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Tcnicas moleculares I Tecnologa del ADN

Estructura y caractersticas de los cidos nucleicos

mRNA

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Propiedades fsico-qumicas de los AN

Temperatura de melting

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Procariotas vs Eucariotas

Genoma de un mamfera 3 Gb

Genoma de E.coli 1,2 Mb

Tecnologa del ADN recombinante

Clivaje del ADN en sitios especficos mediante endonucleasas de restriccin, que facilitan el aislamiento y manipulacin de genes. Hibridizacin de AN que hace posible detectar secuencias especficas de ADN y ARN. Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la tcnica de PCR Secuenciacin de los nucletidos que componen un determinado fragmento de ADN Monitoreo de la expresin de genes en una clula mediante microarrays

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Enzimas como herramientas de la tecnologa del ADN

Clivaje de secuencias especficas del ADN: Enzimas de restriccin

Extremos romos En general reconocen secuencias palindrmicas Extremos cohesivos

5 extendido

3 extendido

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Tcnicas electroforticas: separacin, purificacin e identificacin de AN Permiten separar las molculas de AN por tamao.

Geles de: Agarosa Poliacrilamida

Clivaje de secuencias especficas del ADN: Enzimas de restriccin

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Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucletido quinasa

Oligonucletidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuya secuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento

Tcnicas de deteccin de secuencias de AN especficas: Southern blot

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Tcnicas de deteccin de secuencias de AN especficas: Northern blot

Tcnicas de deteccin de secuencias de AN especficas: Hibridizacin in situ

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Tcnicas de deteccin de secuencias de AN especficas: Hibridizacin in situ

Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado

Componentes mnimos: 1- Origen de replicacin 2- Gen marcador de seleccin 3- Sitios de restriccin polylinker

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Vectores de clonado: Plsmidos Estructura CCC y su tamao es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb

Otros tipos de vectores Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb

Csmidos: hbrido plsmido y fago L (30-40 kb) Fsmidos: hbrido plsmido y fago M3 Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs (100-500 kb)

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Transferencia de la qumera de ADN a la clula huesped

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Ciclos: Desnaturalizacin (92-95 C) Hibridacin (35-60 C) Polimerizacin (72 C)

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PCR ..\..\videos\19-polymerase-chain-reaction.mp4

Introduccin a los TP 1 y 2

Extraccin de ADN plasmdico a partir de bacterias Miniprep- Hidrlisis alcalina

Cuantificacin y anlisis de pureza

Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa

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TP n 1: Extraccin y cuantificacin de DNA plasmidico

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Bibliotecas genmica y de cDNA

Bibliotecas genmica y de cDNA

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Metodologas de screening

PCR Hibridacin RFLP Actividad enzimtica Anticuerpos

Secuenciacin del ADN

Mtodo qumico: Maxan y Gilbert

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Secuenciacin del ADN Mtodo enzimtico: Sanger

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