MANUAL DE PROCEDIMIENTOS HEMATOLOGA Y COAGULACIN

CONTENIDO Presentacin.........................................................................................................7 Introduccin.........................................................................................................9 SECCIN 1: GENERALIDADES.........................................................................11 1.1 Objetivo........................................................................................................... 11 1.2 Campo de aplicacin....................................................................................... 11 1.3 Responsabilidades...........................................................................................11 1.4 Documentos de referencia...............................................................................12 SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD......................................................13 SECCIN 3: OBTENCIN DE MUESTRAS SANGUNEAS................................14 3.1 Objetivo...........................................................................................................14 3.2 Obtencin de sangre venosa con jeringa................................................... .14 3.3 Obtencin de sangre venosa en tubos al vaco............................................. 16 3.4 Obtencin de sangre de la vena yugular externa.......................................... 18 3.5 Obtencin de sangre capilar.......................................................................... 19 SECCIN 4: ANTICOAGULANTES..................................................................... 22 4.1 Caractersticas bsicas de los anticoagulantes ms usados hematologa...............................................................................................22 en

4.2 Anticoagulantes slidos..............................................................................22 4.3 Anticoagulantes lquidos................................................................................ 24 SECCIN 5: REALIZACIN Y TINCIN DEL FROTIS SANGUNEO.................. 25 5.1 Mtodo de los dos portaobjetos.................................................................... 25 5.2 Coloraciones usadas.................................................................................... 26 5.3 Tincin con colorante de Wright....................................................................27 SECCIN 6: HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO....................... 29 6.1 Recuento leucocitario................................................................................. 29 6.2 Recuento de glbulos rojos....................................................................... .33

6.3 Determinacin del volumen globular (Hto)................................................. 35 6.4 Dosaje de hemoglobina.............................................................................. 38 6.5 Frotis de sangre perifrica......................................................................... 40 6.6 Frmula leucocitaria................................................................................... 41 SECCIN 7: VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN..........................................43 7.1 Mtodo de Westergren............................................................................... 43 7.2 Mtodo de Wintrobe.................................................................................... 44 SECCIN 8: PERFIL DE HEMOSTASIA.......................................................45 8.1 Principios generales.................................................................................. 45 8.2 Mecanismo de coagulacin....................................................................... 45 8.3 Exploracin de la coagulacin................................................................... 46 8.4 Obtencin del plasma................................................................................ 46 8.5 Tiempo de sangra.....................................................................................47 8.5.1 Mtodo de Ivy.........................................................................................48 8.5.2 Mtodo de Duke.....................................................................................49 8.6 Tiempo de coagulacin de sangre total (TCST)....................................... 51 8.7 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK)................................. 54 8.8 Tiempo de trombina................................................................................. 55 8.9 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick).............................................. 56 SECCIN 9: RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS................58 9.1 Recuento de reticulocitos.......................................................................... 58 9.2 Recuento de plaquetas.............................................................................. 60 SECCIN 10: LEUCOGRAMA........................................................................ 63 10.1 Granulocitos.............................................................................................63 10.2 Agranulocitos........................................................................................... 65 10.3 Criterios para el desarrollo de un leucograma......................................... 67 SECCIN 11: ALTERACIONES ERITROCITARIAS....................................... 79

Alteraciones en el tamao................................................................................ 70 Alteraciones en la forma................................................................................... 71 Alteraciones de color.........................................................................................72 Inclusiones anormales.......................................................................................73 BIBLIOGRAFA.................................................................................................79 ANEXO A: Preparacin de colorantes y soluciones ms Usados en hematologa...................................................................................81 ANEXO B: Preparacin de anticoagulantes.................................................. 85

