ESTRATEGIAS PARA INCREMENTAR LA PRODUCCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN CULTIVOS DE CLULAS VEGETALES

STRATEGIES FOR THE IMPROVEMENT OF SECONDARY METABOLITES PRODUCTION IN PLAN CELL CULTURES Mario Arias Zabala1; Mnica Juliana Angarita Velsquez2; Ana Maria Aguirre Cardona3; Juan Manuel Restrepo Flrez4 y Carolina Montoya Vallejo5
Resumen. El cultivo de clulas vegetales ha surgido como una alternativa para la obtencin de metabolitos de alto valor agregado, producidos en las plantas en bajas concentraciones y para los cuales, no existen procesos de sntesis qumica conocidos; sin embargo, para la implementacin de esta tecnologa es necesario el desarrollo de estrategias que permitan incrementar la productividad de los cultivos in vitro. En este trabajo se discuten diferentes alternativas planteadas para lograr este objetivo: en la primera parte se presentan las formas para obtener lneas celulares sobreproductoras, abordando las estrategias clsicas de seleccin y la ingeniera gentica; posteriormente se discuten los efectos que sobre el crecimiento y la produccin de metabolitos secundarios pueden tener la composicin qumica del medio de cultivo y las condiciones fsicas en las que se conduce el proceso; finalmente, se presenta la elicitacin como alternativa para inducir la sntesis de metabolitos secundarios en cultivos de clulas vegetales.
Palabras claves: Produccin de metabolitos secundarios, clulas vegetales, metabolismo secundario, cultivo in vitro, optimizacin de produccin.

Abstract. The strategy of plant cell culture has become an alternative for the production of high value metabolites that are normally produced in low levels in plants and for which there is not chemical synthesis processes known. However, for the implementation of this technology it is necessary to develop strategies that let us improve the productivity of the in vitro cultures. In this work, different alternatives in order to fulfill that objective are presented: in the first part, the strategies to obtain overproducer cell lines are discussed, showing the clasic strategies for cell line selection and genetic engineering as alternatives; after that, the efect over the growth and secondary metabolite productition of the chemical medium composition and physical conditions of the process are reviewed; finally, the elicitation is presented as an alternative to induce the synthesis of secondary metabolites in plant cell cultures.
Key words: Secondary metabolites production, plant cells, secondary metabolism, in vitro culture, production optimization

Por mucho tiempo los seres humanos han usado las plantas como fuente de fragancias, saborizantes y medicinas; usualmente estos compuestos cumplen un rol ecolgico mediando la interaccin de la planta con su ambiente, encontrndose generalmente en muy bajas concentraciones, por lo cual se hace necesario utilizar gran cantidad de material vegetal para obtener cantidades significativas del compuesto de inters (Foley y Moore, 2005). Tradicionalmente el aprovechamiento de estos compuestos ha estado determinado por la capacidad de disear procesos de extraccin efectivos para las

molculas de inters; sin embargo, durante la ltima mitad del siglo pasado surgi la alternativa del cultivo de clulas vegetales para obtener estas molculas sin necesidad de utilizar la planta completa. La utilizacin de esta estrategia para la produccin de metabolitos secundarios, requiere la determinacin de las condiciones de produccin ptimas, as como el empleo de metodologas como la ingeniera gentica y/o la elicitacin con el fin de incrementar la produccin de los metabolitos de inters. Sin embargo, dificultades asociadas con el escalado, han hecho que la utilizacin comercial de esta tecnologa est aun limitada a unos pocos procesos (Tabla 1).
Medelln, Colombia. Medelln, Colombia. A.A. 3840. Medelln, Medelln, Colombia. Medelln, Colombia.

1 Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Facultad de Ciencias. A.A. 3840. <marioari@unalmed.edu.co> 2 Investigadora. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Facultad de Ciencias. A.A. 3840. <mjangari@unalmed.edu.co> 3 Estudiante Maestra en Biotecnologa. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Facultad de Ciencias. Colombia. <amaguir@unalmed.edu.co > 4 Investigador. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Facultad de Ciencias. A.A. 3840. <jmrestr1@unalmed.edu.co> 5 Investigadora. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln. Facultad de Ciencias. A.A. 3840. <cmontoy0@unalmed.edu.co>

Recibido: Mayo 12 de 2008; Aceptado: Abril 15 de 2009 Rev.Fac.Nal.Agr.Medelln 62(1): 4881-4895. 2009

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Tabla 1. Algunos metabolitos producidos industrialmente por cultivo de clulas vegetales Metabolito Camptothecina Shikonina Podofilotoxina Taxol Gineseng Berberina Especie vegetal Camptotheca acuminata Lithospermum erythronium Podophyllum hexandrum Taxus sp Panax ginseng Coptis japonica Estrategia de cultivo Hairy root Suspensin Hairy root Suspensin Suspensin Suspensin

En este trabajo se presentan las principales estrategias empleadas para incrementar la produccin de metabolitos secundarios en un cultivo in vitro de clulas vegetales, el material presentado recoge los resultados de investigaciones publicadas durante los ltimos 10 aos.

de produccin y estabilidad (Drnenburg y Knorr, 1995), subcultivando slo aquellas que presentan la caracterstica de inters (Qu et al., 2006;Trejo, 2008).

Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos secundarios. Seleccin y mejoramiento de la lnea celular. La primera estrategia para lograr una lnea celular altamente productora de un metabolito es la seleccin adecuada de la fuente de explante; recomendndose el uso de una parte de la planta en donde normalmente se halla observado la acumulacin del metabolito, pues se ha demostrado que lneas obtenidas de diferentes partes de la planta, presentan productividades diferentes de metabolitos secundarios (Oncina et al., 2000; Fedoreyev et al., 2000). Una vez establecido el cultivo in vitro se debe seleccionar la lnea celular con base en su velocidad de crecimiento, niveles

Ingenieras gentica y metablica. Las ingenieras gentica y metablica son estrategias efectivas para optimizar la produccin de metabolitos secundarios; en la Tabla 2, se nota el importante efecto de aplicar este tipo de metodologas en la produccin de ciertos metabolitos, logrando incrementos importantes en la produccin como puede verse en el caso de la apigenina por Saussurea involucrata donde se logra un incremento del 542% (Drnenburg y Knorr, 1995); el desarrollo de estas tcnicas ha venido cobrando un papel cada vez mas importante en la produccin de metabolitos secundarios y es de esperarse una creciente aplicacin de las mismas. Las estrategias tradicionales son fundamentalmente tres: el incrememento del flujo por una ruta biosinttica, el incremento en el nmero de clulas productoras y la inhibicin de la degradacin de los productos de inters.

