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Recibido el 27-10-2010

PREPARACIN DE PARTCULAS DE QUITOSANO RETICULADAS CON TRIPOLIFOSFATO Y MODIFICADAS CON POLIETILENGLICOL

Nadia Rodrguez Hamamura , Ana Valderrama Negrn , Hugo Alarcn Cavero , c Alcides Lpez Milla RESUMEN Se han preparado partculas de quitosano (CS) a escala nanomtrica para posteriormente realizar estudios de cargado y liberacin de frmacos. El quitosano fue caracterizado por FTIR y valoracin conductimtrica para determinar su porcentaje de desacetilacin y mediante viscosimetra para obtener su masa molar. Se aplic el mtodo de gelacin inica para la preparacin de las partculas de CS entrecruzadas con aniones tripolifosfato (TPP) y modificadas con polietilenglicol (PEG), obtenindose tamaos de partcula en un rango de 100 a 400nm. La caracterizacin de las partculas de CS-TPP modificadas con PEG se realiz usando las tcnicas de DLS, TEM y FTIR. Adems, se estudiaron los factores que influencian la estabilidad de las partculas de CS, como el efecto del tiempo, fuerza inica y pH. Palabras clave: Quitosano, gelacin inica, nanopartculas.
* a b

PREPARATION OF CHITOSAN PARTICLES CROSS-LINKED WITH TRIPOLYPHOSPHATE AND MODIFIED WITH POLYETHYLENE GLYCOL
ABSTRACT Chitosan(CS) particles were prepared to nanoescale for further studies of loaded and released drugs. The chitosan was characterized by viscosimetry to obtain the molar mass. Titration conductivity and FTIR were performed in able to determine the percentage of deacetylation. Ionic gelation was the method used for the preparation of CS particles cross-linked with tripolyphosphate (TPP) anions and modified with polyethylene glycol (PEG) to obtain size in a range of 100 to 400nm. Characterization of CS-TPP particles modified with PEG was performed using DLS, TEM and FTIR techniques. The factors that influence the stability of the CS particles, as the effect of time, ionic strength and pH were also studied. Key words: Chitosan ,ionic gelation, nanoparticles. INTRODUCCIN El quitosano (CS), poli-(1-4)-2-amino-2-desoxi-D-glucosa obtenido a partir de la quitina, es el segundo polisacrido ms abundante y un polielectrolito catinico presente en la naturaleza. El CS ha demostrado tener caractersticas de biocompatibilidad favorable y para ser degradado por la lisozima en el suero. Desde un punto de vista biofarmacutico, el CS tiene un gran potencial de servir como potenciador de la absorcin a travs del epitelio intestinal para mejorar sus propiedades mucoadhesivas y de permeabilidad.
*

b c

Laboratorio de Metalofrmacos y Biopolmeros, Universidad Nacional de Ingeniera. Av. Tpac Amaru 210. Lima 25. Per. nadiarh@gmail.com. Laboratorio de Pelculas Delgadas. Universidad Nacional de Ingeniera Laboratorio de Microscopa Electrnica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Ingeniera.

