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PRACTICA N 3 PRECIPITACIN, SEPARACIN Y PUNTO ISOELCTRICO DE PROTENAS.

Gutirrez Gutirrez Joab Yosafat Nava Rodrguez Mario Eduardo Grupo: 4QM2 Seccin: 3 Laboratorio: 5

In this practice demonstrates the properties of the proteins that can be modified to manipulate for the study of thereof and for the purification of these. We also study the effects of metals for protein precipitation and modify the pH in a solution of insulin for understand a little more the isoelectric point. INTRODUCCIN Las clulas contienen miles de protenas. La preparacin pura de una protena es esencial antes de determinar sus propiedades, composicin de aminocidos y secuencia. Los mtodos de separacin de protenas aprovechan las propiedades fisicoqumicas de estas. La solubilidad de la mayor parte de las protenas se debe a la interaccin hidrfilica de las molculas polares del agua y los grupos ionizados de las protenas. Existen diversos factores (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica del disolvente) que afectan la solubilidad de las protenas la modificacin de estos parmetros en soluciones proteicas heterogneas, permite purificarlas en virtud de su solubilidad. OBJETIVOS RESULTADOS El alumno observara el efecto que producen algunos agentes fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas. El alumno determinara el punto isoelctrico de la insulina basndose en las propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH. MATERIAL Y MTODO Gradilla, tubos de ensayo, pipetas de 1.5, 5 y 10ml, vaso de precipitado, jeringas para insulina, probeta de 100ml, centrifuga, embudo de filtracin, algodn, agitador de vidrio. Separacin de protenas por precipitacin con sales (salting out). 6ml de clara diluida 3:1 + 6ml de sol. Saturada de sulfato de amonio, centrifugar a 2500 rpm 15 min. resuspender el precipitado en 2ml de H2O destilada Tabla de Salting Out Biuret Positiva Positiva Positiva Positivo Interpretacin Formacin de color violceo Formacin de color violceo Formacin de color violceo Formacin de color violceo realizar reaccin de Biuret, tomar 1ml del filtrado y hacer reaccin de Biuret, tomar 5ml de filtrado + sulfato de amonio solido hasta saturacin, filtrar, al filtrado y al precipitado realizar reaccin de biuret Precipitacin por efecto del pH y de solventes Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla de Precipitacin por efecto del pH y de solventes

Precipitacin de protenas por metales pesados Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla de Precipitacin de protenas por metales pesados Determinacin del punto isoelctrico de la insulina Preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla de Determinacin del punto isoelctrico de la insulina

Filtrado 1 Precipitado 1 Filtrado 2 Precipitado 2

PRACTICA N 3 PRECIPITACIN, SEPARACIN Y PUNTO ISOELCTRICO DE PROTENAS. Gutirrez Gutirrez Joab Yosafat Nava Rodrguez Mario Eduardo Grupo: 4QM2 Seccin: 3 Laboratorio: 5

Tabla Precipitacin por efecto del pH y de solventes TUBO No Clara de huevo (ml) HCl 0.1 N (ml) NaOH 0.1 N (ml) Regulador de acetatos 0.1 M pH 4.7 (ml) Observaciones 1 3.0 1.0 2 3.0 1.0 3 3.0 1.0

Tabla Determinacin del punto isoelctrico de la insulina Tubo N Acid. actico 0.2M (ml) 0.23 0.15 0.05 0.01 0.00 Acetato de sodio 0.2M (ml) 0.02 0.10 0.20 0.24 0.25 Insulina 40U/ml pH Obs.

1 2 3

+ Etanol 96 (ml) Observaciones 3.0 +++

--3.0 ---

++ 3.0 +++

4 5

6U 0.06ml 6U 0.06ml 6U 0.06ml 6U 0.06ml 6U 0.06ml

3.7 4.6 5.4 6.1 9.0

No precipito No precipito Precipito No precipito No precipito

--- No hay precipitacin + Precipitacin parcial ++ Turbidez +++ Precipitacin total


Tabla Precipitacin de protenas por metales pesados TUBO No Clara de huevo Cloruro mercurico Nitrato de Plata Acetato de plomo Cloruro de bario 5% Cloruro de sodio Agua Obs. 1 1.0 0.25 2 1.0 0.25 3 1.0 0.25 4 1.0 0.25 5 1.0 6 1.0 -

1.- Calculos de los pH [ [ ] ] [ ] Tubo No. 1 [ [ Tubo No. 2 [ [ Tubo No. 3 ] ] ] ]

---

0.25 ---

0.25 ---

[ [ Tubo No. 4

] ]

i. ii.

+ Precipitacin. --- No hay precipitacin

[ [

] ]

PRACTICA N 3 PRECIPITACIN, SEPARACIN Y PUNTO ISOELCTRICO DE PROTENAS. Gutirrez Gutirrez Joab Yosafat Nava Rodrguez Mario Eduardo Grupo: 4QM2 Seccin: 3 Laboratorio: 5

Precipitacin por metales pesados

Tubo No. 5 ( ) [ ]

ANLISIS DE RESULTADOS Separacin de protenas por precipitacin con sales (salting out). Al realizar las pruebas de Biuret nos dio positivo en el primer filtrado y primer precipitado debido a que no se realizo ningn tratamiento de separacin de protenas por lo tanto las protenas seguan presentes en ambas soluciones. El realizar la 2 prueba de Biuret nos dio positivo en ambas tambin esto se debi a que la filtracin no se llevo a cabo por el uso de papel filtro con poros muy grandes y por lo tanto el filtrado contena la misma cantidad de protenas con y sin filtrado. Precipitacin por efecto del pH y de solventes. En las pruebas de precipitacion el precipitado se present mayor junto con una turbidez de la solucin al agregar Acido clorhdrico esto se debi a que se cambio si minimo de solubilidad con el

