Sumrio

Aminocidos: blocos constituintes das protenas ................................................... 2

Estrutura de um aminocido tpico ........................................................................................................... 2 Os aminocidos podem se ligar via ligaes peptdicas .................................................................... 2 Aminocidos de ocorrncia natural ........................................................................................................... 3 Aminocidos no polares ................................................................................................................................ 4 Aminocidos polares no carregados ....................................................................................................... 4 Aminocidos cidos ........................................................................................................................................... 4 Aminocidos bsicos ......................................................................................................................................... 4 Aminocidos incomuns .................................................................................................................................... 5 Aminocidos no encontrados em protenas ......................................................................................... 5 Qumica cido-base dos aminocidos ....................................................................................................... 6 Ionizao das cadeias laterais ...................................................................................................................... 8 Reaes dos grupos carboxila e amino ..................................................................................................... 9 Reao da Ninidrina ...................................................................................................................................... 10 Reaes especficas de cadeias laterais dos aminocidos .............................................................. 11 Aminocidos so molculas quirais ......................................................................................................... 12 Nomenclatura para molculas quirais .................................................................................................... 12 Espectro ultravioleta ..................................................................................................................................... 14 Espectro de ressonncia magntica nuclear ........................................................................................ 14 Mtodos cromatogrficos ............................................................................................................................. 15 Cromatografia de troca inica. ................................................................................................................. 16

Reaes dos aminocidos ....................................................................................... 9

Atividade tica e estereoqumica dos Aminocidos .............................................. 12

Propriedades espectroscpicas dos aminocidos ................................................. 13

Separao e anlise de misturas de aminocidos ................................................. 15

linked to both the amino group and the carboxyl group. Also bonded to this -carbon is a hydrogen and a variable side chain. It is the side chain, the socalled R group, that gives each amino acid its identity. The detailed acidbase properties of amino acids are discussed in the following sections. It is sufficient for now to realize that, in neutral solution (pH 7), the carboxyl group exists as OCOO and the amino group as ONH3. Because the resulting amino acid contains one positive and one negative charge, it is a neutral molecule called a zwitterion. Amino acids are also chiral molecules. With four different groups attached to it, the -carbon is said to be asymmetric. The two possible configurations for the -carbon constitute nonidentical mirror image isomers or enantiomers. Details of amino acid stereochemistry are discussed in Section 4.4.

Amino Acids Can Join via Peptide Bonds

Aminocidos

The crucial feature of amino acids that allows them to polymerize to form peptides and proteins is the existence of their two identifying chemical groups: the amino (ONH3) and carboxyl (OCOO) groups, as shown in Figure 4.2. The amino and carboxyl groups of amino acids can react in a head-to-tail fashion, eliminating a water molecule and forming a covalent amide linkage, which, in the case of peptides and proteins, is typically referred to as a peptide bond. The equilibrium for this reaction in aqueous solution favors peptide bond hydrolysis. For this reason, biological systems as well as peptide chemists in the laboratory must carry out peptide bond formation in an indirect manner or with energy input. Iteration of the reaction shown in Figure 4.2 produces polypeptides and proteins. The remarkable properties of proteins, which we shall discover and come to appreciate in later chapters, all depend in one way or another on the unique properties and chemical diversity of the 20 common amino acids found in proteins.

As protenas so agentes indispensveis de funo biolgica, e os aminocidos so os blocos constituintes das protenas. A estonteante diversidade de milhares de protenas encontradas na natureza surge das propriedades intrnsecas de somente 20 aminocidos de ocorrncia comum. Estas caractersticas incluem (1) a capacidade de se polimerizar; (2) propriedades cido-base; (3) estrutura variada e funcionalidade qumica nas cadeias laterais dos aminocidos e (4) quiralidade.

Common Amino Acids

Aminocidos: blocos constituintes das protenas

Estrutura de um aminocido tpico

A estrutura de um nico aminocido tpico mostrada na Figura 1. No centro desta estrutura est o carbono tetradrico alfa (C ), que est covalentemente ligado a ambos, o grupo amino e o grupo carboxlico. Tambm ligado a este Side carbono est um hidrognio e uma H R chain -Carbon cadeia lateral varivel. esta C + COO HN cadeia lateral, tambm chamada Amino Carboxyl Ball-and-stick Amino acids are group group model tetrahedral structures grupo R, que d a cada aminocido FIGURE 4.1 Anatomy of an amino acid. Except for proline and its derivatives, all of Figura 1 - Estrutura de um aminocido. Exceto pela a sua identidade. As propriedades the amino acids commonly found in proteins possess this type of structure. prolina e seus derivados, todos os aminocidos cido-base detalhadas dos normalmente encontrados nas protenas apresentam aminocidos sero discutidas esta estrutura. posteriormente. suficiente dizer, por agora, que, em soluo neutra (pH 7), o grupo carboxlico existe como COO- e o grupo amino como NH3+. Pelo fato do aminocido resultante conter uma carga positiva e uma negativa, a molcula neutra chamada zwitterion. Os aminocidos tambm so molculas quirais. Com quatro grupos diferentes ligados a ele, o carbono alfa anomrico. As duas possveis configuraes para o4.1 carbono C so ismeros especulares no sobreponveis ou enantimeros. +

The structures and abbreviations for the 20 amino acids commonly found in proteins are shown in Figure 4.3. All the amino acids except proline have both free -amino and free -carboxyl groups (Figure 4.1). There are several ways to classify the common amino acids. The most useful of these classifications is based on the polarity of the side chains. Thus, the structures shown in Figure 4.3 are grouped into the following categories: (1) nonpolar or hydrophobic
R

COO

NH3

COO

NH3

Amino Acids: Building Blocks of P

N
H

C
H

Os aminocidos podem se ligar via ligaes peptdicas

A caracterstica crucial dos aminocidos que lhes permite polimerizar para formar peptdeos e protenas a existncias de seus dois grupos qumicos: o amino e o carboxlico, como mostrado na Figura 2. Estes dois grupos dos aminocidos podem reagir no sentido cabea-cauda eliminando uma molcula de gua e formando uma ligao covalente amida, a qual, no caso dos peptdeos e protenas, tipicamente chamada de

C O

N C

C O

Two amino acids

Removal of a water molecule...

H2O

Peptide bond ...formation of the CONH

+
Amino end

Carboxyl end

FIGURE 4.2

The -COOH an groups of two amino acids can rea resulting loss of a water molecule covalent amide bond. (Irving Geis.)

Figura 2 - Os grupos alfa aminocido e alfa amino de dois aminocidos podem reagir entre si com perda de gua para formar uma ligao amino acids, (2) neutral (uncharged) but polar amino acids, (3) acidic amino covalente amida. acids (which have a net negative charge at pH 7.0), and (4) basic amino acids
(which have a net positive charge at neutral pH). In later chapters, the importance of this classification system for predicting protein properties becomes clear. Also shown in Figure 4.3 are the three-letter and one-letter codes used to represent the amino acids. These codes are useful when displaying and comparing the sequences of proteins in shorthand form. (Note that several of the one-letter abbreviations are phonetic in origin: arginine Rginine R, phenylalanine Fenylalanine F, aspartic acid asparDic D.) Nonpolar Amino Acids The nonpolar amino acids (Figure 4.3a) include all those with alkyl chain R groups (alanine, valine, leucine, and isoleucine), as well as proline (with its unusual cyclic structure), methionine (one of the two sulfur-containing amino

ligao peptdica. O equilbrio para esta reao em soluo aquosa favorece a hidrlise da ligao peptdica. Por esta razo os sistemas biolgicos como tambm qumicos de peptdeos no laboratrio, devem produzir as ligaes peptdicas de maneira indireta ou com o incremento de energia. A iterao da reao mostrada na Figura 2 produz polipeptdeos e protenas. Todas as incrveis propriedades das protenas dependem, de uma maneira ou de outra, das propriedades nicas e diversidade qumica dos 20 aminocidos comumente encontrados nas protenas.

Aminocidos de ocorrncia natural

As estruturas e abreviaes para os 20 aminocidos comumente encontrados nas A. The proteinogenic amino acids protenas so mostrados na Figura 3. Todos os aminocidos com exceo da prolina, tem ambos Aliphatic Sulfur-containing grupos amino e Glycine Alanine Cysteine Valine Leucine Isoleucine Methionine (Gly, G) (Ala, A) (Val, V) (Leu, L) (Ile, I) (Cys, C) (Met, M) carboxlico alfas, livres (Figura 1). H vrias H CH3 H3C CH CH2 H3C C H CH2 CH2 CH3 CH2 H3C CH SH CH2 maneiras de classificao 8.3 CH3 CH3 S destes aminocidos. A CH3 pK value mais til destas Polarity classificaes baseada na polaridade das 2.4 1.9 2.0 2.3 2.2 1.2 1.5 cadeias laterais. Assim, as estruturas mostradas Cyclic Neutral Aromatic na Figura 3 so Proline Serine Threonine Phenylalanine Tyrosine Tryptophan (Phe, F) (Tyr, Y) (Trp, W) (Pro, P) (Ser, S) (Thr, T) agrupadas nas seguintes categorias: (1) CH2 CH2 CH2 H3C C H COO CH2 CH OH OH aminocidos no polares CH2 HN ou hidrofbicos; (2) N H2C CH2 H aminocidos neutros OH 10.1 (no carregados), mas polares; (3) aminocidos +5.9 +0.8 +6.1 +6.0 +5.1 +4.9 cidos (que tem uma Chiral center Essential amino acids carga negativa em pH Acidic Neutral Basic 7,0); e (4) aminocidos Asparagine Glutamine Aspartic acid Glutamic acid Histidine Lysine Arginine bsicos (que tem uma (Asn,N) (Gln, Q) (Asp, D) (Glu, E) (His, H) (Lys,K) (Arg, R) carga lquida positiva em CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 pH neutro). Tambm COO CH2 CONH2 CH2 CH2 CH2 HN CH 4.0 mostrado na Figura 3 os COO CONH 2 CH2 CH2 HC N 4.3 6.0 cdigos de trs e de uma CH2 NH letra usados para NH3 C H2N NH2 10.8 representar os 12.5 +9.7 +9.4 +11.0 +10.2 +10.3 +15.0 +20.0 aminocidos. Estes Figura 3 - Os 20 aminocidos constituintes das protenas podem cdigos so teis quando ser classificados em no polares (hidrofbicos), polares neutros, Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition 2005 Thieme mostrando e cidos e bsicos All rights reserved. Usage subject to terms and conditions of license. comparando as sequncias das protenas de forma abreviada (Note que vrias das abreviaes de uma letra so de origem fontica: arginina = Rginina= R, fenilalanina = F).
a