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Recientemente, las partculas polimricas menores de 1000nm estn siendo investigadas como portadoras de frmacos por va oral, con el objetivo de mejorar la asimilacin de los frmacos con bajas caractersticas de absorcin. Algunos investigadores tambin han observado que el nmero de partculas de escala nanomtrica que atraviesan el epitelio intestinal es mayor que el de las microesferas (>1m), haciendo que su preparacin y estudio sea de gran inters. Las partculas polimricas de tamao menor de 1m a partir de polmeros biodegradables y biocompatibles son buenos candidatos como portadores y administradores de frmacos, ya que se espera que sean absorbidos en forma intacta en el tracto gastrointestinal tras su administracin oral 1. Las partculas de quitosano fueron preparadas por gelacin inica del quitosano con aniones de tripolifosfato (TPP) y fueron modificadas con el polmero polietilenglicol (PEG). Al no formar redes permanentes porque no se da la unin qumica irreversible, no tienen problemas de toxicidad en humanos, ya que se biodegradan y reabsorben in vivo. Las partculas recubiertas de PEG se han descubierto como grandes potenciales en la aplicacin teraputica para la liberacin controlada de frmacos y el suministro de medicamentos a sitios especficos. Pocos estudios han tratado de investigar las partculas de quitosano recubiertos con PEG. Las partculas recubiertas con PEG fueron concebidas con la intencin de hacer estas partculas ms estables en los fluidos fisiolgicos, de ah nuestro inters en su preparacin. PARTE EXPERIMENTAL Materiales Quitosano en polvo, adquirido de Sigma- Aldrich Chemistry, Inc, USA; como Chitosan from crab shells > 75% deacetilated. Polietilenglicol 20000Da, adquirido de Merck-Schuchardt. Tripolifosfato de sodio, adquirido de Sigma- Aldrich Chemistry. Todos los dems reactivos qumicos fueron de grado analtico para anlisis. Caracterizacin fisicoqumica del quitosano Porcentaje de humedad Se pesaron muestras de quitosano y se llevaron a peso constante calentndolos en un horno a 105 C. Finalmente, se pesaron las muestras secas. Contenido de cenizas Se pes una muestra de quitosano y se coloc en una mufla a 800C durante 6h. Finalmente, se pes el residuo obtenido tras la calcinacin. Contenido de material insoluble Se filtr al vaco la solucin de quitosano al 2% en cido actico. El papel de filtro rpido con material insoluble se sec en el horno hasta la determinacin del peso constante. Porcentaje de desacetilacin Espectroscopa Infrarroja. Para obtener el espectro IR de las pelculas de CS se utiliz el espectrmetro infrarrojo con transformada de Fourier FTIR Shimatzu 8300 con frecuencia de -1 4000-400cm . Se prepararon las pelculas de quitosano tomando como base el procedimiento 2 de Baxter . La solucin se verti en una superficie de plstico, buscando una dispersin homognea del contenido manteniendo la muestra a 60 C por 24 horas. La pelcula se lava con una solucin al 8% de amoniaco en metanol y finalmente con metanol. Nuevamente, se mantiene la muestra a 60C por 20 min y luego en un desecador hasta el momento de la medida por FTIR. Valoracin conductimtrica. Para obtener la curva de valoracin conductimtrica se utiliz el conductmetro, Orin 142. Para esto se pesaron 200mg de quitosano y se disolvieron en