PRESENTACIN

Con el propsito de uniformizar los procedimientos hematolgicos que serealizan en los diversos laboratorios clnicos, el Instituto Nacional de Saludpone a disposicin de la comunidad tcnico-cientfica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Tcnicas Bsicas de Hematologa, en elcual se incluyen todos los mtodos empleados en el campo hematolgicobsico. De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnstico en loslaboratorios de los servicios de salud.El laboratorio de hematologa cuenta con dos reas bsicas: rea deHematimetra (hemograma, VSE, recuento de plaquetas, etc.) y rea deHemostasia. Partiendo de esta estructura, en este manual nos referiremos alas tcnicas bsicas empleadas en estas reas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacin de las pruebas respectivas.Es necesario enfatizar que para obtener resultados ms confiables es importante,pero no imprescindible, automatizar el laboratorio, debido a que elloevitar el posible error humano, sobre todo en lo referente a recuentos celulares,valores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre, hecho que es muydifcil de lograr cuando se usan los mtodos manuales, lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasia.Esperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud, adems de una gua para el personalde laboratorio en general.

INTRODUCCIN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple, didctica y eminentementeprctica para que su contenido sea fcil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologa.Se divide en tres partes: 1. En la primera parte se presentan los aspectos ms importantes de labioseguridad en el laboratorio. 2. En la segunda parte se exponen las principales tcnicas bsicas del laboratoriode hematologa. 3. En la tercera parte se detallan las alteraciones ms frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma. El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematolgicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaltica) hasta el procesamiento de sta (fase analtica)en la determinacin correspondiente, y por ltimo, en la emisin de losresultados (fase postanaltica). Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracin los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio, es decir, las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente. Esperamos que el presentemanual sirva de gua efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad.

SECCIN 1

GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer y estandarizar los procedimientos bsicos de un examen dehemograma, hemoglobina, hematocrito, recuento de plaquetas, velocidad desedimentacin y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnstica alclnico. 1.2 CAMPO DE APLICACIN La aplicacin de las tcnicas hematolgicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal tcnicoy profesional de los laboratorios clnicos. 1.3 RESPONSABILIDADES 1.3.1 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica, a travs de su Direccin Ejecutiva de Laboratorios de Referencia, es responsable deautorizar la elaboracin, la revisin y la actualizacin del presente manual,de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud. 1.3.2 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar, proporcionar los recursos necesarios, y designar al personalresponsable para la aplicacin de las disposiciones contenidas en elpresente manual. 1.3.3 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones, organizar, controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual. 1.3.4 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad, la idoneidad del personal, equipos, materiales,reactivos e instalaciones. 1.3.5 El personal mdico, profesional y tcnico, es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespecficos indicados.

1.4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

1.4.1 Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud. OrganizacinPanamericana de la Salud. Publicacin cientfica N 439. N 2, 1983. 1.4.2 Manual de normas de bioseguridad. Instituto Nacional de Salud. Serie deNormas Tcnicas N 18. 2. ed., 1997.

SECCIN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 Para la obtencin de muestras, el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exmenes hematolgicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad. Serie de NormasTcnicas N 18. 2.2 Se debe controlar sobre todo: 2.2.1 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologa. 2.2.2 El proceso de coloracin en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacin de sustanciastxicas o cancergenas. 2.2.3 Ver lo referente a medidas de proteccin en caso de accidentes porinoculacin.

SECCIN 3

OBTENCIN DE MUESTRAS SANGUNEAS 3.1 OBJETIVO Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencin de muestrassanguneas con un adecuado control de calidad, ya que de ello dependeque el resultado del anlisis de la muestra sea el correcto. Se efectuar enayunas o no, dependiendo de la prueba a usar. 3.2 OBTENCIN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA 3.2.1 Materiales y equipos requeridos 3.2.1.1 Algodn. 3.2.1.2 Alcohol al 70%. 3.2.1.3 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo. 3.2.1.4 Jeringas de 5 mL. 3.2.1.5 Viales con anticoagulante EDTA. 3.2.2 Obtencin de la muestra 3.2.2.1 Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el pacientese sienta cmodo. 3.2.2.2 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexin del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo (Fig. 1). 3.2.2.3 Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un rea de 2pulgadas (Fig. 2). 3.2.2.4 El paciente deber abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespus la mantendr cerrada, esto ayudar a visualizar las venassuperficiales (Fig. 3). 3.2.2.5 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig. 4). 3.2.2.6 Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutneo, luego seperfora la vena (Fig. 5).