Tabla 2. Efecto de la ingeniera metablica en el incremento de la produccin de metabolitos secundarios.

Estrategia de Ingeniera Gentica utilizada Estrategia de cultivo contenido producto (%)

Especie

Metabolito

Referencia

Saussurea involucrata Medicago sativa Catharanthus roseus

Apigenina Isoflavonoides Serpentina

Insercin de promotor fuerte RNA antisentido e insercin promotor fuerte Insercin de promotor fuerte

Hairy roots Planta completa Hairy roots

542 Aparicin del metabolito 170

Li et al., 2006 Deavours y Dixon, 2005 Hughes et al., 2004

contenido producto (%): cambio porcentual en la concentracin del metabolito en comparacin con el cultivo antes de aplicar la estrategia de ingeniera gentica indicada. El incremento en el flujo a travs de la ruta biosinttica puede lograrse insertando promotores fuertes a las enzimas de la ruta, lo cual lleva a una sobreexpresin de las mismas y eventualmente a una mayor produccin del metabolito de inters (sin embargo a veces lo que
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se logra es disminuir la viabilidad celular debido a una perturbacin del metabolismo) (Petersen, 2007); otra forma de incrementar el flujo es modificando las enzimas de la ruta de inters para que stas no presenten inhibicin feedback, este hecho requiere un
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conocimiento estructural de la enzima involucrada y del mecanismo de accin de la misma, anteriormente era por tanto considerablemente difcil tener esta informacin disponible, sin embargo, cada vez ms la disponibilidad de datos estructurales es mayor, lo que permite con ms facilidad tomar decisiones de mutagnesis encaminadas a la disminucin de la inhibicin de una enzima o inclusive al incremento de la rata de reaccin de la misma; finalmente otra forma de aumentar el flujo por una ruta, es bloqueando las rutas competitivas; por ejemplo, mediante ARN antisentido, una tecnologa basada en el hecho de que las clulas no reconocen como propio un ARN de doble cadena, tal que cuando detectan la presencia del mismo lo destruyen; de manera muy sucinta, en esta metodologa lo que se hace es insertar un plsmido tal que cuando se realiza la transcripcin del mismo, se forma un dmero de ARN (el cual tiene la secuencia de la enzima que se quiere bloquear), este ARNdc es reconocido por una enzima conocida como dicer la cual lo corta en pequeos fragmentos de longitud entre 21 y 25 pares de bases (ARNsi) estos fragmentos se enlazan con un complejo proteico de silenciamiento llamado RISC el cual tiene la habilidad de reconocer secuencias de RNA mensajero (similares a las de ARNsi asociado que tiene) y degradarlas, de este modo se ha logrado la inhibicin de la sntesis de la protena para la que codifica el ARN antisientido. Esta metodologa ha sido probada con xito en especies como Coffea arabica y Papaver somniferum; la desventaja del uso de esta tcnica, es el desconocimiento del metabolismo vegetal, de modo que un cambio pequeo puede acarrear consigo importantes consecuencias. La segunda estrategia es incrementar el nmero de clulas productoras, lo que podra lograrse a travs de la manipulacin de la diferenciacin celular; sin embargo, este conocimiento es an muy precario logrndose apenas la diferenciacin en races (como se discute ms adelante), lograr diferenciacin en otro tipo de especializaciones celulares, es an una tarea compleja y de poca aplicacin industrial en el corto plazo. La tercera estrategia consiste en inhibir la degradacin de los productos, lo que se logra provocando un descenso en el catabolismo, siendo particularmente efectivo el bloqueo de enzimas relacionadas con la degradacin del metabolito de inters (Yeoman y Yeoman, 1996); la estrategia para bloquear estas enzimas puede igualmente ser el ARN antisentido.
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Recientemente se ha comenzado a explorar la posibilidad de utilizar factores de transcripcin como blancos de la ingeniera metablica, los factores de transcripcin son protenas ADN especficas que interactan con las regiones promotoras de los genes, modulando la tasa de iniciacin de la transcripcin por la ARN polimerasa II, lo importante es que genes que se regulan coordinadamente frecuentemente tienen sitios similares de enlace para los factores de transcripcin en sus promotores, de este modo, al usar un factor de transcripcin como blanco se est afectando toda la ruta pues usualmente estos controlan mltiples pasos de la misma (Petersen, 2007; Verporte y Mamelink, 2002) evitando de este modo el problema de identificar los pasos limitantes (Broun, 2004). Es importante anotar que a la fecha, ya son conocidos factores de transcripcin relacionados con ciertas rutas metablicas, es por ejemplo sabido que los factores de la familia proteinca ORCA, estn relacionados con la biosntesis de alcaloides indlicos en Catharanthus roseus. Otra estrategia que se sale de las aproximaciones tradicionales es la transgnesis de genes de plantas en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, esto tiene importantes ventajas sobre el cultivo de clulas vegetales, fundamentalmente por las altas tasas de crecimiento, la baja sensibilidad al estrs de corte y el conocimiento tanto de las condiciones de cultivo como para la expresin de genes heterlogos en las mismas; aproximaciones importantes en esta perspectiva, se han logrado en la produccin de paclitaxel, en este caso se intent realizar la expresin de 5 enzimas consecutivas en la ruta en S. cerevisiae a pesar de que no se logr una produccin elevada de los metabolitos involucrados en la ruta, es importante que en este experimento se obtuvo la expresin de todas las protenas involucradas la mayora de ellas de manera funcional (Broun, 2004); un caso es la produccin de cido artemisico en el cual se logr la produccin exitosa por S. cerevisiae del mismo tal que la produccin fue de 115 mgl-1, cerca de dos rdenes de magnitud mayor que en el cultivo de in vitro de Artemisa annua.