De las pruebas realizadas, las soluciones que contenan mercurio, plata y plomo precipitaron unos con turbidez como con la solucin de nitrato de plata y la de cloruro mercrico y en la solucin de acetato de sodio se observo una precipitacin mayor a todas las dems, esto se debe a que los metales pesados desnaturalizan las protenas; En las muestras con bario, sodio y agua no presento precipitacin en ninguna de las tres por que estos compuestos no son de metales pesados si no de metales alcalinos y alcalino trreos. Punto isoelctrico de la insulina En el experimento realizado se llego al punto isoelctrico de la insulina haciendo cambios de pH con una solucin reguladora en la cual se observo un precipitado en el tubo tres el cual se encontraba a un pH de 5.4 se noto que era el punto isoelctrico debido a que fue el nico que se presento un precipitado en el tubo donde se realizo la prueba.

DISCUSIN DE RESULTADOS. Separacin de protenas por precipitacin de sales El proceso de separacin por precipitacin de sales se lleva a cabo por la fuerza inica de sales neutras con la cual disminuye la solubilidad de las protenas, en base a una competencia entre la protena y los iones de la sal por el agua, en base a nuestros primeros resultados nos dio positivo en la presencia de protenas por la reaccin de Biuret debido a que no se realiz la saturacin con la sal, en los segundos resultados nos dio positivo pero este resultado nos debi salir negativo en el filtrado debido a que se saturo con la sal, pero el hecho de que nos haya dado un resultado positivo se debi a que no se pudo filtrar por la falta de papel filtro necesario por lo cual las protenas no se pudieron separar en su totalidad.

pH, al agregar el etanol a 96 el precipitado migro a la mitad del tubo por que los este solvente redujo su constante dielctrica; Al agregarle NaOH a la solucin de albumina no presento precipitacin ni al agregarle el solvente por que el punto isoelctrico de las protenas de la albumina su punto isoelctrico es mayor; Al adicionarle un regulador de acetatos se observo un precipitado menor al de HCl son turbidez de la solucin, pero al agregar el Etanol se aumento considerablemente el precipitado por la modificacin del punto isoelctrico.

PRACTICA N 3 PRECIPITACIN, SEPARACIN Y PUNTO ISOELCTRICO DE PROTENAS. Gutirrez Gutirrez Joab Yosafat Nava Rodrguez Mario Eduardo Grupo: 4QM2 Seccin: 3 CONCLUSIN Precipitacin por efecto del pH y de solventes. Las protenas presentan un mnimo de solubilidad el cual es un valor de pH en el que se lleva a cabo un mnimo de solubilidad conocido esto como punto isoelctrico en base a esto se llegan a precipitar las protenas con ms facilidad, pero este efecto tambin puede ser modificado por la presencia de solventes orgnicos, en las muestras analizadas cuando se agrega el HCl y la solucin reguladora de acetatos se observa una precipitacin la cual se ve aumentada al agregar el etanol debido a que la protena utilizada que buen las albuminas de la clara del huevo su punto isoelctrico es a un pH acido, mientras que al agregar NaOH no se produjo ningn cambio en la solubilidad de la protena. Precipitacin por metales pesados Las Protenas suelen ser precipitadas por soluciones con sales de metales pesados lo cual produce precipitados proteicos que la mayora suelen llevarse a cabo por la desnaturalizacin de las protenas; en las soluciones probadas para la protena de huevo se observo que la precipitacin fue solo de los metales pesados utilizados en la prctica como son las soluciones de Mercurio, plata y plomo, mientras tanto en las soluciones con bario, sodio y el agua no presentaron precipitacin debido a que no son metales pesados si no metales alcalino trreos y alcalinos, o simple agua. Punto isoelctrico de la insulina Punto isoelctrico de una protena es el pH en el cual la protena presenta su mnimo de solubilidad, pH en el cual la carga neta de todos sus grupos disociables es igual a cero, en la prueba realizada se llego al punto isoelctrico de la insulina en un pH de 5.4 que fue en el tubo 3 en cual fue en el nico que precipito la insulina. El punto isoelctrico de la protena es la clave para poder iniciar el estudio de la misma, el manipularlo nos permite su extraccin de sustancias X, su purificacin (en ocasiones) y nos ayuda a su estudio. PREGUNTAS EXTRA 1.- Qu es la constante dielctrica? Propiedad de tipo macroscpica, de un medio que no posee conductividad elctrica, por lo cual se tratan como aislantes de la electricidad, relacionndolo con la permitividad que tiene un medio a la electricidad. 2.- Cules son las funciones de las protenas en general? Estructurales, de transporte, regulador, regulador de pH, de reserva, catalizadores, contraccin muscular, movilidad, protector, lubricante, como anticoagulante. 3.- Por qu ser peligroso que en los cuerpos de agua haya metales pesados? Porque los metales pesados precipitan y desnaturalizan las protenas y dichas protenas son de gran importancia biolgica en base a nivel de membrana o de tejidos. BIBLIOGRAFA Laboratorio: 5

Donald Voet, Judith G. Voet. 2004 Bioquimica 3ra edicion Editorial Panamericana Pags. 79-86. Lehninger, A,L. PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. Editorial Omega, Espaa, pp. 134-146.