3.2.2.7 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.

3.2.2.8 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puo. Secoloca el algodn seco encima de la puncin y se retira la aguja (Fig. 6). 3.2.2.9 Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante. No olvidar colocar una gota en lalmina portaobjeto para realizar el frotis. 3.2.2.10 Agitar el vial en crculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante. PUNTOS PARA LA EXTRACCIN DE SANGRE (Toma de muestra) Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3

Fig. 4 Fig. 5

Fig. 6 Fig. 7

3.3 OBTENCIN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACO 3.3.1 Materiales requeridos 3.3.1.1 Algodn. 3.3.1.2 Alcohol al 70%. 3.3.1.3 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo. 3.3.1.4 Tubos al vaco con anticoagulante EDTA (K3), EDTA (Na2) u otroanticoagulante. 3.3.1.5 Agujas con dispositivo para extraccin de sangre al vaco: - N 21 para adultos. - N 22 para nios y neonatos. De preferencia, ambas de bisel corto para evitar la coagulacin

3.3.2 Obtencin de la muestra

3.3.2.1 Repetir los pasos de 3.2.2.1 a 3.2.2.4. 3.3.2.2 Se retira el estuche protector de la aguja y ste se enrosca al dispositivopara extraccin de sangre al vaco. 3.3.2.3 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexin del codo o10 cm por encima de ste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. 3.3.2.4 Una vez escogida la vena, algodnembebido en etanol al 70%. desinfectarla con una pieza de

3.3.2.5 Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 0,5 cm y 1 cm en el tejido subcutneo,se inserta el tubo al vaco por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extrada ya que el mismo sonido del vaco avisarque la extraccin termin (Fig. 8). 3.3.2.6 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado. 3.3.2.7 Colocar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig. 9). 3.3.2.8 Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos,con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma. 3.3.2.9 Mezclar por inmersin suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo. No agitar el contenido.

Fig. 8 Fig. 9

3.3.3 Ventajas de una extraccin de sangre venosa

3.3.3.1 Pueden hacerse repetidos exmenes con la misma muestra. 3.3.3.2 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura.
3.3.4 Desventajas de una extraccin de sangre venosa 3.3.4.1 La puncin venosa, por su largo procedimiento, requiere mayor preparacin que el mtodo capilar. 3.3.4.2 El mtodo es tcnicamente difcil en nios, individuos obesos y pacientes en shock. 3.3.4.3 La hemlisis debe ser evitada, pues se puede obtener una disminucin en el recuento de eritrocitos. 3.3.4.4 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete, pues produce hemlisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anlisis de gases, recuentos celulares, determinacin de pH sanguneo y algunas pruebas de coagulacin. 3.3.4.5 La sangre anticoagulada si no es de obtencin reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre, pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones, agregacin plaquetaria y dificultan la identificacin de leucocitos. 3.3.4.6 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables, los recuentos de leucocitos y plaquetas e ndice de sedimentacin deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra.