Amino Acids

61

Indole ring

Pyrrolidine ring

Imidazole ring

 Aminocidos no polares Os aminocidos no polares (Figura 3a) incluem todos aqueles com cadeia R com grupos alquila (alanina, valina, leucina e isoleucina), como tambm a prolina (com sua estrutura cclica no usual), metionina (um dos dois aminocidos que contm enxofre) e dois aminocidos aromticos , fenilalanina e triptofano. O triptofano algumas vezes considerado como um membro limtrofe deste grupo porque ele pode interagir favoravelmente com a gua via o grupo N-H do anel indol. A prolina, estritamente falando, no um aminocido, mas um - iminocido. Aminocidos polares no carregados Os aminocidos polares, no carregados (Figura 3b), exceto pela glicina, contm grupos R que podem formar ligaes de hidrognio com a gua. Assim, estes aminocidos so normalmente mais solveis na gua que os aminocidos no polares. Vrias excees aqui devem ser notadas. A tirosina mostra a menor solubilidade em gua de dos os 20 aminocidos usuais (0,453 g/L a 25 oC). Alm disso, a prolina muito solvel em gua, e alanina e valina so to solveis quanto arginina e serina. Os grupos amida da asparagina e glutamina; os grupos hidroxila da tirosina, treonina e serina; e o grupo sulfidrila da cistena so todos bons formadores de ligaes de hidrognio. A glicina, o mais simples dos aminocidos, tem somente um nico hidrognio como grupo R, e este hidrognio no um bom formador de ligao de hidrognio. As propriedades solveis da glicina so principalmente influenciadas por seus grupos amina e carboxila polares e, assim, a glicina melhor considerada um membro do grupo dos aminocidos polares, no carregados. Deve ser considerado tambm que a tirosina tem caractersticas no polares significantes devido a seu anel aromtico e deve ser razoavelmente colocada no grupo no polar (Figura 3a). No entanto, com um pKa de 10,1, a hidroxila fenlica da tirosina uma entidade polar, carregada, em pH alto. Aminocidos cidos H dois aminocidos cidos cido asprtico e cido glutmico cujos grupos R contm um grupo carboxlico (Figura 3c). Estes grupos carboxila das cadeias laterais so cidos mais fracos que o grupo -COOH, mas so suficientemente cidos para existirem como COO- em pH neutro. Estes aminocidos carregados negativamente tem vrios papis importantes nas protenas. Muitas protenas que se ligam a ons metlicos com propsitos estruturais ou funcionais possuem os stios de ligao a metais contendo um ou mais cadeias aspartato ou glutamato. Os grupos carboxlicos podem tambm atuar como nuclefilos em certas reaes enzimticas e podem participar numa variedade de interaes eletrostticas. Aminocidos bsicos Trs dos aminocidos usuais tem cadeias laterais com cargas lquidas positivas em pH neutro: histidina, arginina e lisina (Figura 3d). O grupo ionizado da histidina um imidazol, o da arginina um guanidino e a lisina contem um grupo amino alquila protonado. As cadeias laterais dos ltimos dois aminocidos esto totalmente protonado a pH 7, mas a histidina, com o pKa da cadeia lateral de 6,0, 4

est somente 10 % protonado em pH 7. Com o pKa prximo da neutralidade, as cadeias laterais da histidina tem papis importantes como doadoras e aceptoras de prtons em muitas reaes enzimticas. Peptdeos contendo histidina so importantes tampes biolgicos. As cadeias laterais da arginina e lisina, que esto protonadas sob condies fisiolgicas, participam em interaes eletrostticas nas protenas. Vrios aminocidos somente ocorrem raramente nas protenas (Figura 4). Estes incluem a hidroxilisina e hidroxiprolina, que so encontrados principalmente no colgeno e protenas da gelatina, e tiroxina 3,3,5- Figura 4 - Estruturas de vrios aminocidos no comuns, mas ainda assim, e encontrados nas protenas. triiodotironina, aminocido iodado que so encontrados somente na tiroglobulina, uma protena produzida pela FIGURE 4.4 The structures of several amino acids that are less common but nevertheless found in certain proteins. Hydroxylysine and hydroxyproline are found in connectiveglndula tireoide (tiroxina e 3,3,5-triiodotironina so produzidos por iodao tissue proteins, pyroglutamic acid is found in bacteriorhodopsin (a protein in Halobacterium halobium), and aminoadipic acid is found in proteins isolated from corn. dos resduos tirosina na tiroglobulina na glndula tireoide. A degradao da tiroglobulina libera estes dois aminocidos iodados, que atuam como hormnios para regular o crescimento e desenvolvimento.) Certas protenas musculares contm aminocidos Amino Acids Not Found in Proteins metilados, incluindo metilhistidina, -N-metilisina e - Certain amino acids and their derivatives, although not 4). found in proteins, -carboxiglutmico encontrado em N,N-N-trimetilisina (Figura cido nonetheless are biochemically important. A few of the more notable examples are shown inp Figure 4.5. -Aminobutyric acid, or GABA, is produced by the de cogulos e o cido piroglutmico vrias rotenas envolvidas na formao decarboxylation of glutamic acid and is a potent neurotransmitter. Histamine, which is synthesized by decarboxylation of histidine, and serotonin, which is encontrado numa protena nica, bombeadora de prtons direcionada pela luz derived from tryptophan, similarly function as neurotransmitters and regulators. -Alanine is found in nature in the peptides carnosine and anserine and chamada bacteriorodopsina. Certas protenas envolvidas no crescimento e is a component of pantothenic acid (a vitamin), which is a part of coenzyme A. Epinephrine (also celular known as adrenaline ), derived from tyrosine, is an imporregulao so reversivelmente fosforiladas nos grupos OH de resduos tant hormone. Penicillamine is a constituent of the penicillin antibiotics. Ornithine, betaine, homocysteine,e and homoserine are important metabolic serina, treonina tirosina. cido aminoadpico encontrado em protenas intermediates. Citrulline is the immediate precursor of arginine. isoladas do milho. Finalmente, N-metilarginina e N-acetilisina so encontradas as protenas histonas associadas com cromossomos.
5-Hydroxylysine COOH C H 4-Hydroxyproline COOH C H Thyroxine 3-Methylhistidine -N-Methyllysine COOH C H COOH C H COOH C H + H3N HN + H3N + H3N + H3N -N,N,N-Trimethyllysine COOH + H3N C H CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 H2C CH2 C CH2 H CH2 C CH2 CH2 CH2 CH2 H OH C CH OH CH2 I I N + NH O H3C C H + NH3 NH+ 2 CH3 N+(CH3)3 I I OH Aminoadipic acid COOH C H -Carboxyglutamic acid COOH C H + H3N Pyroglutamic acid COOH C H Phosphoserine COOH C H Phosphothreonine COOH C H Phosphotyrosine COOH C H + H3N HN + H3N + H3N H + H3N CH2 CH2 CH2 CH2 CH C O CH2 C H2 CH2 C OPO3H2 CH2 HOOC COOH OPO3H2 CH3 COOH OPO3H2 N-Methylarginine COOH C H + H3N N-Acetyllysine COOH C H + H3N

Aminocidos incomuns

4.1

Amino Acids: Building Blocks of Proteins

87

CH2

CH2 CH2 CH2 CH2

CH2 CH2

NH C

NH

CH3

H2N

+ N CH3 H

Aminocidos no encontrados em protenas Certos aminocidos e seus derivados, embora no encontrados nas protenas, nem assim so menos importantes bioquimicamente. Alguns dos mais notveis

88

Chapter 4

Amino Acids

exemplos so mostrados na Figura 5. cido -aminobutrico ou GABA,

COOH COOH H2N+ CH2 H3C COOH (CH2)3 NH+ 3 H3C H3C COOH CH2 CH2 NH+ 3 COOH H3N+ CH CH2 O C O Sarcosine (N-methylglycine) -Aminobutyric acid (GABA) Betaine (N,N,N-trimethylglycine) -Alanine Azaserine O-diazoacetylserine CH2OH COOH COOH H3N + CH CH2CH2OH H3N + COOH CH CH2 S COOH HC CH2 + NH3 H3N + COOH CH CH2CH2SH NO2 Homoserine
L-Lanthionine

N+ CH2 CH3

CH

N+

HN O C HCCl2

CH CHOH +N H3 CH H2C

H3N+ CH CHOH

O NH O

Homocysteine

L-Phenylserine

L-Chloramphenicol

Cycloserine

CH3 NH+ 2 CH2 HO C H N OH OH Epinephrine

NH+ 3 CH2 CH2 NH Histamine HO N H CH2 CH2 + H3N NH+ 3 + H3N

COOH C C SH Penicillamine H CH3 H3N

COOH C CH2 CH2 CH2 NH+ 3 Ornithine H + H3N

COOH C CH2 CH2 CH2 N C NH2 Citrulline H O H

Serotonin

FIGURE 4.5 The structures of some amino acids that are not normally found in proFigura 5 - Estruturas de alguns aminocidos que no so normalmente encontrados nas protenas, teins but that perform other important biological functions. Epinephrine, histamine, and mas que tem importantes funes biolgicas. Epinefrina, histamina e serotonina no so serotonin, although not amino acids, are derived from and closely related to amino acids. aminocidos, mas derivados deles.

