencial para la extracci on de metabolitos fermentables y posterior fermentaci on para obtener alcohol (etanol) u otro tipo de productos por v a fermentativa, ya que posee un alto contenido de carbohidratos (15,44 % en base seca), los cuales est an representados en celulosa, hemicelulosa, pectina y az ucares reductores y no reductores. Adem as, su contenido de prote na (7,03 % en base seca) lo hace un material que posee caracter sticas favorables para ser utilizado en fermentaciones microbianas. En el proceso de hidr olisis acida se obtuvieron altas concentraciones de az ucares reductores (az ucares fermentables) en el tratamiento con acido sulf urico (H2 SO4 ) al 0,50 %, obteni endose rendimientos con respecto al material sin tratar del 52,75 %. La hidr olisis de celulosa y hemicelulosa fue alta en el tratamiento con acido, pero se present o conversi on de estos polisac aridos a otro tipo de compuestos indeseables en la soluci on hidrolizada. Este efecto se reeja en la disminuci on de az ucares totales y en la alta degradaci on de celulosa y hemicelulosa con el tratamiento acido. La principal ventaja del tratamiento con acido sulf urico diluido es la baja cantidad de acido requerido en el proceso, pero la temperatura necesaria para efectuar la hidr olisis generalmente es alta, al igual que el tiempo, provocando corrosi on de los equipos utilizados y la degradaci on de az ucares en otro tipo de compuestos que pueden resultar inhibidores de la fermentaci on alcoh olica. Si en el proceso de hidr olisis acida se desea obtener mayor producci on de az ucares reductores se debe elevar la temperatura, y al operar a altas temperaturas (> 150 C), para que el sistema

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continu e como l quido es necesario aumentar la presi on y ello incrementa la inversi on en cuanto a tecnolog a y equipos se reere. En el proceso de hidr olisis enzim atica se obtuvieron los mejores resultados en el tratamiento que utiliz o la enzima comercial Pectinex Ultra SPL (Novo Nordisk Ferment), ya que se obtuvo un rendimiento en az ucares reductores con respecto al material sin tratar del 38,15 %, el cual es un rendimiento signicativo que demuestra que el tratamiento enzim atico es aplicable al material en particular. El tratamiento enzim atico actu o con mayor incidencia sobre la pectina y la hemicelulosa del mango com un, y en menor medida sobre la celulosa. La hidr olisis enzim atica presenta ventajas en cuanto a la acci on selectiva sobre los componentes del material y su baja proporci on de az ucares convertidos a otros compuestos ( acidos org anicos, furfural, HMF, entre otros), seg un el tratamiento experimental efectuado y el material utilizado. El proceso de sacaricaci on por hidr olisis enzim atica presenta ventajas tecnol ogicas y de operaci on en cuanto a que la temperatura (40 C) y el pH (4,5) de la actividad de la enzima no implican dicultades t ecnicas y costos muy elevados, pero el valor de la enzima comercial representa un gran porcentaje del costo del tratamiento. En el proceso de hidr olisis t ermica se obtuvieron rendimientos bajos con respecto a los tratamientos anteriores. El rendimiento m aximo de az ucares reductores obtenido en la hidr olisis t ermica se obtuvo a 125 C y fue de 26,85 %, y en el tratamiento a 98 C se obtuvo un rendimiento de 25,47 %, con respecto al material sin tratamiento. Se determin o que las diferencias entre un tratamiento y otro no tuvieron una signicancia relevante y por tal raz on se opt o por el tratamiento que implique la menor inversi on energ etica. Esta hidr olisis t ermica es eciente como pretratamiento, debido a que facilita la separaci on del complejo celulosahemicelulosa e hidrolizando parte de la hemicelulosa, facilitando la acci on de un tratamiento hidrol tico posterior. La celulosa y hemicelulosa contenida en el mango com un, fue degradada, en su mayor parte, por los tratamientos con acido sulf urico debido a la agresividad de este acido al entrar en contacto con material lignocelul osico. Sin embargo, el hecho de que haya habido mayor degradaci on celul osica y hemicelul osica con acido, no implica que todo el material hidrolizado haya sido convertido en az ucares reductores (az ucares fermentables), gran cantidad del material lignocelul osico hidrolizado se convirti o en otro tipo de compuestos