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5mL de HCl 1,0 M. Luego, se agregaron 450mL de NaCl 0,001 M, y se llev a agitacin para lograr una solucin uniforme. Esta solucin se titul conductimtricamente con 60mL de NaOH 0,1M estandarizado. La titulacin se realiz descargando 0,5mL de NaOH 0,1M por cada medida. Masa molecular Las medidas de viscosidad y densidad de las soluciones de quitosano se realizaron con un picnmetro con termmetro y capilar lateral con caperuza y un viscosmetro Ostwald Cannon Fenske rutina Serie 9721-A50 tamao 400, de 20,3cm de longitud y 5mm de dimetro. Se prepar una solucin 0,1M de CH3COONa en 0,2M de CH3COOH que se utiliz como disolvente (buffer), para preparar las diferentes concentraciones de quitosano: 0,5%, 0,25%, 0,125% y 0,0625%(w/v). Se midieron la densidad y viscosidad de las disoluciones de quitosano. Estas mediciones se realizaron en un bao de temperatura constante de 30 C, por triplicado. Las medidas de viscosidad y densidad tambin se realizaron para el buffer y el agua destilada. Preparacin de las partculas de quitosano Las partculas de CS se prepararon tomando como base el procedimiento de Calvo et al. 3. Se realizaron diversas pruebas con el fin de obtener el tamao de partculas en suspensin deseado, variando la concentracin de CS y de TPP. Se prepararon soluciones de cido actico de las siguientes concentraciones 0,9; 1,5; 3; 4,5; 6 y 7,5mg/mL, en la que se disolvi el quitosano a 0,6; 1; 2; 3; 4 y 5mg/mL respectivamente. Se dej reposando la solucin de quitosano por 24horas. Las partculas de quitosano no disueltas se filtraron. Se llev la solucin a pH 4,6 con hidrxido de sodio, 1N. Se agreg polietilenglicol a la solucin de quitosano, bajo agitacin magntica y a temperatura ambiente, obtenindose soluciones de PEG-quitosano con diferentes concentraciones de PEG (0, 10, 30, 50 mg/mL). Luego, bajo agitacin magntica y a temperatura ambiente, se agreg gota a gota con ayuda de una jeringa insulnica, 4 mL de solucin acuosa de tripolifosfato de sodio (TPP) de concentracin 0,6 1mg/mL a 10 mL de la solucin PEG-quitosano, respectivamente. Finalmente, se ultracentrifugaron las soluciones obtenidas a 10000rpm, 18 C durante 15 minutos para separar cualquier partcula de mayor tamao que se haya podido formar y quede lista la muestra para su caracterizacin. Caracterizacin fisicoqumica de las partculas de quitosano Microscopa de transmisin electrnica (TEM) La morfologa y tamao de las partculas de quitosano fueron examinadas usando el microscopio electrnico de transmisin, PHILIPS M300 80keV. Dispersin de luz dinmica (DLS) Se us el equipo de dispersin de luz dinmica (DLS), Brookhaven 90 Plus para hallar el dimetro hidrodinmico y la distribucin del tamao de las partculas obtenidas. Espectroscopa IR de reflectancia Para obtener el espectro IR de las partculas de quitosano se utiliz el espectrmetro infrarrojo -1 con transformada de Fourier FTIR Shimatzu 8300 con frecuencia de 4000 a 400cm , usando de blanco bromuro de potasio seco. Las partculas de quitosano de las siguientes concentraciones de CS, PEG y TPP en mg/mL (1, 0 y 1), (1, 10 y 1) y (5, 50 y 1), respectivamente; fueron separadas de la suspensin y secadas mediante un liofilizador ABCONCO, LYPH LOCK 12, obteniendo en todos los casos un slido blanco. Estudio de los factores que influencian la estabilidad de las partculas de quitosano Estudio de la variacin del tamao de las partculas de quitosano en el tiempo Las partculas de CS que cumplan con los requisitos de tamao y adems presentaban una
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opalescencia que se mantena estable y en suspensin fueron las de concentracin de CS 1mg/mL, TPP 1mg/mL y PEG (10, 30 y 50 mg/mL). stas fueron las utilizadas para el anlisis. Se realizaron las medidas de tamao de las partculas a cada una de las suspensiones utilizando el DLS. Las medidas se realizaron a los 3, 9 y 17 das. Efecto salino sobre la variacin del tamao de las partculas de quitosano Se prepar una solucin de cloruro de sodio 0,30 mol / L. Se tom 10mL de la suspensin de partculas de quitosano (de concentraciones CS 1mg/mL y TPP 1mg/mL) y se mezcl con 10mL de la solucin salina anteriormente preparada, obtenindose una suspensin de partculas de quitosano en un medio de concentracin salina fisiolgica 0,15mol/L que se mantuvo en agitacin constante. El tamao de las partculas de quitosano se midi, usando el DLS y luego a los 17, 34 y 51 minutos de la mezcla. Efecto salino sobre la variacin del tamao de las partculas de quitosano a diferentes concentraciones de cloruro de sodio Se prepararon soluciones de cloruro de sodio a 0,10 y 0,30 mol/L. Se tomaron 10mL de la suspensin de partculas de CS (de concentraciones CS 1mg/mL y TPP 1mg/mL) y se mezcl con 10mL de la solucin salina 0,10 mol/L anteriormente preparada, obtenindose una suspensin de partculas de CS en un medio de concentracin salina de 0,05mol/L que se mantuvo en agitacin constante. Se realiz lo mismo con la solucin salina de 0,30 mol/L, obtenindose una concentracin salina de 0,15mol/L. El tamao de las partculas de CS se midi, usando el DLS, a los 50 minutos despus de la mezcla. Estudio de estabilidad de las partculas de quitosano a diferentes pH Para las medidas de estabilidad de CS a pH: 1,2 y 7,4; se prepararon soluciones buffer en las que se agregaron la suspensin de partculas de CS (de concentraciones CS 1mg/mL y TPP 1mg/mL), se mantuvieron en agitacin constante y a una temperatura promedio de 37C, utilizando un sistema compuesto de una chaqueta de calefaccin, un termostato y una bomba peristltica. La solucin buffer a pH 1,2 se prepar con 50mL de solucin de cloruro de potasio, KCl 0,2M y 85mL de solucin de cido clorhdrico, HCl 0,2 M; este buffer acta como fluido gstrico simulado. La solucin buffer a pH 7,4 se prepar con 100mL de la solucin de dihidrgeno fosfato de potasio, KH2PO4 0,1M y78,2mL de la solucin de hidrxido de sodio, NaOH 0,1 M, este buffer acta como fluido intestinal simulado. Luego, se hizo un barrido de la solucin de 200 a 400 nm, utilizando un espectrofotmetro UV LaboMed Inc. Se continu realizando las mismas medidas despus de 1 y 24horas. RESULTADOS Y DISCUSIN Caracterizacin fisicoqumica del quitosano Porcentaje de humedad Todas las muestras de quitosano poseen diferentes contenidos de agua, por este motivo el porcentaje de humedad es un parmetro importante que debe considerarse al momento de trabajar con dichas muestras.
(peso hmedo peso seco) 100 peso hm edo (1)