produzido pela descarboxilao do cido glutmico e um potente neurotransmissor. Histamina , que sintetizada pela descarboxilao da histina, 4.2 AcidBase Chemistry of Amino Acids e serotonina, que derivada do triptofano, funcionam similarmente como Amino Acids Are Weak Polyprotic Acids neurotransmissores e reguladores. A -alanina encontrada na natureza nos AcidBase Chemistry of Amino Acids 89 From a chemical point of view,4.2 the common amino acids are all weak polypropeptdeos carnosina e anserina e um componente do cido pantotnico (uma tic acids. The ionizable groups are not strongly dissociating ones, and the thus depends on the pH of the medium. the amino pH 1 Net charge +1 pH 7 Net charge 0 degree of pHdissociation 13 Net charge 1 vitamina), que uma All parte da acids contain at least two dissociable hydrogens. coenzima A. A epinefrina Consider the acidbase behavior of glycine, the simplest amino acid. At + + low pH, both the amino and carboxyl groups are conhecida protonated and the molecule (tambm como has a net positive charge. If the counterion in solution is a chloride ion, this adrenalina ), derivada da form is referred to as glycine hydrochloride. If the pH is increased, the carboxyl group is the first to dissociate, yielding the neutral zwitterionic species tirosina, um hormnio H H0 COOH COO COOFurther (Figure 4.6). increase in pH results in amino dissociation of Gly FIGURE 4.6 eventually The ionic forms of the importante. um acids, shown without Penicilamina consideration of any + + the amino charged glycinate. If we iondenote these HN C H HN C H H group N C to H yield the negatively izations on the side chain. The cationic form is constituinte antibiticos de the low pH form, anddos the titration of the R R R cationic species with base yields the zwitterion penicilina. Ornitina, betana, ( Irving Geis ) and finally the anionic form. Cationic form Zwitterion (neutral) Anionic form Figura 6 - Espcies inicas dos aminocidos mostrados homocistena e homoserina three forms as Gly , Gly , and Gly , we can write the first dissociation of Gly so importantes intermedirios sem levar em conta quaisquer ionizaes da cadeia as lateral. metablicos. Citrulina o Gly H O 34 Gly H O precursor imediato da arginina. and the dissociation constant K as

K Qumica cido-base dos aminocidos [Gly ]

1

[Gly0][H3O]

Values for K ponto for the common acids are typically 0.4 to 1.0 10 M, De um de amino vista qumico, os aminocidos usuais so todos cidos so that typical values of pK center on values of 2.0 to 2.4 (see Table 4.1). In poliprticos fracos. s second grupos ionizveis a similar manner, we can write O the dissociation reaction asno se dissociam fortemente e o grau de
1 2 1

Gly0 H2O 34 Gly H3O

Table 4.1

pK a Values of Common Amino Acids

Amino Acid

6
-NH3 pK a
R group pK a

-COOH pK a

Alanine Arginine

2.4 2.2

9.7 9.0

12.5

dissociao ento depende do pH do meio. Todos os aminocidos contem pelo menos dois hidrognios dissociveis. Consideremos o comportamento cido-base da glicina, o mais simples aminocido. Em pH baixo, ambos grupos, amino e carboxlico, esto protonado e a molcula tem uma carga positiva lquida. Se o contra-on na soluo um on cloreto, esta forma chamada de hidrocloreto de glicina. Se o pH aumentado, o grupo carboxlico o primeiro a se dissociar, produzindo a espcie zwitterinica neutra Gly0 (Figura 6). Posterior aumento no pH eventualmente resulta na dissociao do amino grupo para produzir o glicinato carregado negativamente. Se indicamos as trs formas como Gly+, Gly0 e Gly-, podemos escrever a primeira dissociao da Gly+ como ! + ! ! + ! ! e a constante de dissociao K1 como ! [! ! ] ! = [ ! ] Valores de K1 para os Gly Gly+ Gly0 COOH COO COO aminocidos comuns so + + tipicamente 0,4 a 1,0 x 10-2 M, H3N CH2 H3N CH2 H2N CH2 14 assim, os valores tpicos de pK1 esto entre os valores de 12 pK 2 2,0 a 2,4 (veja a Tabela 1). 10 De maneira similar, podemos pH 8 escrever a segunda reao de Isoelectric 6 dissociao como point ! + ! ! + ! ! 4 e a constante de dissociao 2 pK 1 K2 est entre 9,0 e 9,8. Em pH 0 fisiolgico, o grupo a-carboxila 1.0 0 1.0 Equivalents of OH Equivalents of H+ de um aminocido simples (sem cadeias laterais 0 1.0 2.0 ionizveis) est Equivalents of OH added completamente dissociado, 2.0 1.0 0 enquanto o -amino grupo Equivalents of H+ added ainda FIGURE 4.7 Titration of glycine, a simple amino isoeltrico acid. The isoelectric point, pI, the no comeou a se Figura 7 - Titulao da glicina. O ponto aquele pK 2)/2. dissociar. A curva de titulao pH where the molecule has a net charge of 0, is defined as (p K 1 no qual o aminocido no apresenta carga e definido
como (pKa1 + pKa2)/2

and the dissociation constant K 2 as K2 [Gly][H3O] [Gly0]

para um destes aminocidos est mostrada na Figura 7.

Typical values for pK 2 are in the range of 9.0 to 9.8. At physiological pH, the -carboxyl group of a simple amino acid (with no ionizable side chains) is completely dissociated, whereas the -amino group has not really begun its dissociation. The titration curve for such an amino acid is shown in Figure 4.7. EXAMPLE What is the pH of a glycine solution in which the -NH3 group is one-third dissociated?
SOLUTION

The appropriate HendersonHasselbalch equation is

[Gly] pH pK a log10 [Gly0]

K1

[Gly ]

Values for K 1 for the common amino acids are typically 0.4 to 1.0 102 M, so that typical values of pK 1 center on values of 2.0 to 2.4 (see Table 4.1). In a similar manner, we can write the second dissociation reaction as Gly0 H2O 34 Gly H3O

Table 4.1
Amino Acid

Tabela 1 - Valores de pKa dos aminocidos comuns.

pK a Values of Common Amino Acids
-COOH pK a -NH3 pK a
R group pK a

Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamic acid Glutamine Glycine Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine

2.4 2.2 2.0 2.1 1.7 2.2 2.2 2.3 1.8 2.4 2.4 2.2 2.3 1.8 2.1 2.2 2.6 2.4 2.2 2.3

9.7 9.0 8.8 9.8 10.8 9.7 9.1 9.6 9.2 9.7 9.6 9.0 9.2 9.1 10.6 9.2 10.4 9.4 9.1 9.6

12.5 3.9 8.3 4.3

6.0

10.5

13.00 13.00 10.1

Exemplo Qual o pH de uma soluo de glicina no qual o grupo -NH3+ est um tero dissociado? Soluo A equao de Henderson-Hasselbalch [ ! ] = ! + log!" [ ! ] Se o -amino grupo est um tero dissociado, h somente uma parte de Gly- para cada duas partes de Gly0. O pKa importante o do grupo amino. O grupo -amino da glicina tem pKa de 9,6. O resultado 1 = 9,6 + log!" 2 = 9,3 Note que as constantes de dissociao de ambos, os grupos -carboxlico e - amino, so afetados pela presena de outros grupos. Um grupo -amino adjacente faz com que o grupo -COOH fique to mais cido (isto , diminua seu pKa) que pode ceder um prton mais facilmente que o mais simples dos cidos carboxlicos alquila. Assim, o pK1 de 2,0 a 2,1 para os grupos -carboxlicos dos aminocidos substancialmente menor que o do cido actico (pKa = 4,76), por exemplo. Qual a base qumica para o baixo pKa do grupo -COOH dos aminocidos? O grupo -NH3+ (amnio) fortemente eletronegativo e a carga positiva do grupo amino exerce um forte efeito e estabiliza o nion carboxilato.