3.4 OBTENCIN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

3.4.1 Materiales requeridos 3.4.1.1 Algodn. 3.4.1.2 Alcohol al 70%. 3.4.1.3 Jeringas de 5 mL. 3.4.1.4 Viales con anticoagulante EDTA. 3.4.2 Obtencin de la muestra

3.4.2.1 El paciente es cubierto por una sbana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo.

3.4.2.2 Al paciente se le coloca de cbito dorsal sobre la mesa de examen ouna camilla, de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea sujetado por un asistente. 3.4.2.3 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente. 3.4.2.4 Limpiar la zona en un rea de 2 pulgadas con alcohol al 70% o alcoholyodado. 3.4.2.5 Se repiten los pasos de 3.2.2.5 a 3.2.2.7 de la extraccin de sangrevenosa con jeringa. 3.4.2.6 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodnseco, aproximadamente de 3 a 5 minutos. Pedir al paciente que permanezcaechado diez minutos. 3.4.2.7 Se repiten los pasos de 3.2.2.9. 3.4.2.8 Se repiten los pasos de 3.2.2.10. 3.4.3 Ventajas Constituye un buen mtodo para la obtencin de sangre en pacientes conshock con venas colapsadas. 3.4.4 Desventajas Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina, slo encasos en que no se pueda obtener la muestra por mtodos convencionales. 3.5 OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequea o cuando pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncin venosa, debe recurrirse a la puncin capilar. 3.5.1 Materiales requeridos 3.5.1.2 Algodn. 3.5.1.3 Alcohol al 70%. 3.5.1.4 Lancetas desechables (Fig. 10).

3.5.1.5 Papel filtro N 2. 3.5.2 Procedimiento (Fig. 11): 3.5.2.1 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taln en los nios. 3.5.2.2 Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodn estril. 3.5.2.3 Punzar la piel con una lanceta estril desechable (2 mm de profundidad). 3.5.2.4 Usar gasa estril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares. Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicin sangunea. 3.5.3 Ventajas 3.5.3.1 Puede obtenerse con facilidad. 3.5.3.2 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifrica. 3.5.4 Desventajas 3.5.4.1 Slo se pueden obtener pequeas cantidades de sangre y los exmenesde repeticin requieren nuevas muestras. 3.5.4.2 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayora de pruebas de laboratorio. 3.5.4.3 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa. 3.5.4.4 El dedo no slo es delicado sino difcil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible. 3.5.4.5 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccin (aquellos conleucemia, agranulocitosis, diabetes, uremia y enfermedades con deficienciasinmunolgicas), una muestra tomada del dedo es mucho msprobable que conduzca a una infeccin que otra tomada del brazo. 3.5.4.6 El recuento de eritrocitos y leucocitos, as como el recuento deplaquetas y reticulocitos, no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difcil estandarizacin del flujo sanguneo capilar.

EXTRACCIN DE SANGRE CAPILAR

Fig. 10

Fig. 11

SECCIN 4 ANTICOAGULANTES Una vez extrada la sangre, sta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicin de un anticoagulante. 4.1 CARACTERSTICAS BSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MS USADOSEN HEMATOLOGA No alterar el tamao de los hemates. No producir hemlisis. Evitar al mximo la agregacin plaquetaria. No alterar la morfologa de los leucocitos. La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, inclusomantenida bajo refrigeracin (4 C) si no pasan de las 2 horas. El tiempomximo entre la extraccin de la sangre y su procesamiento depende delcoagulante de eleccin y no debe ser ms de 4 horas, a excepcin delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetractico) que puede ser hasta 24 horas(en refrigeracin a 4 C). Los anticoagulantes pueden emplearse en forma slida o lquida. Los primerosestn indicados para la determinacin de los parmetros

hematolgicos,ya que no producen, como los anticoagulantes lquidos, dilucin de la sangre. 4.2 ANTICOAGULANTES SLIDOS 4.2.1 EDTA Es la sal disdica o tripotsica del cido etilendiaminotetractico. La saldisdica (Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotsica (K3EDTA). Estoscompuestos

realizan su accin a travs de un efecto quelante sobre el calcio,al fijarlo impiden su activacin y, por ende, la coagulacin sangunea.