Nutrientes para el medio de cultivo. La dilucidacin de los requerimientos nutricionales de las clulas vegetales se inici el siglo pasado, lo que permiti el desarrollo de medios de cultivo de composicin definida. En todos ellos se encuentran macroelementos, microelementos, vitaminas y fitohormonas; estos componentes son suficientes
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para garantizar el metabolismo de las clulas, que en condiciones de cultivo in vitro son generalmente hetertrofas. Algunos de los medios ms comnmente utilizados son el Murashige-Skoog (MS), LinsmaierSkoog (LS), Gamborg (B5) y Schenk-Hildebrandt (SH). Dado que el metabolismo se ve afectado por la composicin y concentracin de los diferentes nutrientes, es posible inducir cambios en el crecimiento y en la produccin, manipulando el medio de cultivo; cuando se encuentra que las condiciones ptimas de estos procesos son diferentes, es posible desarrollar cultivos en dos etapas, en los que en la primera se utiliza un medio de crecimiento, mientras que en la segunda se emplea uno que induzca la produccin (Raval et al., 2003). A continuacin se detallan diversos efectos que tiene la manipulacin de algunos componentes del medio de cultivo tiene sobre el crecimiento y la produccin de metabolitos secundarios.

estrs nutricional que ocurre cuando se agota en el medio; efecto observado entre otras especies en T. chinensis y P. notoginseng (Wang et al., 1999, Zhang et al., 1996, Sato et al., 1996; Zhong, 2001).

Fuente de carbono. Existen dos formas de manipular la fuente de carbono: variando su naturaleza o su concentracin. En general se utiliza la sacarosa como fuente principal, aunque es posible usar para este mismo fin otros azcares (Chattopadhyay et al., 2002; Prakash y Srivastava, 2005). Se ha encontrado que la concentracin inicial de sacarosa afecta el crecimiento, el consumo de nutrientes y la produccin de metabolitos secundarios (Akalezi et al., 1999); sin embargo, estos efectos son especie especficos y dependen de la lnea celular con la que se est trabajando. En cultivos en suspensin de Taxus chinensis y Panax notoginseng se ha observado que altas concentraciones iniciales de sacarosa alargan la fase de adaptacin de la curva de crecimiento, debido al estrs causado por el incremento en la presin osmtica; mientras que bajas concentraciones iniciales incrementan la velocidad de crecimiento (Wang et al., 1999, Zhang et al., 1996).
La sacarosa adems de actuar como principal fuente de carbono, tambin puede afectar la produccin de metabolitos secundarios, ya sea incrementando el contenido intracelular o la concentracin final del metabolito; su efecto se debe tanto al estrs osmtico que se genera cuando est a altas concentraciones (teniendo en cuenta que las condiciones normales para el medio de cultivo mas comunmente utilizado (MS) son una osmolaridad de alrededor de 140 mmolkg-1 y considerndose altas concentraciones condiciones superiores a los 170 mmol/kg) como al
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Fuente de fosfato. El fosfato es un componente limitante del crecimiento mientras se mantiene en una proporcin menor a la estequiomtrica (Liu y Zhong, 1998). ste est directamente relacionado con el crecimiento y el metabolismo energtico, pues participa en la biosntesis de nucletidos, fosfolpidos y otras biomolculas (Sato et al., 1996). Las concentraciones bajas de fosfato (en las cuales el fosfato esta por debajo de 1,04 mM) pueden llegar a estimular el metabolismo secundario ya sea por la disminucin de la tasa de crecimiento que favorece el flujo de nutrientes hacia la produccin de metabolitos secundarios (Raval et al., 2003, Sato et al., 1996), o por la activacin de enzimas relacionadas con la biosntesis de estos metabolitos (Ramachandra y Ravishankar, 2002). Fuente de nitrgeno. Al igual que el fsforo, el nitrgeno es un componente fundamental para el crecimiento celular pues es utilizado en la sntesis de protenas y cidos nucleicos; ste puede agregarse en forma de fuentes inorgnicas u orgnicas (Yeoman y Yeoman, 1996; Schlatmann et al., 1996). Las fuentes inorgnicas de nitrgeno ms comnmente utilizadas son el nitrato y el amonio que pueden suministrarse simultneamente o de forma individual (Schlatmann et al., 1996; Ramachandra y Ravishankar, 2002); stos afectan el pH del medio, ya que el consumo de nitrato implica una acidificacin, contrario a lo que ocurre cuando se consume el amonio (Schlatmann et al., 1996).
Dos variables que pueden manipularse son la concentracin total y la relacin nitrato/amonio; se ha encontrado que ambas afectan tanto el crecimiento como la produccin de metabolitos secundarios (Yeoman y Yeoman, 1996; Ramachandra y Ravishankar, 2002). En P. quinquefolium (Zhong y Wang, 1998) y en Azadirachta indica (Prakash y Srivastava, 2005) se ha visto que altas relaciones nitrato/amonio (encima de la relacin 1 a 1), favorecen tanto el crecimiento como la produccin de metabolitos, encontrndose el mejor resultado cuando el nitrato es la nica fuente de nitrgeno, pues el amonio resulta inhibidor del crecimiento y de la produccin; diferente a lo que se ha observado en la obtencin de antocianinas a partir de F. ananassa, donde la presencia tanto de nitrato
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como de amonio resulta indispensable para obtener altos niveles de crecimiento y produccin antocianinas (Sato et al., 1996). El nitrgeno puede actuar como un nutriente limitante del crecimiento hasta una concentracin crtica en el medio de cultivo (alrededor de 10 mM pero con cambios entre especies), como se observa en F. ananassa, donde adems estimula la produccin de antocianinas cuando sus niveles se mantienen en un rango cercano a dicha concentracin (10 mM) (Sato et al., 1996), probablemente porque los nutrientes del metabolismo primario se desvan a la formacin de metabolitos secundarios (Raval et al., 2003); sin embargo, tambin se ha observado que altas concentraciones de ste (alrededor de 80 mM) pueden resultar inhibitorias para el crecimiento y/o la produccin de metabolitos secundarios (Zhong y Wang, 1998).