Ionizao das cadeias laterais

Como j vimos, as cadeias laterais de vrios dos aminocidos tambm contm grupos dissociveis. Assim, os cidos asprtico e glutmico contm uma funo carboxila adicional e a lisina possui uma funo amino aliftica. A histidina contm um prton imidazlico ionizvel, e a arginina carrega uma funo guanidino. Valores tpicos de pKa destes grupos so mostrados na Tabela 1. O 8

grupo -carboxlico do cido asprtico e o -carboxil da cadeia lateral do cido glutmico exibem valores de pKa intermedirios aos do -COOH e de grupos Ionization of Side Chains carboxlicos alifticos. De maneira similar, o grupo -amino da lisina exibe um As we have seen, the side chains of several of the amino acids also contain dissociable groups. Thus, aspartic and glutamic acids contain an additional carpKa que maior que o do grupo -amino, mas similar ao de um amino grupo boxyl function, and lysine possesses an aliphatic amino function. Histidine aliftico tpico. Estes valores intermedirios para os conpKa de cadeias laterais tains an ionizable imidazolium proton, and arginine carries a guanidinium refletem o efeito ligeiramente diminudo dos grupos dissociveis -carbono que function. Typical pK a values of these groups are shown in Table 4.1. The -carboxyl group of aspartic acid and the -carboxyl side chain of glutamic acid funcionais da cadeia se encontrem a vrios tomos de distncia dos grupos exhibit pK a values intermediate to the -COOH on the one hand and typical lateral. A Figura 8 mostra tpicas curvas de titulao para cido glutmico e aliphatic carboxyl groups on the other hand. In a similar fashion, the lisina, juntamente com as a espcies nicas que redominam -amino group of lysine exhibits pK a that isihigher than thep -amino group em vrios pontos da but similar to that for a typical aliphatic amino group. These intermediate values titulao. Os nicos outros grupo de cadeia lateral que exibem qualquer for side-chain pK a values reflect the slightly diminished effect of the -carbon significante grau de dissociao so o grupo para- OH da tirosina e o grupo SH dissociable groups that lie several carbons removed from the side-chain functional groups. Figure 4.8 shows typical titration curves for glutamic acid and est cerca de 12 % da cistena. P pKa do sulfidrila da cistena 8,32, ento lysine, along with the ionic species that predominate at various points in the dissociado em pH 7. O grupo para-OH da tirosina um grupo cido muito fraco, com pKa de cerca de 10,1. Este grupo est essencialmente totalmente protonado e sem carga em pH 7.
FIGURE 4.8
Glu+ COOH H3N+ C CH2 CH2 COOH 14 12 10 8 pH 6 4 2 0 pK 1 pK 2 Isoelectric point pH 6 4 2 0 pK 1 pK 3 H

that it gives up a proton more readily than simple alkyl carboxylic acids. Thus, the pK 1 of 2.0 to 2.1 for -carboxyl groups of amino acids is substantially lower than that of acetic acid (pK a 4.76), for example. What is the chemical basis for the low pK a of the -COOH group of amino acids? The -NH3 (ammonium) group is strongly electron-withdrawing, and the positive charge of the amino group exerts a strong field effect and stabilizes the carboxylate anion. (The effect of the -COO group on the pK a of the -NH3 group is the basis for Problem 4 at the end of this chapter.)

Titrations of glutamic acid and lysine.

Glu COO H3N+ C CH2 CH2 COO H H2N Glu2 COO C CH2 CH2 COO H

Lys2+ COOH

Lys+ COO H3N+ C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3+ H H2N

Lys0 COO C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3+ H H2N

Lys COO C CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 H

Glu0 COO H3N+ C CH2 CH2 COOH H

H3N+ C CH2 CH2 CH2 CH2 14 12 10 8

NH3+

pK 3 pK 2 Isoelectric point

1.0 2.0 Equivalents of OH added

3.0

1.0 2.0 Equivalents of OH added

3.0

Figura 8 - Titulaes do cido glutmico e da lisina.

Reaes dos aminocidos

Reaes dos grupos carboxila e amino
Os grupos a-carboxlico e a-amino de todos os aminocidos exibem similares reatividades qumicas. As cadeias laterais, no entanto, exibem reatividades qumicas especficas, dependendo da natureza dos grupos funcionais. Mesmo que todas estas reatividades sejam importantes no estudo e anlise de aminocidos isolados, o comportamento caracterstico da cadeia lateral que governa a reatividade dos aminocidos incorporados nas protenas. H trs

Carboxyl and Amino Group Reactions

The -carboxyl and -amino groups of all amino acids exhibit similar chemical reactivity. The side chains, however, exhibit specific chemical reactivities, depending on the nature of the functional groups. Whereas all of these reactivities are important in the study and analysis of isolated amino acids, it is the characteristic behavior of the side chain that governs the reactivity of amino acids incorporated into proteins. There are three reasons to consider these reactivities. Proteins can be chemically modified in very specific ways by taking advantage of the chemical reactivity of certain amino acid side chains. The detection and quantification of amino acids and proteins often depend on reactions that are specific to one or more amino acids and that result in color, radioactivity, or some other quantity that can be easily measured. Finally and most importantly, the biological functions of proteins depend on the behavior and reactivity of specific R groups. The carboxyl groups of amino acids undergo all the simple reactions common to this functional group. Reaction with ammonia and primary amines yields unsubstituted and substituted amides, respectively (Figure 4.9a,b). Esters

razes para se considerar estas reatividades. As protenas podem ser quimicamente modificadas de maneiras muito especficas se levando vantagem da reatividade qumica de certas cadeias laterais dos aminocidos. A deteco e quantificao dos aminocidos e protenas quase sempre dependem de reaes que so especficas para um ou mais aminocidos e que resultam em cor, radioatividade ou alguma outra caracterstica quantificvel que pode ser facilmente medida. Finalmente e o mais importante, as funes biolgicas das protenas dependem do CARBOXYL GROUP REACTIONS comportamento e reatividade + + (a) NH HN O de grupos R especficos. R C C NH R C COOH + NH Os grupos carboxlicos dos Amide H H HO aminocidos reagem a todas Amino acid + as reaes simples deste HN O (b) Amino acid grupo funcional. Reao com + R' NH R C C N R' H amnia e aminas primrias H Substituted amide HO + produzem amidas no HN O (c) Amino acid substitudas e substitudas, + R' OH R C C OR' Ester H respectivamente (Figura HO O FIGURE 4.9 Typical reactions of the com(d) O mon amino acids (see text for details). 9a,b). steres e cloretos NHCHR C + NH CHRCO NHCHRC NHCHRCO Polymer cidos so tambm OR' R'OH prontamente formados. A AMINO GROUP REACTIONS esterificao acontece na (e) O R R presena de um apropriado + H C NH + R' C H H C N C R' + H+ lcool ou cido fortes (Figura H COO COO HO 9c). Polimerizao tambm Amino acid Schiff base R ocorre pela repetio da O H + (f) Amino acid R' C + Cl H C N C R' + H reao mostrada na Figura COO O HCl 9d. Os aminocidos livres Substituted amide podem reagir com aldedos Figura 9 - Reaes tpicas dos aminocidos comuns. para formar bases de Schiff (Figura 9e) e podem ser acilados com anidridos cidos e haletos cidos (Figura 9f).
3 3 3 2 2 3 2 2 3 2

Chapter 4

Amino Acids

Reao da Ninidrina
O OH OH O Ninhydrin COO H O

H+ 3N

C R

+ RCH O + CO2 + NH3 +

O Hydrindantin

OH H O

H+

OH OH

The pathway of the ninhyction, which produces a colored proded Ruhemanns Purple that absorbs 570 nm. Note that the reaction involves sumes two molecules of ninhydrin.

E 4.10

O 2nd Ninhydrin O N H O Two resonance forms of Ruhemanns Purple O N O O O O O

Os aminocidos podem ser prontamente detectados e quantificados pela reao com ninidrina. Como mostrado na Figura 10, ninidrina, ou tricetohidrindeno hidrato, um forte agente oxidante e produz a desaminao oxidativa da funo -amino. Os produtos da reao so o resultante aldedo, amnia, dixido de carbono e hidrindantina, um derivado reduzido da ninidrina. A amnia produzida desta maneira pode reagir com a hidrindantina e uma outra molcula de ninidrina produzindo uma substncia 10

Figura 0 - Reao da nformed. inidrina. and acid 1 chlorides are also readily Esterification proceeds in the pres-

ence of the appropriate alcohol and a strong acid (Figure 4.9c). Polymerization can occur by repetition of the reaction shown in Figure 4.9d. Free amino groups may react with aldehydes to form Schiff bases (Figure 4.9e) and can be acylated with acid anhydrides and acid halides (Figure 4.9f).

The Ninhydrin Reaction

Amino acids can be readily detected and quantified by reaction with ninhydrin. As shown in Figure 4.10, ninhydrin, or triketohydrindene hydrate, is a strong oxidizing agent and causes the oxidative deamination of the -amino function. The products of the reaction are the resulting aldehyde, ammonia, carbon dioxide, and hydrindantin, a reduced derivative of ninhydrin. The ammonia produced in this way can react with the hydrindantin and another

prpura (Prpura de Ruhemann) que pode ser quantificada espectroscpicamente a 570 nm. A produo de CO2 tambm pode ser monitorada. De fato, a evoluo de CO2 diagnstico da presena de um - aminocido. -imino cidos, tais como prolina e hidroxiprolina, do produtos amarelo brilhantes com ninidrina, com absoro mxima a 440 nm, permitindo a distino entre estes e outros -aminocidos. Como os aminocidos so um dos componentes das secrees da pela humana, a reao de ninidrina j foram extensivamente utilizadas pela lei e a cincia forense para a deteco de 4.3 Reactions of Amino Acids 95 impresses digitais. (Impresses to antigas quanto 15 anos pode ser In recent years, biochemists have developed an arsenal of reactions that identificadas com a reao de These ninidrina). Hoje em dia reagentes fluorescentes are relatively specific to the side chains of particular amino acids. reactions can be used to identify functional amino acids at the active sites of enzymes sensveis o utilizados com estudy. ste Cysteine propsito. or to label proteins s with appropriate reagents for further

residues in proteins, for example, react with one another to form disulfide species and also react with a number of reagents, including maleimides (typically N-ethylmaleimide), as shown in Figure 4.11. Cysteines also react effectively