Humedad(%) =

Se obtuvo 7,84% de humedad total, un porcentaje alto y que debe considerarse al momento del pesado para no variar los resultados esperados.
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Contenido de cenizas El contenido de cenizas es indicativo del contenido de materiales inorgnicos presentes en la muestra; se determina de acuerdo a:
Contenido de cenizas(%) = peso cenizas 100 peso total (2)

El contenido de cenizas totales es de 0,2273%; un resultado bajo, lo que es muy importante ya que se quiere orientar el trabajo hacia aplicaciones biomdicas. Contenido de material insoluble El contenido de material insoluble puede venir dado por la presencia de sales insolubles, quitosano poco destilado y otros contaminantes. Se determina de acuerdo a:

Material insoluble(%) =

peso filtrado 100 peso total

(3)

El contenido de material insoluble es 2,87%, informacin que se debe considerar al preparar las soluciones de quitosano a la concentracin deseada. Porcentaje de desacetilacin Espectroscopa infrarroja. El espectro FTIR de las pelculas de quitosano se muestra en la 4 figura 1. Brugnerotto y col. realizaron una extensiva investigacin en la que analizaron 25 muestras de quitina y quitosano de diferentes fuentes y con grados de acetilacin, determinados por espectroscopa RMN, que iban desde 0,5% hasta 97,9%. A partir de los espectros FTIR se toma como banda caracterstica a la localizada a 1 320 cm-1, y como referencia la banda a 1 420 cm-1, obteniendo una correlacin lineal que viene expresada por la siguiente relacin:
DA(%) = 31, 92 (A1320 /A1420 ) 12,20
1418.55 1315.36

(4)

100
1578.63

80 70 60 50 40 30 20 10 0 4000 3000
3300.94

2919.06 2869.88

90

1651.92

2000

Wavenumber (cm )

-1

Figura 1. Espectro FTIR de quitosano.

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1077.17 1033.77

Arbitrary

3365.55

1153.35

1000

896.84

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Tabla 1. Datos de absorbancia

Longitud de %Transmitancia -1 onda(cm ) 1320 1420 80,661577 81,162679 Absorbancia del pico(u.a.) 0,093333 0,090644

Tabla 2. Grupos funcionales caractersticos

Grupo funcional Grupo -OH Grupo N-H Grupo C-H Amida I Doblaje del grupo NH2 Amida III Tensin asimtrica del C -O-C Vibraciones de su estructura piransica Tensin C -H de grupos anomricos

referencia 5
(cm-1 ) 3450 3292 2919 y 2862 1655 1580 1313 1154

(cm-1 ) 3365 3300 2919 y 2869 1652 1579 1315 1153

Exp

Intens. del pico m m s m s s m

1082 y 1032

1077 y 1033

wym

896

896

Aplicando la ecuacin (4) el grado de acetilacin del quitosano es: DA(%)= 19,95 Por lo tanto, el grado de desacetilacin es:
DD(%) = 100 DA DD(%) = 80,05 (5)

En el espectro IR (figura 1), se pueden apreciar las siguientes bandas caractersticas que se muestran en la tabla 2, lo que es consistente con su estructura (figura 2).