Microelementos. Existen muchos iones inorgnicos importantes para el metabolismo celular que son agregados al medio de cultivo en forma de sales y que pueden afectar de manera diferente el crecimiento y la acumulacin de metabolitos secundarios. Se han encontrado tres mecanismos por los cuales estos compuestos pueden estimular la produccin cuando

es incrementada su concentracin en el medio de cultivo: favoreciendo el aumento en la concentracin de biomasa, si el micronutriente limita el crecimiento (Liu y Zhong, 1996); elicitando la sntesis del metabolito de inters mediante el incremento de la presin osmtica en el medio (Kartosentono et al., 2002) y/o incrementando la disponibilidad de cofactores enzimticos cuando acta como grupo prosttico, observndose en los dos ltimos casos, un incremento en el contenido intracelular del metabolito (Huang et al., 1995); sin embargo, es importante tener en cuenta que el incremento en la presin osmtica puede tener en algunas ocasiones efectos negativos sobre el crecimiento celular y/o la produccin de metabolitos secundarios, en la Tabla 3 se muestra el resultado de modificar la concentracin de ciertos micronutrientes en la produccin de metabolitos secundarios y el crecimiento de ciertas especies, ntese que al hacer uso de esta estrategia se observan incrementos de cmo mximo el 58% con respecto al valor de referencia, un incremento mucho mas moderado que el que se puede lograr haciendo uso de ingeniera gentica en el que se logran incrementos de hasta el 542%; sin embargo, este tipo de experimentos son sencillos de conducir y pueden formar parte de una estrategia combinada para obtener un determinado metabolito de inters.

Tabla 3. Resultados obtenidos en la produccin de metabolitos secundarios, al aumentar la concentracin de algunos micronutrientes. En la tabla se muestran las concentraciones en las que se obtuvieron los mximos de produccin.
Nutriente K+ Concentracin utilizada e incremento 60 mM 10 uM Cu2+ 1 uM 5 uM Co2+ 5 uM 2 uM 10 uM 5 uM 150 uM 35 uM 500 uM 500 uM 25 uM Especie Metabolito Saponina Saponina Captotecina Betalainas Betalainas Captotecina Captotecina Betalainas Captotecina Betalainas Captotecina Betalainas Captotecina contenido producto (%) 58 ~0 65 23 54 76 58 16 -44 27 -29 -3 79 biomasa/l (%) ~0 22 13 13 8 10 7 4 4 4,52 -7 8 -7 Referencia Liu y Zhong, 1996 Zhong y Wang, 1996 Pan et al., 2004 Trejo et al., 2001 Trejo et al., 2001 Pan et al., 2004 Pan et al., 2004 Trejo et al., 2001 Pan et al., 2004 Trejo et al., 2001 Pan et al., 2004 Trejo et al., 2001 Pan et al., 2004

Panax ginseng Panax notoginseng Camptotheca acuminata Beta vulgaris Beta vulgaris Camptotheca acuminata Camptotheca acuminata Beta vulgaris Camptotheca acuminata Beta vulgaris Camptotheca acuminata Beta vulgaris Camptotheca acuminata

Mo2+

Zn2+

Fe2+ I
-

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En el caso del hierro, adems de su concentracin, se ha estudiado el efecto de diferentes fuentes del mismo; ste se suministra generalmente en forma de Fe-Na-EDTA, pero tambin existen formas alternativas para agregarlo al medio, como el citrato y el sulfato frricos. Al ser suministrado como Fe-Na-EDTA se observa que favorece el crecimiento, pues en esta forma es ms asimilable por la clula; sin embargo, el EDTA acta como agente quelante disminuyendo la disponibilidad de cofactores inicos y por lo tanto, en ocasiones se obtiene un mayor contenido intracelular de metabolitos secundarios con suplementos alternativos como el citrato (Huang et al., 1995). contenido producto (%): cambio porcentual en la concentracin del metabolito en comparacin con el cultivo antes de aumentar el micronutriente sealado. biomasa/l (%): cambio porcentual en la concentracin de biomasa en comparacin con el cultivo antes de aumentar el micronutriente sealado.

y lnea celular, afectan el crecimiento y el metabolismo secundario (Kim et al., 2007). En algunos casos las auxinas pueden inhibir el metabolismo secundario, como el 2,4-D en la produccin de saponinas y alcaloides indlicos en cultivos de P. quinquefolium (al agregarlo cae la produccin 85%) (Zhong et al., 1996) y C. roseus (al agregar 2,4 D cae la produccin 70%) (Yahia et al., 1998) respectivamente; mientras que en otros casos lo pueden favorecer, como el IBA en la biosntesis de saponinas en P. quinquefolium (incremento de aproximadamente un 5%) (Zhong et al., 1996), el IAA en la biosntesis de L-DOPA por Stizolobium hassjoo (Huang et al., 1995) y el 2,4-D en la produccin de antocianinas por Camptotheca acuminata (al agregarlo se logra un incremento cercano al 40 en la produccin) (Pasqua et al., 2005).