Reaes especficas de cadeias laterais dos aminocidos

FIGURE 4.11

Uma srie de reaes de aminocidos tem se tornado importantes nos ltimos anos porque so essenciais + para a degradao, sequenciamento e sntese qumica de + + peptdeos e protenas. Em anos recentes os bioqumicos tem + desenvolvido um arsenal de reaes que so relativamente + + especficas para as cadeias laterais de aminocidos particulares. Estas + + reaes podem ser utilizadas para identificar + + + aminocidos funcionais nos stios Figura 11 - Reaes dos grupos funcionais das cadeias laterais dos ativos das enzimas ou aminocidos. para marcar protenas com reagentes apropriados para posterior estudo. Resduos de cistena nas protenas, por exemplo, reagem com uns com os outros, para formar espcies dissulfeto que tambm reagem com vrios reagentes, incluindo maleimidas (normalmente N- etilmaleimida), como mostrado na Figura 11. As cistenas tambm reagem efetivamente com cido iodoactico produzindo derivados S-carboximetil cistena. H numerosas outras reaes envolvendo reagentes especficos para particulares grupos funcionais das cadeias laterais. A Figura 11 apresenta um lista representativa destes reagentes e seus produtos. importante compreender que poucas, se mesmo algumas, destas reaes so
CYSTEINE H C H C H C 2 OOC CH2 SH OOC CH2 S S CH2 COO + H3 N Cysteine O H+ 3N NH+ 3 Cystine H C R group CH2 H C N CH2CH3 OOC SH OOC O CH2 O H+ 3N + H3 N S H H H N CH2CH3 N-Ethylmaleimide O H C H C ICH2COO OOC CH2 SH OOC CH2 S CH2 COO HI Iodoacetate + H3 N + H3 N H C H C H2C CH C N OOC CH2 SH OOC CH2 S CH2 CH2 C N Acrylonitrile H+ 3N H+ 3N H C H C O2N S S NO2 OOC CH2 SH OOC CH2 S S NO2 S NO2 OOC COO + H3 N + H3 N COO COO 5,5'Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) DTNB Ellmans reagent Thiol anion (max = 412 nm) H C H C HO Hg COOH OOC CH2 SH OOC CH2 S Hg COOH H2O pHydroxy mercuribenzoate H+ 3N + H3 N LYSINE R' O H H C R group H C OOC + CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 Lysine OOC H C CH2 CH2 CH2 CH2 N C H+ 3N H+ 3N R' Schiff base H2O H+

Reactions of amino acid side-chain functional groups.

11

96

verdadeiramente especficas para um grupo funcional; consequentemente, Chapter 4 Amino Acids devem ser utilizadas com muito cuidado.

96

Chapter 4

Amino Acids

Atividade tica e estereoqumica dos Aminocidos side chain functional groups. Figure 4.11 presents a representative list of these
Aminocidos so molculas quirais of these

with iodoacetic acid to numerous other reaction side chain functional gro reagents There and the produc with iodoacetic acid to yield S-carboxymethyl cysteine derivatives. are of these reactions are tr numerous other reactions involving specialized reagents specific for particular care must be exercised i

reagents and the products that result. It is important to realize that few if any W reactions are truly specific Wfor one functional group; 4.4 consequently, Optical Activity care must be exercised in their use. Com exceo da glicina, todos os aminocidos isolados das p quatro C C X rotenas Z Z tem X

Y Y grupo diferentes ligados ao tomo de carbono . Em tal caso, o carbono Amino Acids Are Chir Perspective drawing assimtrico, ou quiral (do grego cheir que significa Except for glycine, all of ferent groups attached t W W mo). E as duas possveis configuraes para W o carbono W 4.4 Optical Activity and Stereochemistry of Amino said Acids to be asymmetric or the two possible configur C C X Z Z X X o sobreponveis, Z Z X constituem ismeros especulares n ou mirror image isomers, o display a special property enantimeros (Figura 12). Molecules Molculas enantimeras Amino Acids Are Chiral Y Y Y Y of polarization of planeFischer projections mostram uma for propriedade especial chamada atividade Perspective drawing referred to four as dextrorota Except glycine, all of the amino acids isolated from proteins have difFIGURE 4.12 Enantiomeric molecules levorotatory behavior. T tica aferent habilidade e girar to o p lano do polarizao da la uz groups d attached the -carbon atom. such case, the -carbon is based on a chiral carbon atom.In Enantiomers depend on the nature of are nonsuperimposable mirror images of each W W plano-polarizada. Uma rotao da luz incidente na said to be asymmetric or chiral (from the Greek cheir, meaning hand), and length of the light used i other. acid, and therefore the the two possible configurations for the -carbon constitute nonsuperimposable direo horria chamada d extrorrotatria , e a rotao X Z Z X behavior. As shown in Ta mirror image isomers, or enantiomers (Figure 4.12). Enantiomeric molecules a inversa, no sentido anti-horrio, chamada pH are dextrorotatory display a special property called optical activity the ability to rotate plane of thethe L configuratio Y Y levorrotatria . A magnitude e direo da rotao tica arethe name by using of polarization of plane-polarized light. Clockwise rotation ofinincident light isa (

Fischer projections

depende da natureza da cadeia lateral do aminocido. A Figura 12 - Molculas FIGURE 4.12 Enantiomeric molecules levorotatory behavior. The magnitude and direction of the optical rotation enantimeras com temperatura, o comprimento de luz utilizado na medida, based on a chiral carbon atom. Enantiomers Nomenclature for Chi depend on the nature of the amino acid side chain. The temperature, the wavecarbono quiral. So of each are nonsuperimposable mirror images o e stado d e i onizao d o a minocido e , a ssim s endo, o p H The discoveries of optic length of the light used in the measurement, the ionization state of the amino other. imagens especulares no 97) made it import da soluo, podem acid, tambm and therefore the pH of the solution, can also affectpage optical rotation sobreponveis. Tabela 2 - Rotaes especficas Table 4.2 cules. Two systems are in shown in Table some protein-derived amino acids at a given afetar a behavior. rotao As tica. Como de 4.2, alguns aminocidos. (R,S ) system.
Specific Rotations for
D 25

compounds, referred to as dextrorotatory behavior, and counterclockwise orotatory rotation is called as

In the ,L system pH are derivados dextrorotatory and Some others are levorotatory, even though all D of them of Amino Acids mostrado na Tabela 2, alguns de denoted a are of the L configuration. The direction of optical rotation aldehyde can be are specified Specific Rotation [] , (Figure 4.13). Absolute c aminocidos a um dado pH so dextrorrotatrios e for dextrorotatory in the name by using a ()Amino compounds and a ()tofor levAcid Degrees D- and L-g referenced outros so levorrotatrios, mesmo que todos eles orotatory compounds, as in -Alanine L()-leucine. racemization of the amin 1.8 all of the amino acids de estejam na configurao L. A direo da rotao -Arginine 12.5 Amino acids of the D con -Aspartic acid 5.0 tica pode ser especificada no nome utilizando um -Glutamic acid as components of certain 12.0 Nomenclature for Chiral Molecules 38.5 and actinomycin D, and (+) para compostos dextrorrotatrios e um (-) para -Histidine -Isoleucine 12.4 In spite of its widesp The discoveries optical activity structures (see the box, -Leucine and enantiomeric 11.0 os compostos levorrotatrios, como na of L-(+)- of nomenclature. For ex -Lysine 13.5 page 97) made it important to develop suitablenomenclature for chiral molewith two or more chiral leucina. -Methionine 10.0 of nomenclature for chi Table 4.2
L L L L L L L L

L cules. Two systems are in common use today: the so-called D,L system and the 34.5 L-Phenylalanine Sir Christopher Ingold, a (R,S ) system. L-Proline 86.2 orities are assigned to e Specific Rotations for para molculas quirais Nomenclatura L-Serine 7.5 In the D,L system of nomenclature, the ( ) and () isomers of glycerbasis of atomic number, 28.5 L-Threonine Some Amino Acids As descobertas de atividade aldehyde tica e estruturas orities (see the box, pag are denoted as D-glyceraldehyde and L-glyceraldehyde, respectively L-Tryptophan 33.7 25 newer (R,S ) sys 5.6 L-Valine Specific Rotation []Dnecessrio , (Figure 4.13). Absolute configurations of all other carbon-based The molecules are enantimeras tornaram se desenvolver tem in one important wa Amino Acid Degrees L-glyceraldehyde. When sufficient care is taken to avoid referenced to D- and uma nomenclatura para as molculas quirais. Dois racemization of the amino acids during hydrolysis of proteins, it is found that 1.8 L-Alanine sistemas so normalmente utilizados hoje em dia: o sistema chamado D, L e o all of the amino acids derived from natural proteins are of the L configuration. L-Arginine sistema (R, S). 12.5 Amino acids of the D configuration are nonetheless found in nature, especially L-Aspartic acid 5.0 No sistema D, L de nomenclatura, os ismeros (+) e (-) do gliceraldedo so as components of certain peptide antibiotics, such as valinomycin, gramicidin, 12.0 L-Glutamic acid L-Histidine 38.5 and actinomycin D, and in the cell walls of certain microorganisms. chamados como D-gliceraldedo e L-gliceraldedo, respectivamente (Figura 13). L-Isoleucine 12.4 In spite of its widespread problemscomo exist with the D,L system As configuraes absolutas de todas as molculas que acceptance, tenham carbono 11.0 L-Leucine of nomenclature. For example, this system can be ambiguous for molecules base so referenciadas em relao ao D- e L-gliceraldedo. Quando cuidado L-Lysine 13.5 with two or more chiral centers. To address such problems, the (R,S ) system suficiente tomado a racemizao dos aminocidos durante a by Robert Cahn, L-Methionine 10.0 para evitar of nomenclature for chiral molecules was proposed in 1956 34.5 L-Phenylalanine hidrlise das protenas, verificado que todos os aminocidos que compem as Sir Christopher Ingold, and Vladimir Prelog. In this more versatile system, priL-Proline 86.2 protenas n aturais t em c onfigurao . Os aminocidos e the configurao D apesar oritiesL are assigned to each d of groups attached to a chiral center on the L-Serine 7.5 basis of atomic number, atoms with higher atomic numbers having higher pridisto, so encontrados na natureza, especialmente como componentes de certos 28.5 L-Threonine orities (see the box, page 100). L-Tryptophan 33.7 antibiticos como valinomicina, gramicidina e actinomicina D, e na parede The newer (R,S ) system of nomenclature is superior to the older D,L sys5.6 L-Valine celular de certos m icroorganismos. tem in one important way. The configuration of molecules with more than one

12

CH2OH The absolute configuration of ()-glucose.