4.2.1.1 Ventajas Respeta la morfologa eritrocitaria (especialmente la sal tripotsica) yleucocitaria, de manera que permite una demora de dos horas en la realizacindel frotis sanguneo despus de la extraccin sangunea. Asegura la conservacin de los elementos formes sanguneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 C. Al inhibir la aglutinacin de las plaquetas, facilita su recuento o su expresinsemicuantitativa a partir del frotis. La concentracin recomendada de EDTA es de 1,5 mg/mL. de sangre. Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccin celular, condisminucin del hematocrito, y un aumento de la concentracin media de lahemoglobina. Un exceso de sangre con relacin al anticoagulante produceformacin de microagregados que pueden alterar los resultados. El empleode tubos al vaco con una gota (50mL) de EDTA tripotsica comercialpara 5 mL de sangre es de inters prctico dado que es cien veces mssoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante.
4.2.1.2 Desventajas Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos, a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma, por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante. 4.2.2 Anticoagulante de Wintrobe Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio. Acta por precipitacin del calcio, es fcil de preparar. Se emplea en forma de polvo en proporcin de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio. La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre. Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina, hematocrito y recuento globular, pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos, tampoco es til para el recuento plaquetario porque produce formacin de agregados plaquetarios. 4.2.3 Heparina El nombre de heparina proviene del griego hepar, que significa hgado, ya que fue aislado por primera vez de las clulas de este tejido. Es un mucopolisacrido cido. Presenta el

inconveniente de que si no se agita rpidamente con la sangre despus de extrada pueden formarse microcogulos, aunque no altera el volumeneritrocitario ni la

morfologa de los leucocitos. No es recomendablepara el frotis sanguneo porque produce un fondo azul en la lmina. La heparina de sodio o litio puede usarse en forma slida o lquida, en proporcinde 0,1 - 0,2 mg de heparina por 1 mL de sangre. 4.3 ANTICOAGULANTES LQUIDOS 4.3.1 Citrato trisdico Es de eleccin para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacin. Acta a travs de la precipitacin del calcio. La concentracin depende de la prueba por realizar. Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcin de 1: 9 (0,5 mL deanticoagulante para 4,5 mL de sangre total). Para la determinacin de la VSG (Velocidad de Sedimentacin Globular) es1:4 (0,5 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre). 4.3.2 Oxalato sdico Recomendado tambin para las pruebas de hemostasia. Se emplea en proporcinde un volumen de anticoagulante para 4 vol. de sangre.

SECCIN 5 REALIZACIN Y TINCIN DEL FROTIS SANGUNEO La prctica del frotis sanguneo, tambin llamado extendido, es de gran importanciaen hematologa ya que el diagnstico de muchas enfermedadeshematolgicas puede realizarse con slo observar las caractersticasmorfolgicas de las clulas sanguneas, de manera que ste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino. Todas las lminas por usar,sobre todo nuevas, deben ser limpiadas con algodn y alcohol al 70% paraeliminar la grasa que viene adherida. 5.1 MTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS 5.1.1 Materiales - Alcohol al 70%. - Algodn. - Lanceta descartable. - Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm). 5.1.2 Fundamento Consiste en la extensin de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75),empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensin (Fig. 12). 5.1.3 Procedimiento 5.1.3.1 Una vez extrada la sangre con cualquiera de las metodologas, secoloca una pequea gota de sangre (5mL) (aprox. 3 mm de dimetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos. 5.1.3.2 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un ngulo de 45. 5.1.3.4 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto. El grosor delfrotis sanguneo puede variar segn sea el ngulo que formen entres ambos portaobjetos. As, si es superior a 45, la extensin obtenidaser gruesa y corta, si es inferior a 45 ser larga y fina. El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicin horizontal.

Fig. 12

Zona excesivamente gruesa: Se halla en la regin inmediata al punto departida de la extensin (cabeza). En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin y termina enun rea donde las clulas adoptan una posicin acartonada (barbas). Enesta regin existe un exceso de granulocitos y monocitos. Zona ideal: Corresponde a la regin intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de clulas. 5.2 COLORACIONES USADAS Una vez seco el frotis, se procede a la tincin hematolgica con el colorante deRomanowsky, constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno. Dentrode stas tenemos: 5.2.1 Colorante de Giemsa. 5.2.2 Colorante de May-Grunwald. 5.2.3 Colorante de Wright. 5.2.4 Colorante de Leishman.

