Aula de

Termodinmica de Sistemas Biomoleculares

Tema:
Eletroforese

Prof. Dr. Jlio Csar Borges
Depto. de Qumica e Fsica Molecular DQFM
Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Eletroforese
Movimento de partculas carregadas num campo eltrico externo.
- Tcnica que se baseia no uso das cargas eltricas das biomolculas (DNA, RNA e
Protenas) para separar e analisar as suas propriedades fsico-qumicas.
Alta resoluo de separao depende do meio e da partcula

Introduo
Uma partcula de carga Z em um campo eltrico E experimenta a fora F


A partcula carregada no campo eltrico sofre a ao contrria da frico (f = coeficiente
friccional), que proporcional velocidade v da partcula no meio.
No estado-estacionrio movimento constante

Logo
ZE F =
f
ZE
v vf ZE = =
vf ZE F = = 0
Eletroforese
A Mobilidade Eletrofortica de partculas carregadas num campo eltrico externo e
constante, definido como , a velocidade da molcula por unidade de campo eltrico.



- Princpio terico de todos os mtodos eletroforticos
proporcional razo z/f
z depende da relao pI da molcula versus pH da soluo
f = coeficiente friccional depende das condies experimentais




Portanto, a migrao de uma partcula num campo eltrico dependente:
da carga Z e coeficiente f , portanto depende tambm da Massa molecular M

/V.sec) (cm
2
f
Z
E
v
= =
q t q t
H
R r f 6 6 = =
H A
R N
RT
f
kT
D
6
= =
3 / 1
4
3
|
|
.
|

\
|
=
A
bar
sph
N
V M
R
t
f
ZE
v =
Eletroforese de Protenas
Fase estacionria Gel de poliacrilamida
- Forma polmero com uma rede entrelaada ou entrecruzada
- Formado pela reao radicalar entra Acrilamida-Metilenobisacrilamida
- Necessita de Persulfato de amnio e TEMED
Eletroforese de Protenas
Gel de poliacrilamida Montado entre duas placas de vidro
- Soluo estoque de Acrilamida/Bisacrilamida 30%/2,7%
Acrilamida txico para o Sistema Nervoso Central e Cancergeno
- Gel de corrida fase de separao das protenas
- Gel de concentrao fase de aplicao das amostras pente
Qualidade do Gel depende
- Qualidade da Acrilamida/Bisacrilamida
(Pureza);
- gua deionizada (sem metais pesados);
- Armazenamento da soluo em vidro mbar
(evitar reao Fotoradicalar);
- Deaerao;
- Tempo de armazenamento do gel;
- Temperatura;
- Etc.
Eletroforese de Protenas
Em condies no-desnaturantes, a separao depende da Z da protena
Dependendo da relao do pI versus pH, a Z protena pode ser + ou
- pI pH no qual o somatrio das cargas igual a 0
- Funciona para DNA/RNA Z total negativo independente do pH
Protena + migra para o plo Protena migra para o plo +
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH
No net
charge
Increasing
cationic
Increasing
anionic
Net positive charge
Net negative charge
+
Eletroforese de Protenas
Importncia do gel de empacotamento
- Evitar a difuso das amostras de protenas
Concentrao de Acrilamida/Bisacrilamida
- Gel de Empacotamento 5% em Tris-HCl pH 6,8 (mais poroso)
- Gel de separao 8-15% em Tris-HCl pH 8,8
Alta concentrao de ons cloreto
Tampo de Corrida Tris-Glicina (sistema tampo descontnuo)
Os ons cloreto tem maior mobilidade do que a Glicina no pH 8.5
- Formao de uma banda tnue na zona de transio entre os gis de # [acrilamida]
Eletroforese de Protenas
Eletroforese de Protenas
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presena de SDS
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis
Interao da protena com SDS deixa a protena com Z total Negativa
SDS
Molcula anfiptica
Desnatura a protena na formao de complexo
SDS:Protena
1,4g SDS/1g de protena
Z total negativa ser proporcional ao tamanho da
protena
Rateio Z/M ser aproximadamente constante (ou f)
para protenas de M diferentes
- Densidade de carga Z constante
SDS interage mais com a parte hidrofbica da
protena
SDS-PAGE
Permite separao baseada na filtrao molecular da protena na peneira formada pelo
polmero entrecruzado de Acrilamida-Bisacrilamida
SDS-PAGE
Permite anlise direta da M em funo do mobilidade eletrofortica (RF)
SDS normaliza efeitos devido ao formato da partcula, pois desnatura a protena
Curva padro deve ser corrida nas mesmas condies experimentais
- mesmo gel preferencialmente
SDS-PAGE
- Log da M versus RF
b RF a M + = ) ( log
b x a y + = ) (
b RF a
e M
+
=
) (

SDS-PAGE
Padres de M
Porosidade do gel depende da concentrao de acrilamida-bisacrilamida

Gradient gel maker
SDS-PAGE
Interferncias na determinao da M

Resistncia desnaturao qumica e trmica
-Efeitos da forma da partcula Menor interao com SDS
- Menor densidade de carga Z Reduz fora Motriz
- Migrao anormal aumenta M
App

Degradao devido desnaturao trmica (principalmente)
Necessidade de agentes redutores
Presena de glicosdeos
Presena de grupos PO
4
3-
Protena muito carregada negativamente (pI cido)
- Reduz o nmero de molculas de SDS por protena repulso entre cargas
- Menor densidade de carga Z Reduz fora Motriz
- Migrao anormal aumenta M
App
Protena muito carregada positivamente (pI bsico)
- Grupos positivos agem como fator de resistncia Reduz fora Motriz
- Migrao anormal aumenta M
App
Sistemas de SDS-PAGE
- BioRad
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao

Colorimtricos
Colorao com Comassie Brilliant Blue RG-250
- Limite de deteco ~0,1-1,0 g de protena
Impregnao por Prata (2000 x mais sensvel)
- Limite de deteco ~10-100 ng de protena

Comassie Brilliant Blue
Impregnao por Prata
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao
Radiomtricos
- Protenas ou DNA/RNA marcadas com radioistopos
- Uso de sondas de DNA/RNA marcadas com radioistopos
Requer:
1) Transferncia da amostra do gel
2) Imobilizao das molculas numa membrana
de nitro-celulose
3) Incubao com a Sonda
4) Exposio ao filme fotogrfico
Southern Blot - DNA
Northern Blot - RNA
Western Blot - Protenas
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao
Imunolgicos
- Deteco intermediada por um anticorpo ou outra sonda especfica
- Deteco do anticorpo que interagiu especificamente com a protena de interesse
- Anticorpos marcados com radioistopos ou um fluorforo/cromforo
Mtodos Imunolgicos requerem transferncia do gel de poliacrilamida
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao
Fluorescncia
- Necessita de um fluorforo ligado molcula
Protena:
corante cianina
DNA:
Brometo de Etdio
- Intercalao na dupla hlice
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao
Fluorescncia Necessita de um fluorforo ligado molcula
Seqenciamento de DNA mtodo de didexi-ribonucleotdeos
Fluoricenas ligadas aos diferentes ddNTP
Eletroforese
Seqenciamento de DNA mtodo de didexi-ribonucleotdeos
Fluoricenas especficas ligadas aos diferentes ddNTP que emitem luz em diferentes
Eletroforese
Mtodos de deteco/visualizao

Quantificao
A quantidade de uma determinada banda em uma eletroforese pode ser estimada
- Anlise das bandas por densitometria
Uso de padres quantitativos
- Curva padro
rea sob a curva densitomtrica proporcional quantidade