E P E R described with L O O K nomenclatura. Por exemplo, este sistema pode ser ambguo para molculas com onine, hydroxydois ou mais centros quirais. Para resolver tais on MeteoriteDiscovery of Extraterrestrial Handedness system, L-threCHO CHO acids for their studies, Cronin and Pizzarello ensured o that they ance centers of L-amino acids systems is one problemas sistema (R,S) de nomenclatura de ral can in biological C OH HO of C H were examining H materials that were native to the meteorite and ntriguing features. Prebiotic syntheses amino d can thus each molculas quirais foi proposto em 1956 por not earth-derived contaminants.) Four -dialkyl amino acids e expected to produce equal amounts of L- and CH CH OH Some kind of enantiomeric selection process must 2 -methylalloisoleucine, -methylnorvaline, 2OH -methylisoleucine, to two pairs of Cahn, d to select L-amino acids over their D-counterparts and isovalinewere found to haveRobert an L-enantiomeric excess Sir of 2 Christopher Ingold e Vladimir L -Glyceraldehyde f the asymmetents of proteins. Was it random chance that chose to 9%. D -Glyceraldehyde Prelog. Neste sistema mais verstil, as This may be the first demonstration that a natural L-enanrs? four stereohe
tiomer enrichment occurs in certain cosmological environments. Could these observations be relevant to the emergence of L-enantiomers as the dominant amino acids on the earth? And, if so, COOH could there be life elsewhere in the universe that is based upon + the same amino acid C handedness? H NH

A despeito de sua ampla aceitao, existem problemas com o sistema D, L de

prioridades so assinaladas para cada um dos grupos ligados ao centro quiral tomando como base o nmero atmico, tomos com maior 3 nmero atmico tendo maior prioridade. CH2OH CH2OH related to the NH3 Este novo sistema (R,S) de nomenclatura n as Fischer proL -Serine D -Serine CHbonds CHcomCH C COOH cate 3 2 superior ao antigo sistema D,L de maneira bonds extending Figura 13 A configurao dos L- CH3 CH3 importante. A configurao as molculas com aminocidos comuns podem ser 2-Amino-2, 3-dimethylpentanoic acid* que um centro quiral pode ser mais relacionadas com a configurao do Amino acids found in the mais Murchison meteorite NH3 NH3 L(-)-gliceraldedo como mostrado. facilmente, completamente e de forma direta Estes desenhos so conhecidos como C COOH CH3 CH2 CH2 C COOH descrito com a notao (R,S). Vrios projees de Fischer. As linhas aminocidos, incluindo isoleucina, treonina, horizontais indicam ligaes para CH3 CH3 aline -Methylnorvaline cima do plano da pgina a partir do hidroxiprolina e hidroxilisina tem dois centros carbon central. As linhas verticais mers of this amino acid include the - and -forms of -methylisoleucine and -methylalloisoleucine. quirais. No sistema (R,S), L-treonina (2S,3R)- so ligaes que se 275: projetam para Pizzarello, S., 1997. Enantiomeric excesses in meteoritic amino acids. Science 951955. treonina. Um composto qumico com n centros baixo do plano do papel. quirais pode existir de 2n estruturas isomricas isomers of isoleucine are shown in Figure 4.14. The isomer obtained from digests podem ento cada um ter 4 diferentes, e os quatro aminocidos listados of natural proteins is arbitrarily designated L-isoleucine. In the (R,S ) system, diferentes c onfiguraes isomricas. Isto to conta para dois pares de L-isoleucine is (2 S, 3S )-isoleucine. Its diastereomer is referred as L-alloisoleucine. The D-enantiomeric pair of isomers is named in a similar manner. enantimeros. Os ismeros que diferem na configurao de somente um dos centros assimtricos so ismeros no especulares ou diasteroismeros. Os COOH COOH COOH COOH quatro estereoismeros de The stereoisomers of + + + + onine. The structures at the C H HN H C NH HN C H H C NH isoleucina so mostrados na urally occurring isomers. Figura 14. O ismero obtido H C CH H C CH HC HC C H C H da digesto de protena CH CH CH CH -Isoleucine -Isoleucine -Alloisoleucine -Alloisoleucine natural arbitrariamente (2S,3S)-Isoleucine (2R,3R)-Isoleucine (2S,3R)-Isoleucine (2R,3S)-Isoleucine designado L-isoleucina. No COOH COOH COOH COOH + + + + sistema (R,S) a L-isoleucina C H HN C H HN H C NH H C NH (2S,3S)-isoleucina. Seu HO C H HO C H H C OH H C OH diasteroismero chamado CH CH CH CH como L-alo-isoleucina. O par -Threonine -Threonine -Allothreonine -Allothreonine de ismeros D-enantiomrico Figura 14 - Estereoismeros da isoleucina e treonina. As estruturas da extrema esquerda so as de ocorrncia nomeado de maneira natural. similar.
D L

f carbon compoundseven amino acidsfrom sources might provide deeper insights into this Cronin and Sandra Pizzarello have examined the COOH istribution of unusual amino acids obtained from + meteorite, which struck the earth on September C H H3N Murchison, Australia. (By selecting unusual amino

Propriedades espectroscpicas dos aminocidos

Um dos mais importantes e excitantes avanos na moderna bioqumica tem sido a aplicao de mtodos espectroscpicos que medem a absoro ou emisso de energia de diferentes frequncias pelas molculas e tomos. Estudos espectroscpicos de protenas, cidos nuclicos e outras biomolculas esto 13

provendo muitas novas descobertas sobre a estrutura e processos dinmicos nestas molculas. Espectro ultravioleta Muitos detalhes da estrutura e qumica dos aminocidos tem sido elucidados ou, pelo menos, confirmados, por medies espectroscpicas. Nenhum dos aminocidos absorve luz na regio visvel do espectro eletromagntico. Mas, vrios aminocidos, entretanto, absorvem radiao ultravioleta, e todos absorvem na regio do infravermelho. A absoro de energia pelos eltrons quando eles passam a estados de energia mais elevados ocorre na regio ultravioleta/visvel do espectro. Somente os aminocidos aromticos, fenilalanina, tirosina e triptofano, exibem 40,000 significante absoro no ultravioleta abaixo de 20,000 10,000 250 nm, como mostrado na Figura Figura 15. 5,000 Trp Estas fortes absores podem ser utilizadas para 2,000 1,000 determinaes espectroscpicas de Tyr 500 concentrao proteica. Os aminocidos 200 aromticos tambm exibem fluorescncia 100 Phe 50 relativamente fraca, e foi descoberto 20 recentemente que o triptofano pode exibir 10 200 220 240 260 280 300 320 fosforescncia uma emisso de luz de durao
Molar absorptivity,

Wavelength (nm)

The ultraviolet absorption spectra of the aromatic amino acids at pH 6. FIGURE 4.15 Figura 15 - Espectro de absoro do

(From Wetlaufer, D.B., 1962. Ultraviolet spectra of proteins and amino acids. Advances in Protein Chemistry 17 :303 390.)

ultravioleta de aromticos em pH 6,0.

aminocidos

relativamente longa. Estas propriedades de fluorescncia e fosforescncia so especialmente teis no estudo de estrutura e dinmica de protenas.

ressonncia magntica nuclear (RMN), uma tcnica espectroscpica que envolve a absoro de energia de radiofrequncia por certos ncleos na presena de um campo magntico, tem Nuclear Magnetic Resonance Spectra tido importante papel na resonance caracterizao qumica dos aminocidos e protenas. The development in the 1950s of nuclear magnetic (NMR), a spectroscopic technique that involves the absorption of radio frequency energy by Vrios princpios importantes surgiram destes estudos. Primeiro, o certain nuclei in the presence of a magnetic field, played an important part in 1 deslocamento qumico d os prtons de aminocidos depende de seu ambiente the chemical characterization of amino acids and proteins. Several important 1 of principles rapidly emerged studies. First, the chemical shift qumico e from do these estado de ionizao do aminocido. Segundo, a variao na amino acid protons depends on their particular chemical environment and eletrnica durante uma titulao transmitida atravs da cadeia thus on the densidade state of ionization of the amino acid. Second, the change in electron densitycarbnica during a titration is transmitted throughout the carbon chain in pores alifticas dos aminocidos nos aminocidos alifticos e as the aliphatic amino acids and the aliphatic portions of aromatic amino acids, aromticos, pelas variaes nos deslocamentos qumicos de as evidenced by changes in thecomo chemicalevidenciado shifts of relevant protons. Finally, the magnitude of the coupling constants between protons on adjacent carbons prtons relevantes. Finalmente, a magnitude das constantes de acoplamento depends in some cases on the ionization state of the amino acid. This apparentre os p rtons de c arbonos ain djacentes depende em alguns casos, do estado de ently reflects differences in the preferred conformations different ionization states. Proton NMR spectra of two amino acids are shown in Figure 4.16. ionizao dos aminocidos. Isto aparentemente reflete as diferenas nas Because they are highly sensitive to their environment, the chemical shifts of individual NMR signals can detect the pH-dependent ionizations of amino estados de ionizao. Os espectros conformaes preferidas pelos diferentes 13
acids. Figure 4.17 shows the C chemical shifts occurring in a titration of lysine. Note that the chemical shifts of the carboxyl C, C, and C carbons of lysine are sensitive to dissociation of the nearby -COOH and -NH3 protons (with pK a values of about 2 and 9, respectively), whereas the C and C carbons are sensitive to dissociation have been of the -NH 3 group. Such measurements very useful for studies of the ionization behavior of amino acid residues in pro1 O deslocamento qumico para qualquer
1

phorescence a relatively long-lived emission of light. These fluorescence and phosphorescence properties are especially useful in the study of protein strucO desenvolvimento dos anos de 1950 da ture and dynamics (see Chapter 6).