Preparacin de colorantes (Anexo A) Para el estudio de las clulas sanguneas utilizar el colorante 5.2.3 y 5.2.4. Para el estudio de hemoparsitos utilizar el colorante 5.2.1. Utilizar el colorante 5.2.2 para casos especiales en que se desee observar con mayor claridad y especificidad los grnulos de los neutrofilos. 5.3 TINCIN CON COLORANTE DE WRIGHT 5.3.1 Fundamento El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma ytamao de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracin. La informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracin. 5.3.2 Materiales 5.3.2.1 Colorante de Wright (Anexo A). 5.3.2.2 Frasco gotero. 5.3.2.3 Solucin amortiguada tamponada (Anexo A). 5.3.3 Procedimiento 5.3.3.1 Una vez obtenido el frotis sanguneo, se le dejar secar entre 15 y 20minutos. 5.3.3.2 Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorantede Wright, dejndolo por espacio de 5 minutos. 5.3.3.3 Posteriormente se aade solucin amortiguada tamponada partesiguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 6 minutos adicionales. 5.3.3.4 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar. en

5.3.3.5 Se coloca en el microscopio y, con pequeo aumento, se revisa lacalidad de la coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota deaceite de inmersin y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los glbulos rojos se examinar detenidamente observandoadems del color (cantidad de hemoglobina), presencia deplaquetas, su agrupacin y distribucin. 5.3.3.6 Posteriormente, se hace el recuento diferencial de glbulos blancosen 100 clulas, para lo cual se deber conocer las diferencias entreneutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos.Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por unabuena diferenciacin de las estructuras subcelulares en los leucocitos,una coloracin rosada de los hemates y la ausencia de precipitados. Los defectos ms frecuentes observados en la tincin del frotis sanguneoson: Coloracin excesivamente azul, debido a: Frotis excesivamente grueso. Lavado insuficiente. Tincin muy prolongada. Empleo de colorante excesivamente alcalino. Coloracin con una tonalidad rosada: El colorante, el tampn o el agua de lavado tienen un pH demasiadocido. Presencia de precipitados: Obedecen a una accin excesiva del colorante. Esto se puede evitarcon la filtracin.

SECCIN 6 HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO El hemograma de Shilling constituye uno de los exmenes de laboratorio msusados en el campo de la hematologa. Comprende las siguientes pruebas: 6.1 RECUENTO LEUCOCITARIO Principio La sangre anticoagulada se deposita en un lquido que permite evidenciar losleucocitos, mantenindolos visibles, mientras que los eritrocitos

sonhemolizados. El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresapor mm3 (milmetro cbico). 6.1.1 Equipos - Microscopio. - Hemocitmetro (Cmara de Neubauer). Consta de los siguientes elementos: Una lmina portaobjeto gruesa, en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la lmina por surcos y dosbarras transversales algo ms elevadas. Una laminilla cubreobjetos pticamente plana, que, al colocarse sobrelas barras elevadas de la lmina forma una cmara entre el cubreobjetosy la superficie cuadriculada.La altura entre el cubreobjetos y la lmina portaobjetos es de 0,1 mm.Cada cuadrcula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandes.Cada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie, que se subdivide a suvez en 16 cuadrados medianos. El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados pequeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos. Cadacuadrado pequeo mide 0,2 mm de lado (0,04 mm2 de superficie), y cadacuadradito mide 0,05 mm de lado (0,0025 mm2 de superficie).