Fitohormonas. Las fitohormonas son compuestos sintetizados por la planta que pueden actuar a bajas concentraciones, mediando procesos de sealizacin relacionados con el crecimiento, la diferenciacin o la respuesta a factores ambientales. stas tienen diversos efectos que pueden llegar a afectar el crecimiento, el patrn de consumo de nutrientes, la acumulacin intracelular y la produccin de metabolitos secundarios (Zhong et al., 1996). Estudiando la composicin hormonal del medio se han logrado en P. quinquefolium incrementos en el contenido de metabolitos superiores hasta en un 70% con respecto a cultivos control y en otras especies como se seala mas adelante incrementos de hasta un 500%, el problema en este tipo de estrategia es encontrar el tipo de hormona que afecta la produccin del metabolito de inters; otro factor importante es que el efecto hormonal depende tambin del medio de cultivo y de la presencia de otras hormonas, tal que para ser exitoso deben combinarse todos estos factores para obtener un efecto significativo. Auxinas. Las auxinas sintetizadas por la planta se derivan del triptfano y cumplen diversas funciones en la regulacin del crecimiento y el metabolismo; la ms destacada de ellas es la estimulacin de la elongacin celular. En cultivos in vitro son utilizadas en la induccin de callos y suelen agregarse en el medio de mantenimiento de suspensiones, donde dependiendo de su tipo, concentracin y de la especie
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Citoquininas. Las citoquininas son fitohormonas que regulan, a travs de una compleja red de interacciones con las auxinas, con el ambiente y con otras molculas de la planta, diversos eventos entre los que se destaca la mitosis. En cultivos celulares se utilizan, al igual que las auxinas, en la induccin de callos y en los medios de mantenimiento de suspensiones. stas pueden afectar el metabolismo secundario (Zhong et al., 1996), como se ha encontrado en la produccin de alcaloides indlicos por Catharanthus roseus y antocianinas por C. acuminata donde la adicin de BAP (Yahia et al., 1998) y quinetina (Pasqua et al., 2005), han mostrado incrementos en la produccin de 500 y 100% comparados con los controles establecidos en los experimentos. Giberelinas. Las giberelinas se caracterizan por estimular la elongacin y la divisin celular en la planta, no siendo muy utilizadas en cultivos celulares; sin embargo, en su estudio se ha encontrado que pueden inhibir el metabolismo secundario (Yosihikawa et al., 1986) y promover el crecimiento de brotes, razn por la cual han sido utilizadas en embriognesis somtica. cido abscsico. El cido abscsico es una molcula que se sintetiza en la planta, mediando la respuesta a situaciones de estrs ambiental; ste puede estimular la produccin de metabolitos secundarios como es el caso del paclitaxel en cultivos de T. chinensis (Luo et al., 2001). Etileno. El etileno es una molcula pequea que difunde fcilmente a travs de la membrana celular; en la planta participa en fenmenos de maduracin,
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abscisin y respuesta a patgenos. En los cultivos celulares se utiliza para inducir la produccin de metabolitos secundarios; puede suministrarse para que acte extracelularmente cuando es alimentado con la fase gaseosa o para que acte a nivel intracelular cuando se agrega al medio, el precursor cido 1-aminociclopropano-1carboxlico (ACC) que es transformado en el citoplasma a etileno por la enzima ACC oxidasa (Jeong et al., 2006, Bae et al., 2006). En cultivos de C. roseus (Yahia et al., 1998) y Lithospermum erythrorhizon se ha observado que el etileno extracelular induce la produccin de alcaloides indlicos y shiconina respectivamente, proponindose que acta a travs de una red de sealizacin en la que intervienen protenas receptoras de membrana, que pueden activar enzimas del metabolismo secundario como la polifenol oxidasa (importante en la biosntesis de shiconina) (Touno et al., 2005). Adems, en suspensiones de T. chinensis se encontr que el etileno suministrado en la aireacin es un factor determinante para el escalado de la produccin de taxanos (Pan et al., 2000). El etileno intracelular acta en los cultivos de clulas vegetales induciendo o inhibiendo el metabolismo secundario; en C. roseus, se ha observado una disminucin en la produccin de alcaloides indlicos (Yahia et al., 1998), contrario a lo que ocurre en L. erythrorhizon donde, al igual que el etileno extracelular, estimula la acumulacin de shiconina (Touno et al., 2005).

roseus media la activacin de protenas quinasas necesarias para la produccin de alcaloides indlicos (Xu y Dong, 2005). Precursores. Un precursor es una molcula que interviene en la ruta biosinttica de un metabolito, por tanto puede agregarse al medio de cultivo para incrementar el rendimiento del proceso. En la Tabla 4 se nota como si se seleciona un precursor adecuado, se pueden lograr incrementos en el contenido de metabolitos secundarios de hasta un 380%; es importante anotar que un precursor es ms eficiente mientras su estructura ms se asemeje a la del producto de inters; sin embargo, hacer muy similar un precursor a su producto resulta tambin mas costoso (Yeoman y Yeoman, 1996). Adems de las desventajas econmicas que implica la adicin de precursores especficos, en algunos casos no se da su absorcin por las clulas, no se logra su ubicacin intracelular adecuada o resultan txicos, an en bajas concentraciones (Yeoman y Yeoman, 1996). Un ejemplo del uso exitoso de precursores por su efectividad y bajo costo es la L-fenilalanina (Phe), para la produccin de fenilpropanoides y flavonoides (Edahiro et al., 2005). Los precursores pueden alimentarse una sola vez al principio del cultivo o de manera repetida, esta ltima estrategia permite mantener la concentracin de ste constante y ha mostrado ser ms eficiente que la primera en la induccin de la produccin de metabolitos secundarios, en la produccin de antocianinas en Fragaria x ananasa se observ que aplicando alimentacin repetida del precursor se obtena una acumulacin 81% mayor que cuando la aplicacin se haca solo al proncipio del cultivo (Edahiro et al., 2005).

xido ntrico. El xido ntrico es una molcula que tambin difunde fcilmente por la membrana celular (Crawford y Guo, 2005). ste afecta la produccin de metabolitos secundarios, por ejemplo, en C.

Tabla 4. Efecto de algunos precursores sobre la produccin de metabolitos secundarios en cultivos celulares cuando se agregan al principio del cultivo Especie Precursor Fenilalanina Colesterol Fenilalanina Metabolito Antocianinas Solanidina Antocianinas contenido producto (%) 200 383,33 81,82 Referencia Edahiro et al., 2005 Lee et al., 2007 Edahiro et al., 2005

Fragaria x ananassa Solanum lyratum Fragaria x annanasa

contenido producto (%): Cambio porcentual en el contenido de producto en comparacin con el cultivo realizado sin la adicin de precursor.