Espectro de ressonncia magntica nuclear

The chemical shift for any NMR signal is the difference in resonant frequency between the observed signal and a suitable reference signal. If two nuclei are magnetically coupled, the NMR signals of these nuclei split, and the separation between such split signals, known as the coupling constant, is likewise dependent on the structural relationship between the two nuclei.

sinal de RMN a diferena na frequncia ressonante entre o sinal observado e um sinal referncia disponvel. Se dois ncleos so magneticamente acoplados, os sinais de RMN destes ncleos separados e a separao entre tais sinais, conhecidos como constante de acoplamento, dependente da relao estrutural entre os dois ncleos. 14

Relative intens

CH3

Relative intens

H3N

CH2

OH

4.6
10 9

Separation and Analysis of Amino Acid Mixtures

101

RMN de prtons de dois aminocidos so mostrados na 3Figura 16. Como eles 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 4 2 1 0

ppm ppm

Relative intensity

Relative intensity

L-Alanine Proton NMR spectra of several amino acids. Zero on the chemical shift COOH scale is defined by the resonance of tetramethylsilane (TMS). (Adapted from Aldrich Library + of NMR Spectra.) H3N C H

FIGURE 4.16

L-Tyrosine

COOH + H3N C CH2 H

CH3

teins. More sophisticated NMR measurements at very high magnetic fields are also used to determine the three-dimensional structures of peptides and even small proteins.

OH

4.6

Separation and Analysis of Amino Acid Mixtures

10 9 8 7 6 5 ppm 4 3 2 1 0 10 9 8 7 6 5 ppm 4 3 2 1 0

Chromatographic Methods

FIGURE 4.16 Proton NMR spectra of several amino acids. Zero on the chemical shift The purification and analysis of individual amino acids from complex definido pela essonncia o tetrametilsilano (mixtures TMS). from Aldrich Library scale is defined by r the resonance of d tetramethylsilane (TMS). (Adapted was once a of very NMRdifficult Spectra.) process. Today, however, the biochemist has a wide variety of methods available for the separation and analysis of amino acids, or so altamente sensveis a seu ambiente, we os deslocamentos qumicos dos sinais for that matter, any of the other biological molecules and macromolecules

Figura 16 Espectro de RMN de vrios aminocidos. O zero da escala de deslocamento qumico

RMN individuais podem detectar as ionizaes dependentes do pH dos teins. More sophisticated NMR measurements at very high magnetic fields A are Figura 17 mostra os aminocidos. also used to determine the three-dimensional structures of peptides and even 14 deslocamentos qumicos de C13 que ocorrem small proteins. pK 12 numa titulao da lisina. Note que os 10 deslocamentos qumicos dos carbonos 4.6 Separation and Analysis of Amino Acid Mixtures pK 8 carboxlicos C, C e C da lisina so sensveis a carboxyl 6 Chromatographic Methods dissociao dos prtons -COOH e -NH3+ C The 4 purification and analysis of individual amino acids from complex mixtures (com valores de pKa de cerca de 2 e 9 was once a very difficult process. Today, however, the biochemist has a wide 2 pK respectivamente), variety of methods available for the separation and analysis of amino acids, or enquando o C e C so for that matter, any of the other biological molecules and macromolecules we sensveis a dissociao do grupo -NH3+. Tais 4700 4500 4300 1400 1200 1000 800 600 Chemical shift in Hz (vs. TMS) medidas tem sido muito teis para estudos FIGURE 4.17 A plot of chemical shifts versus pH for the carbons of lysine. Changes in do comportamento de ionizao dos resduos chemical shift are most pronounced for atoms near titrating groups. Note the correFigura 17 14 Grfico do the deslocamento All chemical spondence between the pK values and the particular chemical shift changes. aminocidos em protenas. Mais qumico versus pH ppara os carbonos da de shifts are defined relative to tetramethylsilane K (TMS). (From Suprenant, H., et al., 1980. 12 Journal of Magnetic Resonance 40:231243.) lisina. As variaes nos deslocamentos sofisticadas medidas de RMN em campo qumicos so mais pronunciadas para os 10 pK aos grupos que se magnticos ainda mais fortes so tambm tomos prximos 8 titulam. Note a correspondncia entre os utilizadas para determinar as estruturas de 6 valores de pKas e carboxyl as variaes tridimensionais de peptdeos e mesmo de C deslocamento q umico c orrespondentes. 4 pequenas protenas.
3

pH

pH

pK 1 4500 4300 1400 1200 1000 800 Chemical shift in Hz (vs. TMS) 600

4700

FIGURE 4.17

Separao e anlise de misturas de aminocidos

Journal of Magnetic Resonance 40:231243.)

A plot of chemical shifts versus pH for the carbons of lysine. Changes in chemical shift are most pronounced for atoms near the titrating groups. Note the correspondence between the pK a values and the particular chemical shift changes. All chemical shifts are defined relative to tetramethylsilane (TMS). (From Suprenant, H., et al., 1980.

Mtodos cromatogrficos

A purificao e anlise de aminocidos individuais de misturas complexas era um processo muito difcil. Hoje em dia, no entanto, o bioqumicos tem uma ampla variedade de mtodos disponveis para a separao e anlise de aminocidos, ou da mesma maneira, de quaisquer molculas e macromolculas biolgicas que encontremos. Todos estes mtodos levam vantagem das diferenas relativas nas caractersticas fsicas e qumicas dos aminocidos, particularmente caractersticas de ionizao e solubilidade. Os mtodos importantes para aminocidos incluem separaes baseadas em propriedades de partio (a tendncia a se associar a um solvente ou fase em detrimento de outro) e 15

separaes baseadas nas cargas eltricas. Em todos os mtodos de partio discutidos aqui, as molculas de interesse so colocadas (ou foradas) a fluir atravs de um meio consistindo de duas fases slida-lquida, lquida-lquida ou gs-lquida -. Em todos estes mtodos as molculas devem mostrar uma preferncia para associao com uma ou outra fase. Desta maneira, as molculas se particionam, ou distribuem entre as duas fases baseado em suas propriedades particulares. A razo das concentraes dos aminocidos (ou outras espcies) nas duas fases chamada de coeficiente de partio. Em 1903, uma tcnica de separao baseada no repetido particionamento entre fases foi desenvolvido por Mikkail Tswett para a separao de pigmentos vegetais (carotenos e clorofilas). Tswett, um botnico russo, eluiu solues de pigmentos atravs de colunas de alumina finamente pulverizada e outro meio slido, permitindo que os pigmentos se particionassem entre o solvente lquido e o suporte slido. Devido a prpria natureza colorida dos pigmentos ento separados, Tswett chamou sua tcnica de cromatografia. Este termo agora aplicado a uma ampla variedade de mtodos de separao, a despeito dos produtos serem coloridos ou no. O sucesso de todas as tcnicas de cromatografia depende do particionamento microscpico repetido de uma mistura solvel entre as fases disponveis. Quanto mais frequente este particionamento pode ser feito ocorrer dentro de um dado limite de tempo ou de um dado volume, mais eficiente o resultado da operao. Os mtodos 4.6 Separation and Analysis of Amino Acid Mixtures 103 cromatogrficos tem avanado rapidamente nos ltimos anos, devido, em parte, ao FIGURE desenvolvimento de novos 4.18 Cation (a) and anion (b) exchange resins commonly used for biosofisticados materiais de fase (a) Cation Exchange Media Structure chemical separations. slida. Os mtodos O importantes para separao de S O Strongly acidic, polystyrene resin (Dowex50) aminocidos incluem O cromatografia de troca inica, O cromatografia gasosa, e C O CH Weakly acidic, carboxymethyl (CM) cellulose cromatografia lquida de alta O performance. O

Cromatografia de troca inica. A separao de aminocidos e O outros solutos quase sempre feita por cromatografia de (b) Anion Exchange Media Structure troca inica, na qual a molcula de interesse CH trocada por um outro on e + CH N CH Strongly basic, polystyrene resin (Dowex1) retirada de um suporte slido CH carregado. Num tpico CH CH procedimento, solutos numa + Weakly basic, diethylaminoethyl (DEAE) OCH CH N H cellulose fase lquida, normalmente CH CH gua, so passados atravs de Figura 18 - Resinas de troca de (a) ctions e (b) nions colunas preenchidas com uma normalmente utilizadas em preparaes bioqumicas. fase slida porosa, normalmente um leito de +] Cation exchange bead de resina Add mixture of Add Na+ (NaCl)grupos carregados. Increase [Na+] Increase [Na partculas sinttica contendo Resinas contendo before adding sample Asp, Ser, Lys Asp Bead cargas positivas atravs solutos carregados negativamente e so chamadas de
Weakly acidic, chelating, polystyrene resin (Chelex100) CH2 N CH2C O
3 2 3 3 2 3 2 2 2 3

CH2C

Lys

(a)

Na+ SO3

16
Ser (b) (c) Asp, the least positively charged (d) Serine is eluted next (e) Lysine, the most positively charged

CH3 Strongly basic, polystyrene resin (Dowex1) CH2 N + CH3

CH3 CH2CH3

trocadoras de nions. Os suportes slidos possuindo cargas negativas atraem as CH CH espcies positivamente carregadas e so chamadas de trocadores de ctions. Vrias resinas tpicas trocadoras de ctions e de nions com diferentes tipos de grupos carregados so mostrados na Figura 18. A fora da acidez ou basicidade destes grupos e seu nmero por unidade de
2 3

Weakly basic, diethylaminoethyl (DEAE) cellulose

OCH2CH2

Cation exchange bead before adding sample Bead

Add mixture of Asp, Ser, Lys Asp

Add Na+ (NaCl)