6.1.2 Materiales y reactivos requeridos 6.1.2.1 Pipeta de glbulos blancos (De Thoma) o pipeta automtica (de 0 a 100 mL).Presenta cerca del extremo superior una marca de 11, inmediatamentecontina una dilatacin (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora, luego sigue el extremo ms largo de la pipeta (tallo) que estdividida en 10 partes, con 2 marcas: 1 (parte final del bulbo) y 0,5 (a la mitaddel tallo). Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar. 6.1.2.2 Diluyente de glbulos blancos: Solucin de Turk al 1%. 6.1.2.3 Contador manual (Slo si fuera necesario). 6.1.2.4 Papel filtro. 6.1.3 Procedimiento 6.1.3.1 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glbulos blancoshasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente. 6.1.3.2 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucin de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas). 6.1.3.3 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automtico por 2 3 minutos. 6.1.3.4 Monte la laminilla de vidrio en la cmara para recuento que debe estarlimpia y seca. 6.1.3.5 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequea de esta solucin en la cmara. 6.1.3.6 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten.

6.1.3.7 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares.Cuando se usa la pipeta automtica, se toma 20 mL (0,02 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucin de Turk (aqutenemos una dilucin 1:20).

LECTURA

Fig. 13 La lectura se realiza en los campos 1, 3, 7 y 9 como est indicado en la figura.Adems de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la lneahorizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos,adheridos a la lnea horizontal inferior y vertical interior. 6.1.4 Resultados

N de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 campos altura x dilucin x rea Reemplazando = leucocitos contados en 4 campos1/10 x 1/20 x 4=

Leucocitos contados en 4 campos4/200=

X/1 4/200= N leucocitos contados x 50

6.1.5 Valores de referencia 5000 - 10 000 leucocitos / mm3 6.1.6 Correccin de valores para restar eritrocitos nucleados Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el lquido de dilucin, por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos, de tal manera que se debe emplear la siguiente frmula: Clculo: La concentracin del nmero de normoblastos (por litro) es:Nmero de normoblatos contados x concentracin o nmero de leucocitos100 + N de normoblastos contados Ejemplo: Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracin del nmero de leucocitos es16 x 109/l, la concentracin del nmero de normoblastos ser: 50 x16 = 5,3 x 109/l

100 + 50 y la concentracin de leucocitos corregida ser: 16 - 5,3 = 10,7 x 109/lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por milmetro cbico. En tales unidades el clculo correspondienteal ejemplo que se ha dado sera: 50 x 16 000 = 5300 / mm3 100 + 50 Recuento corregido de glbulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 / mm3

Fuente: Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud. OPS, N 2.

6.2 RECUENTO DE GLBULOS ROJOS Principio La sangre se diluye en un lquido que nos permite observar claramente loshemates, luego esta dilucin se coloca en una cmara de Neubauer con laayuda de una pipeta automtica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nmero de glbulos rojos por mm3. 6.2.1 Equipos - Microscopio. - Hemocitmetro (cmara de Neubauer). 6.2.2 Materiales y reactivos requeridos 6.2.2.1 Pipeta de glbulos rojos (De Thoma) o pipeta automtica (de 0-100 mL). Presenta cerca del extremo superior una marca de 101, inmediatamentecontina una dilatacin (bulbo) que contiene una perla roja mezcladora,luego sigue el tallo (extremo ms largo), el cual est dividido en 10 partescon 2 marcas: 1 acabando el bulbo y 0,5 a la mitad del tallo. Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar. 6.2.2.2 Diluyente de glbulos rojos: Cloruro de Sodio al 0,9% (ver anexo). Diluyente de Hayem (ver anexo). 6.2.2.3 Contador manual (slo si fuera necesario). 6.2.2.4 Papel filtro. 6.2.3 Procedimiento