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no deseados en la soluci on hidrolizada tales como: acidos org anicos (ac etico, f ormico y levul nico), compuestos arom aticos, furfural e hidroximetilfurfural, entre otros, que son potenciales inhibidores de microorganismos en el caso de una fermentaci on alcoh olica. El tratamiento enzim atico, present o mayor degradaci on sobre la pectina presente en el material, la hemicelulosa asociada a la celulosa y de f acil degradaci on, y sobre la celulosa, en menor proporci on. A pesar de su selectividad en la acci on sobre los componentes del material, las enzimas utilizadas, Pectinex Ultra SPL y Celluclast 1,5 L (Novo Nordisk Ferment), present o degradaci on de compuestos lignocelul osicos a otro tipo de compuestos diferentes de az ucares ( acidos galactur onicos, entre otros), aunque en muy baja proporci on. Esta reacci on se pudo apreciar en la reducci on de az ucares totales posterior al tratamiento enzim atico, sin embargo, es preciso armar que esta reducci on en la concentraci on de az ucares totales, pudo ser provocada por errores de lectura en el procedimiento de determinaci on de az ucares totales (m etodo de Antrona), ya que es un m etodo colorim etrico que puede presentar errores o desviaciones atribuidas a calibraci on de equipos de lectura (espectrofot ometro) o a los reactivos utilizados en el procedimiento. La hidr olisis t ermica no afect o de manera considerable la celulosa contenida en el material ya que el tratamiento t ermico no es tan fuerte o selectivo como el tratamiento acido o enzim atico, respectivamente. La hidr olisis t ermica tuvo mayor consecuencia sobre la hemicelulosa contenida en el mango com un, es decir, se present o mayor degradaci on en la hemicelulosa que sobre la celulosa. Esta reacci on se debe a que la hemicelulosa asociada con celulosa se desprende y el calor aplicado al sistema hidroliza la hemicelulosa que es una mol ecula de f acil degradaci on, produciendo az ucares fermentables. Este procedimiento es recomendado, seg un datos bibliogr acos, como pretratamiento para la aplicaci on posterior de otros m etodos de hidr olisis. Los tratamientos en los cuales se obtuvieron mejores resultados fueron: Hidr olisis acida: acido sulf urico 0,50 %, 80 C, 1 hora. Hidr olisis enzim atica: Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5, 20 minutos, 40 C. Hidr olisis t ermica: 98 C, 1 hora, presi on atmosf erica. En los tratamientos combinados, el tratamiento que present o los mejores

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resultados en cuanto a producci on de metabolitos fermentables fue la combinaci on de enzima, temperatura y acido sulf urico, con la enzima como pretratamiento. Con este tratamiento combinado se obtuvo un rendimiento en az ucares reductores de 57,28 % con respecto al material sin tratamiento, es decir, se present o un rendimiento mayor que en el mejor tratamiento individual ( acido sulf urico 0,50 %, 80 C). Sin embargo, el procedimiento implica elevada inversi on en cuanto a enzima, acido y temperatura utilizada. En cuanto a la conversi on de celulosa y hemicelulosa, la combinaci on de tratamientos aumenta la degradaci on de material lignocelul osico, sobre todo en el proceso con acido. De manera similar que en el proceso individual con acido, la concentraci on de compuestos diferentes formados por degradaci on de carbohidratos puede resultar un factor de inhibici on para microorganismos fermentativos. Por las razones antes expuestas, se selecciona el tratamiento 3: hidr olisis t ermica (98 C, 1 hora, presi on atmosf erica) + hidr olisis enzim atica (Pectinex Ultra SPL a 200 ppm, pH 4,5, 40 C, 20 minutos), como el que mejor combina la producci on de az ucares fermentables y condiciones de tratamiento suaves.

Referencias
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