Composicin de la fase gaseosa. La composicin y concentracin de los gases en el medio, es determinante en el crecimiento y la formacin de productos; stas dependen de varios factores, entre
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ellos la temperatura, la presin, la velocidad de flujo de aireacin y la composicin en la fase gaseosa. La aireacin no slo se encarga de suplementar el oxgeno necesario en los cultivos, sino tambin
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de incrementar la homogenizacin del medio y de desorber metabolitos voltiles como el CO2 y el etileno (Han y Zhong, 2003; Trung et al., 2006), que junto con el oxgeno, pueden afectar el crecimiento y la produccin de metabolitos secundarios. El oxgeno es un componente fundamental para los cultivos aerobios pues acta como aceptor final de electrones en la fosforilacin oxidativa (Schlatmann et al., 1996, Zhong, 2002). Se ha encontrado que favorece el crecimiento celular, cuando es empleado hasta cierto valor de su concentracin, despus del cual tiene efectos inhibitorios debido al estrs oxidativo (este valor es de 36 kPa en P. notoginseng pero puede variar entre especies y lneas celulares) (Han y Zhong, 2003; Trung et al., 2006), que se caracteriza por un incremento en la produccin de H2O2 y especies reactivas de oxgeno (ROS), las cuales activan endonucleasas encargadas de degradar el ADN (Han y Zhong, 2003); sin embargo, en algunos casos este efecto ha favorecido la acumulacin de metabolitos secundarios ya que las ROS tambin pueden desencadenar reacciones que simulan la respuesta a patgenos, como sucede en la produccin de paclitaxel por T. chinensis y alcaloides indlicos por C. roseus (Han y Zhong, 2003). Cuando el oxgeno es suministrado a concentraciones que estn por debajo de los requerimientos del cultivo, tanto el crecimiento como la produccin de metabolitos secundarios se ven disminuidos (Han y Zhong, 2003; Trung et al., 2006, Honda et al., 2002). El CO2 por su parte se considera el principal producto gaseoso resultante del crecimiento, el cual puede actuar como nutriente esencial en cultivos fotomixotrficos o fotosintticos (Han y

Zhong, 2003). En algunos casos el CO2 no tiene efecto alguno sobre el crecimiento y la produccin, mientras que en otros, acta como una hormona (Lee y Shuler, 2005). A pesar de que no se conoce su mecanismo de accin, se ha observado que el aumento en su concentracin puede disminuir el crecimiento, alargar la fase de adaptacin, o causar la fenolizacin de las clulas. Sin embargo, su efecto puede depender tambin de la concentracin de oxgeno en el medio, disminuyendo la acumulacin y produccin de metabolitos secundarios (Lee-Parsons y Shuler et al., 2005 ).

Condiciones fsicas para cultivos celulares. Adems del ambiente qumico del cultivo, es importante conocer los efectos que las condiciones fsicas tienen tanto sobre el crecimiento como sobre la produccin de metabolitos secundarios. Temperatura. La temperatura es un factor importante en el cultivo de clulas vegetales, pues juega un papel fundamental en la estabilidad de las protenas, en la activacin de la transcripcin de genes y en los procesos de transferencia de calor y masa (Yeoman y Yeoman, 1996, Schlatmann et al., 1996). El rango de temperaturas generalmente empleado est entre 15-35 C. La temperatura afecta diferentes variables relacionadas con el crecimiento, como la velocidad especfica de crecimiento, la acumulacin de compuestos intracelulares de reserva (biomasa inactiva) y la velocidad de consumo de oxgeno. La primera es mxima a la temperatura ptima del cultivo (Tabla 5) (Yeoman y Yeoman, 1996; Schlatmann et al., 1996) y las dems variables se han visto favorecidas por el incremento de la temperatura (Schlatmann et al., 1996; Choi et al., 2000).

Tabla 5. Temperaturas ptimas de crecimiento y produccin de metabolitos secundarios de algunos cultivos de clulas vegetales en suspensin.
Especie Producto

Catharanthus roseus Fragaria x ananassa Lavandula vera

Ajmalicina Antocianinas cido rosmarnico

Tptima de crecimiento (C) 27,5 30 30

Tptima de produccin (C) 27,5 15 28

Referencia

Hoopen et al., 2002 Zhang et al., 1997 Georgiev et al., 2004

Se sabe que la temperatura afecta la produccin de metabolitos secundarios, aunque no se conocen con claridad los mecanismos bioqumicos por los que esto ocurre. En primer lugar se ha propuesto que el estrs trmico estimula la produccin (Georgiev et al., 2004),
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generando cambios en los procesos de transduccin de seales al interior de la clula que activan tanto la transcripcin de genes, como enzimas especficas involucradas en la sntesis de estos metabolitos. En segundo lugar, se ha planteado que en los casos en
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Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos

los que se trabaja a una temperatura ptima de produccin diferente a la de crecimiento (Tabla 5), lo que ocurre es un desvo de precursores desde el metabolismo primario hacia el secundario (Georgiev et al., 2004). Es importante anotar que una seleccin adecuada de la temperatura puede tener efectos claves en la acumulacin de metabolitos secundarios, en F. ananasa (Zhang et al., 1997) al seleccionar la temperatura de proceso ptima se logr un mejoramiento en un 300% en produccin de antocianinas y en C. roseus (Hoopen et al., 2002) un incremento del 100% en produccin de ajmalicina.