6.2.3.1 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar. 6.2.3.2 Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5para realizar una dilucin de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilucinser 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. 6.2.3.3 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de lquido de dilucin hasta la marca de 101. 6.2.3.4 Se coloca en un rotador automtico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos. 6.2.3.5 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar unagota pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridadse llene exactamente. 6.2.3.6 Hacer el recuento con objetivo de 40x.Se puede realizar con la pipeta automtica, se toma 20 mL (0,02mL)de sangre total con anticoagulante, o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucin de Hayem (aqu setiene una dilucin de 1:200). Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la cmara con la misma pipeta usandoun nuevo tip. El inconveniente aqu es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas. 6.2.3.7 Dejar en reposo por 3 minutos. 6.2.3.8 Enfocar la cuadrcula a 10x, luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la cmara slo en 5 cuadrados pequeos:uno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total). 6.2.3.9 En el recuento se incluyen las clulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las lneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequeo de recuento y no se consideran los correspondientes a loslmites inferior y derecho.Se hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos parmetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig. 14

6.2.4 Resultados N de hemates x mm3 = hemates contados en 5 cuadrados pequeosaltura x dilucin X rea Reemplazando = hemates contados en 5 cuadrados pequeos1/10 x 1/200 x 1/5 = hemates contados en 5 cuadrados pequeos 1/10 000 = hemates contados x 10 000 6.2.5 Valores de referencia (Unidades tradicionales millones de clulas/mm3). Hombres 4 500 000 - 5 500 000 Mujeres 4 000 000 - 5 000 000 Nios (4 aos) 4 200 000 - 5 200 000 Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000 Recin nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente: Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud. OPS, N 2. 6.3 DETERMINACIN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito) Mide la fraccin que comprende a los glbulos rojos (masa globular), respectoal volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar. Puede expresarseen porcentaje o como valor decimal.

Hto= altura de la columna de glbulos rojos altura de la columna de sangre total(glbulos rojos ms plasma) 6.3.1 Mtodo de Wintrobe Materiales requeridos: - Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm. - Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia. - Tapn de goma. Procedimiento: Llenar la sangre extrada con anticoagulante con una pipeta pasteur, comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm, teniendocuidado de no provocar espuma. Tapar el tubo con un tapn de goma para evitar la evaporacin. Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos. Resultados (lectura):

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de glbulosrojos. Valores de referencia: Hombres : 40% - 54%Mujeres : 38% - 48% Fuente: Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud. OPS, N 2. 6.3.2 Mtodo de microhematocrito Materiales requeridos: - Capilares rojos y azules (75 mm x 1,5 mm). - Plastilina Procedimiento: Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon anticoagulante de Wintrobe o EDTA. Debe llenarse aproximadamente70% - 80% del capilar. Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina. Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrfuga demicrohematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma. Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm. Resultados (lectura) La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio. Uso de la escala: Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la lnea horizontal correspondiente al cero. Desplace el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada con elnmero 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos contine sobre la lnea cero. El tubodebe encontrarse completamente en posicin vertical. La lnea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicar lafraccin de volumen de stos. Valores de referencia: Hombres 40% - 50% Mujeres 38% - 44% Nios (5 aos) 38% - 44% Lactantes (3 meses) 37% - 42% Recin nacidos 50% - 58%

La disposicin celular es:Parte superior, una columna de plasma.En la interfase estn los leucocitos yplaquetas.Parte inferior est la columna deeritrocitos (Fig. 15). 6.4 DOSAJE DE HEMOGLOBINA Principio La sangre se diluye en lquido de Drabkin, el cual hemoliza los hemates yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina).La solucin que se produce se lee por medio de un espectrofotmetro ofotocolormetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre. 6.4.1 Materiales y reactivos 6.4.1.1 Un colormetro fotoelctrico o un espectrofotmetro. 6.4.1.2 Pipetas: Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 mL, contubo de goma y boquilla. Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.

6.4.1.3 Tubos de ensayo. 6.4.1.4 Reactivo de Drabkin para dilucin. Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada. Si se dispone de una balanza analtica la preparacinse puede hacer en el laboratorio. Esta solucin se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deschese sise enturbia.