Increase [Na+]

Increase [Na+]

Lys

Na+ SO3
104

Ser (b) (c) Asp, the least positively charged (d) Serine is eluted next (e) Lysine, the most positively charged

(a)

Chapter 4

Amino Acids

resin. A gradient of an appropriate salt is then amino acid, is applied to the column, and the amino acid, is solute molecules are competitively (and sequentially) displaced (eluted) from eluted first eluted last the column by the rising concentration of cations in the gradient, in an order Figura 19 - Operao de uma coluna de troca inica separando uma mistura de Aps, Ser e Lys. (a) a that is inversely related to their affinities for the column. The separation of a FIGURE 4.19 Operation of a cation exchange separating a is mixture of Asp, 4.19 and 4.20. mixture of amino column, acids on such a column shown in Figures resina atinica no incio, na forma de Na+. (b) Uma mistura de Asp, Ser e Lys adicionada a coluna (b) A Ser, andc Lys. (a) The cation exchange resin in taken the beginning, Na form. Figure 4.21, from a now-classic 1958 paper bymixture Stanford of Moore, Darrel contendo aLys resina. (c) m gSpackman, radiente de the sal eluente (por exemplo, NaCl) adicionado a coluna. Asp, o and William Stein, shows typical separation of the common amino Asp, Ser, and is added to U the column containing resin. (c)aA gradient of the elutThe events occurring in this separation are essentially those depicted in ing salt (e.g., NaCl) is added to the acids. column. Asp, the least positively charged amino acid, nico aminocido varregado positivamente eludo primeiro. (d) Com o aumento da concentrao Figures 4.19 and 4.20. The amino acids are applied to the column at low pH is eluted first. (d) As the salt concentration increases, Ser is eluted. (e) As the salt concen(4.25), under which conditions the acidic amino acids (aspartate and glutasalina, Ser eluda. (e) Com o posterior aumento da concentrao salina Lys, o mais positivamente tration is increased further, Lys, the mate, mostamong positively charged of the three amino acids, is others) are weakly bound and the basic amino acids, such as argicarregado eluda por ltimo. eluted last. dos trs aminocidos, nine and lysine, are tightly bound. Sodium citrate solutions, at two different concentrations and three different values of pH, are used to elute the amino acids gradually from the column. A typical HPLC chromatogram using precolumn derivatization of amino acids with o-phthaldialdehyde (OPA) is shown in Figure 4.22. HPLC has rapidly become the chromatographic technique of choice for most modern biochemists. The very high resolution, excellent sensitivity, and high speed of this technique usually outweigh the disadvantage of relatively low capacity.

volume da resina determinam o tipo e fora da ligao de um trocador. Grupos cidos totalmente ionizados tais como cidos sulfnicos resultam e um trocador com carga negativa que liga ctions muito fortemente. cidos fracos ou grupos bsicos produzem resinas cuja troca (e capacidade de ligao) dependem do pH do solvente eluente. A escolha de uma resina apropriada depende da fora de ligao desejada. As cargas em tais fases slidas devem ser contrabalanceadas por ons de cargas opostas na soluo (contra ons). A lavagem de uma resina trocadora ctions, tal FIGURE 4.20 Figura 20 - Separao de aminocidos numa coluna trocadora de ctions. de como Dowex-50, que tem grupos fenil-SO3- fortemente cidos, com uma soluo de NaCl resulta na formao da chamada forma sdica da resina (veja Figura 19). Quando a mistura cuja separao desejada adicionada na coluna, as molculas de soluto carregadas positivamente deslocam os ons Na+ e se ligam a resina. Um gradiente de um sal apropriado ento aplicado a coluna, e as molculas de soluto so competitiva (e sequencialmente) deslocadas (eludas) da coluna pelo aumento da concentrao de ctions no gradiente, de maneira que inversamente relacionada a suas afinidades pela coluna. A separao de uma mistura de aminocidos em tal coluna mostrada na
Sample containing several amino acids Elution column containing cationexchange resin beads The elution process separates amino acids into discrete bands Eluant emerging from the column is collected Asp Ser Lys Some fractions do not contain amino acids

Amino acid concentration

Elution time

The separation of amino acids on a cation exchange column.

17

Relative fluorescence

% solvent B

Figura 19 e Figura 20. A Figura 21 tirada de um 4.6 Separation and Analysisartigo of Amino Acidclssico Mixtures 105 de Stanford Moore, Darrel Spackman e William Stein, pH mostra uma separao pH tpica de 3.25 4.25 0.2 Na citrate 0.2 Na citrate Os aminocidos comuns. pH 3.25 pH 4.25 0.2 Na citrate 0.2 Na citrate 0.30 Valine ocorrem Methionine eventos que 0.30 Valine Methionine Isoleucine Threonine Isoleucine 0.25 Serine nesta separao so Threonine Serine 0.25 Leucine Leucine essencialmente os 0.20 0.20 Glutamic Aspartic Glutamic Glycine Aspartic Glycine acid acid acid acid mesmos mostrados na Alanine Alanine Phenyl0.15 Phenyl0.15 alanine alanine Tyrosine Figura 19 e Figura 20. Os Tyrosine 0.10 0.10 aminocidos aplicados a Cystine 0.05 Proline Cystine 0.05 coluna em p H baixo (4,25), Proline 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 0 sob tais condies os Volume of eluant 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 0 aminocidos cidos Volume of eluant pH 5.28 (aspartato e glutamato, 0.35 Na citrate 0.30 pH 5.28 of a synthetic mixFIGURE 4.21 Chromatographic fractionation entre outros) so Phenylalanine 0.35 Na citrate ture of amino acids on ion exchange columns using Amberlite IR-120, a sulfonated polystyrene resin similar to Dowex-50. A second 0.25 fracamente ligados e os 0.30 conditions is used to resolve the basicFIGURE 4.21 Chromatographic fractionation of a synthetic mixcolumn with different buffer Tyrosine Phenylalanine amino acids. ture of amino acids on ion exchange columns using Amberlite 0.20 aminocidos bsicos, tais IR-120, a sulfonated polystyrene resin similar to Dowex-50. A second 0.25 Lysine column with different buffer conditions is used to resolve the basic Tyrosine 0.15 como arginina e lisina, so amino acids. (Adapted from Moore, S., Spackman, D., and Stein, W., 1958. Histidine 0.20 + Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. Analytical Chemistry NH firmemente ligados. 0.10 Lysine 30 :11851190.) Arginine 0.15 Solues de citrato de 0.05 Histidine + NH sdio, em duas diferentes 0.10 0 25 50 75 100 125 Arginine concentraes e trs Volume of eluant 0.05 Figura 21 - Fracionamento cromatogrfico de uma mistura diferentes valores de pH, sinttica de aminocidos em coluna de 0troca so utilizadas para diluir 25 inica 50 75 utilizando 100 125 Amberlite IR-120, uma resina de poliestireno sulfonado Volume of eluant similar gradualmente os a Dowex-50. Uma segunda coluna com diferentes 100 condies de FIGURE 4.22 HPLC chromatogram of aminocidos d a c oluna. tamponamento foi utilizada para resolver os aminocidos amino acids employing precolumn derivatization with OPA. Chromatography was carried 50 Ile bsicos. -Ala Tyr ODS column using a out on an Ultrasphere Arg Val

4.6

Separation and Analysis of Amino Ac

Amount of solute

Amount of solute

Amount of solute

(Adapted from Moore, S., Spackman, D., and Stein, W., 1958. Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. Analytical Chemistry 30 :11851190.)

Amount of solute

Gln Asn Ser Um tpico Asp Glu cromatograma HPLC utilizando uma pr- coluna de derivatizao de aminocidos com o- 0 5 10 15 20 ftaldialdedo (OPA) Time (minutes) mostrado na Figura 22. O HPLC rapidamente tem se tornado a tcnica cromatogrfica de escolha

Thr Gly

Ala

Met Trp

Phe Lys

complex tetrahydrofuran:methanol:0.05 M sodium acetate (pH 5.9) 1:19:80 to methanol:0.05 M sodium acetate (pH 5.9) 4:1 gradient at a flow rate of 1.7 mL/min.

100 Ile 50 0 Lys

% solvent B

Relative fluorescence

(Adapted from Jones, B. N., Pbo, S., and Stein, S., 1981. Amino acid analysis and enzymic sequence determination of peptides by an improved o-phthaldialdehyde precolumn labeling pro-Ala cedure. Journal of Liquid Chromatography 4 :56586.) Tyr

FIGURE 4.22

25

Asp

30

Glu

35 Asn

Ser

Gln

Arg Thr Gly

Ala

Val

Met Trp

Phe

HPLC chr amino acids employing prec tion with OPA. Chromatogra out on an Ultrasphere ODS complex tetrahydrofuran:me sodium acetate (pH 5.9) 1:1 methanol:0.05 M sodium ace gradient at a flow rate of 1.7

(Adapted from Jones, B. N., Pbo, S. Amino acid analysis and enzymic sequ tides by an improved o-phthaldialdehyd cedure. Journal of Liquid Chromato

10

15 20 Time (minutes)

25

30

35

para os modernos bioqumicos. A resoluo muito alta, excelente sensitividade e alta velocidade desta tcnica normalmente excedem a desvantagem de relativa pouca capacidade.

Figura 22 Cromatograma de HPLC da separao de aminocidos empregando uma pr-coluna de derivao com OPA. A cromatografia foi feita em coluna Ultrasphere ODS utilizando gradient de tetraidrofurano:methanol:acetate de sdio 0,05 M (pH 5,9) 1:19:80 a methanol: acetate de sdio 0,05 M (pH 5,9) com fluxo de 1,7 mL/min.

18