Presin osmtica. La regulacin de la presin osmtica es importante en cultivos de clulas vegetales ya que adems de mantener el balance hdrico (Kim et al., 2001), afecta el crecimiento y la produccin de metabolitos secundarios. sta puede regularse agregando al medio agentes osmticos metabolizables como sacarosa o no metabolizables como manitol, sorbitol y polietilenglicol (PEG). Varios estudios han mostrado que el incremento en la presin osmtica genera tanto la disminucin en la velocidad de crecimiento, como el aumento en la acumulacin intracelular de metabolitos secundarios, probablemente por que el estrs osmtico, imita el estrs por deshidratacin (Kim et al., 2001; Kurata et al., 1998). pH. El crecimiento ptimo de las clulas vegetales en suspensin se encuentra entre un pH de 5,06,0, el cual puede cambiar durante el curso del cultivo ya que generalmente no se controla (Ramachandra y Ravishankar, 2002) y como se explic anteriormente, depende del consumo de nitrato y amonio. Se ha demostrado que cambios en el pH inicial del medio de cultivo pueden afectar la acumulacin de metabolitos secundarios, como es el caso de la produccin de indirubina por suspensiones de Polygonum tinctorium en las cuales la produccin en el pH ptimo alcanza a ser mayor entre un 20% y un 30% comparada con otros pH evaluados (Marero et al., 1997). Iluminacin. Las caractersticas de la irradiacin luminosa, como longitud de onda, intensidad y fotoperiodo, influyen sobre el crecimiento y la produccin de metabolitos secundarios en cultivos celulares hetertrofos de manera especie-especfica (Yeoman y Yeoman, 1996; Chattopadhyay et al., 2002; Zhang et al., 2002; Yu et al., 2005). En algunos
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casos la luz puede actuar como una seal tipo hormonal, requirindose pequeas cantidades para observar su efecto (Zhang et al., 2002); ste puede estar relacionado con fotorreceptores que actan de forma reversible o irreversible, como interruptores que controlan la expresin de genes especficos. Dependiendo de la longitud de onda aplicada se han observado diferentes efectos: por ejemplo, la luz roja estimula el crecimiento de hairy roots de P. ginseng, mientras que otras longitudes de onda como la azul lo desfavorecen. A nivel de la produccin se ha propuesto que diferentes longitudes de onda activan rutas de sealizacin especficas, lo cual se ha comprobado en cultivos de P. ginseng y de F. ananassa (Yu et al., 2005). La intensidad lumnica puede tener diferentes efectos sobre cultivos irradiados continuamente; as por ejemplo, en suspensiones de Vitis vinifera y C. arabica (Zhang et al., 2002) se observan cambios significativos en la densidad de biomasa con el incremento de esta variable; adems en esta ltima especie, se observan cambios morfolgicos sobre las clulas por la formacin de cloroplastos cuando la intensidad lumnica es incrementada (Zhang et al., 2002). La produccin de metabolitos secundarios tambin puede verse afectada por este factor; por ejemplo, altas intensidades lumnicas (5 Klux) favorecen la acumulacin de antocianinas en cultivos de F. x ananassa, Perilla frutescens, Daucus carota y V. vinifera, mientras que en cultivos de C. arabica este efecto se mantiene hasta cierto valor de intensidad (3 Klux) despus del cual la produccin decae (Zhang et al., 2002). Los efectos del fotoperiodo, han sido estudiados con respecto a la relacin luz/oscuridad y a la duracin del periodo, variables que pueden afectar el crecimiento, la produccin y la acumulacin interna de metabolitos secundarios como se ha encontado en cultivos de C. arabica (Zhang et al., 2002) y Podophyllum hexandrum (Chattopadhyay et al., 2002). Finalmente es importante tener en cuenta que la luz puede afectar la induccin y friabilidad de callos, as como la produccin de metabolitos secundarios a partir de stos; por ejemplo en cultivos de P. hexandrum, fotoperiodos luz/oscuridad de 16/8 aumentan el crecimiento y la friabilidad de los callos (Chattopadhyay et al., 2002) y en cultivos de C. acuminata es necesario un estmulo lumnico para activar la produccin de antocianinas (Pasqua et al., 2005).

Elicitacin. La elicitacin es un conjunto de tcnicas en las que se somete las clulas a factores externos, induciendo mecanismos de defensa que en ocasiones
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Arias, M.; Angarita, M.J.; Aguirre, A.M.; Restrepo, J.M.; Montoya, C.

incrementan la sntesis de metabolitos especficos. Dichos factores son llamados elicitores y se clasifican de acuerdo a su naturaleza, en biticos (quitosano, metiljasmonato, alginato, extractos fnjicos) (Dong y Zhong, 2002; Conceicao et al., 2006; Ignatov et al., 1999; Wang y Zhong, 2002) y abiticos (metales pesados, estrs trmico, estrs osmtico) (Yu et al., 2005; Wu et al., 2001) o de acuerdo a la interaccin planta-elicitor, en generales (metiljasmonato, cido saliclico), si desencadenan una respuesta de defensa en cualquier planta, y especficos (extractos fnjicos), cuando slo actan sobre una especie en particular (Vasconsuelo y Boland, 2007 ).

de protenas implica que confieren resistencia a unos u otros patgenos. As, patgenos que liberan protenas Avr al citoplasma son reconocidos por protenas R citoplasmticas, mientras que productos Avr extracelulares son reconocidos por protenas R transmembranales (Zhao et al., 2005). De manera general, la secuencia de eventos en la respuesta de defensa impulsada por el elicitor comprende los siguientes pasos: reconocimiento, fosforilacin y desfosforilacin de protenas de membrana y citoplasma, aumento en la concentracin de iones Ca2+ en el citoplasma, despolarizacin de la membrana, flujo de iones (Cl, K+ y H+), alcalinizacin extracelular, acidificacin citoplasmtica, activacin de protenas quinasas activadas por mitgeno (MAPK), activacin de la NADPH oxidasa, produccin de ROS, expresin de genes de defensa tempranos, produccin de etileno y jasmonato, expresin de genes de defensa tardos y finalmente acumulacin de metabolitos secundarios (Vasconsuelo y Boland, 2007, Zhao et al., 2005).

Aspectos moleculares. Los elicitores especficos activan un sistema gentico de la planta conocido como gen a gen, en el que una protena de avirulencia (Avr) de un patgeno determinado es reconocida por una protena de reconocimiento (R) de la planta, desencadenando la transcripcin de genes especficos que median la respuesta de defensa. Las protenas R pueden ser transmembranales o citoplasmticas. La gran variabilidad de estos tipos

Tabla 6. Efecto de la elicitacin en el crecimiento y la acumulacin de metabolitos secundarios en cultivos en suspensin de diferentes especies.
T (C) contenido producto (%) biomasa/l (%)

Especie

Producto

Elicitor

Referencia

Taxus yunnanesis Taxus chinensis Poligonum tinctorium Cistanche deserticola Saussurea medusa

Paclitaxel Taxuyunanina C Indirubina Feniletanoides Jaseosioina

Lantano Metil jasmonato Rhizoctoria solani Fusarium solanum Glutationa

12 7 0 15 5

312 46 190 51 100

-8 13,5 -7 -

Wu et al., 2001 Dong y Zhong et al., 2002 Marero et al., 1997 Lu y Mei, 2003 Zhao et al., 2005

T: Tiempo aplicacin (das) se presentan datos para experimentos en los cuales solo se realiz una aplicacin de elicitor en el da indicado; contenido producto (%): Porcentaje de cambio en el contenido intracelular de producto con respecto al cultivo sin elicitar, biomasa/l (%): Porcentaje de cambio de la concentracin de biomasa (g/l), cuando no se dispone de datos se marca con lneas con respecto al cultivo sin elicitar.

Utilizacin de elicitores en cultivos de clulas vegetales. La elicitacin de una especie para la obtencin de un metabolito particular, requiere la determinacin de la dosis ptima y el tiempo adecuado de aplicacin del elicitor, as como la respuesta en el
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tiempo del cultivo y los efectos combinados de distintos elicitores. Para determinar la dosis ptima del elicitor que maximiza la produccin del metabolito de inters, se debe evaluar el efecto de la concentracin de ste sobre el crecimiento y la produccin. En general los
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Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos

elicitores inhiben el crecimiento, debido probablemente a que en su presencia las clulas activan mecanismos de defensa desviando los nutrientes y la energa hacia el metabolismo secundario (Thanh et al., 2005, Zhao et al., 2004). En cuanto al efecto sobre la produccin, se ha encontrado que hay un incremento en sta a medida que aumenta la concentracin del elicitor hasta un valor mximo, despus del cual decrece nuevamente, probablemente por la saturacin de los receptores o por que dicha molcula puede ser txica para la clula. Estos efectos han sido estudiados en diferentes especies, en las que se muestra un incremento en la produccin como resultado del proceso de elicitacin (Tabla 6). Debido a que los elicitores afectan el crecimiento, se ha planteado como alternativa el cultivo en dos etapas. El tiempo de aplicacin del elicitor al cultivo es importante, ya que los efectos pueden variar dependiendo de la fase de crecimiento al momento de aplicar el tratamiento (Zhao et al., 2005). Adems es importante estudiar el comportamiento del cultivo con el tiempo, ya que el incremento en la productividad se observa cierto tiempo despus de la adicin del elicitor (Gala et al., 2005, Snchez et al., 2005). Una tcnica muy exitosa en clulas de T. chinensis es la elicitacin repetida, en donde se agrega metiljasmonato al medio en diferentes das del cultivo, obtenindose un incremento progresivo en el contenido de taxuyunanina C hasta alcanzar un valor significativamente mayor que con una sola elicitacin (Hoopen et al., 2002). El acoplamiento de un tipo de elicitor con otros factores aumenta la produccin, generndose un efecto sinrgico (Qu et al., 2006). Es importante tener en cuenta el incremento en el costo del proceso a la hora de elegir el elicitor. CONCLUSIONES El cultivo de clulas vegetales para la produccin de metabolitos secundarios se plantea como una estrategia interesante para la obtencin de compuestos con alto valor agregado, que normalmente son producidos en bajas concentraciones por la planta; sin embargo, la productividad de estos procesos es muy baja, por lo que es necesario aplicar las metodologas de optimizacin descritas en la presente revisin como una manera de estimular e incrementar la produccin del metabolito de inters a escala de laboratorio. Un pas megadiverso como Colombia, debe aprovechar el material vegetal con que cuenta para el desarrollo
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de este tipo de metodologas, con el fin de obtener compuestos con diversas aplicaciones. BIBLIOGRAFA Akalezi, C., S. Liu, Q. Li, J. Yu and J. Zhong. 1999. Combined effects of initial sucrose concentration and inoculum size on cell growth and ginseng saponin production by suspension cultures of Panax ginseng. Process Biochemistry 34(6): 639-642. Bae, K.H., Y.E. Choi, C.G. Shin, Y.Y. Kim and Y.S. Kim. 2006. Enhanced ginsenoside productivity by combination of ethephon and methyl-jasmoante in ginseng (Panax ginseng C.A Meyer) adventitious root cultures. Biotechnology Letters 28(15):1163-1166 Broun, P. 2004. Transcription factors as tools for metabolic engineering in plants. Current Opinion in Plant Biology 7(2): 202-209. Chattopadhyay, S., A. Srivastava, S. Bhojwani and V. Bisaria. 2002. Production of podophyllotoxin by plant cell cultures of Podophyllum hexandrum in bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering 93(2): 215-220. Choi, H., S. Kim, J. Son, S. Hong, H.S. Lee and H.J. Lee. 2000. Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Microbial Technology 27(8): 593-598. Conceicao, L.F.R., F. Ferreres, R.M. Tavares and A.C.P. Dias. 2006. Induction of phenolic compounds in Hypericum perforatum L. cells by Colletotrichum gloeosporioides elicitation. Phytochemistry 67(2): 149-155. Crawford, N. and F. Guo. 2005. New insights into nitric oxide metabolism and regulatory functions. Trends in Plant Science 10(4): 195-200. Deavours, B. and R.A. Dixon. 2005. Metabolic engineering of isoflavonoid biosynthesis in alfalfa. Plant Physiology 138(4): 2245-2259. Dong, H.D. and J.J. Zhong. 2002. Enhanced taxane productivity in bioreactor cultivation of Taxus chinensis cells by combining elicitation sucrose feeding and ethylene incorporation. Enzyme and Microbial Technology 31(1): 116-121.
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