Figura 2. Estructura del quitosano.

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Valoracin conductimtrica La titulacin de HCl con NaOH es una titulacin cido fuerte con base fuerte; la reaccin que tiene lugar es:

Cl -(ac) + H +(ac) + Na +(ac) + OH -(ac) Na+(ac) + Cl - (ac) + H 2 O(l)

(6)

Inicialmente la conductividad de la disolucin cida es grande porque los iones H+ tienen una movilidad muy alta. Conforme se va produciendo la neutralizacin, los iones H+ libres reaccionan con cada OH aadido, y van formndose iones Na+ libres que tienen una movilidad menor, esto hace que la conductividad disminuya rpidamente, lo que se manifiesta en la curva (figura 3) como una disminucin casi lineal de la conductividad de la solucin. Hasta que se alcanza el punto mnimo de la curva donde el HCl se ha consumido y empieza la titulacin de los grupos amino protonados:
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80

Conductancia (S/cm)

Volumen de NaOH (mL)

Figura 3. Conductancia especfica vs volumen del titulante NaOH

A continuacin se produce un incremento de la conductividad debido a la neutralizacin de los grupos amino protonados del quitosano. Esta curva presenta cierta curvatura debido a la precipitacin del quitosano, precipitacin que comienza a pH = 6,5. Cuando la neutralizacin se completa, la curva ascendente adquiere una mayor pendiente debido a la incorporacin de los iones OH- libres. Los cambios de pendiente que se observan en los dos puntos mencionados presentan cierta curvatura. Este hecho se debe, en el primer caso, a la disociacin inicial de los grupos amino protonados del quitosano y, en el segundo caso, a la precipitacin del quitosano antes mencionado. De esta forma, la equivalencia se calcula determinando las posiciones de las intersecciones de las ramas correspondientes de la curva. La diferencia entre los dos puntos de interseccin corresponde al volumen de NaOH requerido para neutralizar los grupos amino libres del quitosano, lo que permite determinar el grado de N-acetilacin de la muestra.

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En el punto de equivalencia:

# Eq g ( CIDO ) = # Eq g ( BASE) # Eq g ( R NH w(R NH + ) x

3
+ 3

= # Eq g ( NaOH )

M
Donde:

= N NaOH V NaOH

Normalidad del NaOH: NNaOH= 0,0954N + Volumen de NaOH utilizado para neutralizar grupos NH 3 : VNaOH = 10,1mL Masa de quitosano: wR-NH3(Hmedo) = 0,2006g wR-NH3(seco) = 0,1849g q=1 (nmero de H+ neutralizados de cada NH2).

Reemplazando los datos:

mmol (NH 2 ) g (CS ) = ( 0 ,0954 N )(10 ,1mL) = 5 ,21 (0 ,1849 g )

(7)

Entonces la cantidad de grupos aminos por gramo de quitosano es:

5, 21

mmol ( NH2 ) g (CS )

As, obtenemos el grado de desacetilacin, utilizando la siguiente ecuacin:

NH 2 % =

C NeOH V NaOH 16,1 WCS

(8)

Donde 16,1 es una constante que relaciona el peso equivalente del quitosano. Por lo tanto el grado de desacetilacin del quitosano es:
DD(%NH2) = 83,95

De ambos resultados se obtuvo el DD(%) promedio, siendo del 82%, valor alto. A mayor DD(%) del CS, se presentarn mayor cantidad de grupos amino para protonarse y as habr mayor solubilidad en medio cido.

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Masa molecular La viscosimetra es el mtodo ms utilizado para obtener la masa molecular del quitosano. Se basa en la obtencin de la viscosidad intrnseca [], que est relacionada con la masa molecular en la ecuacin de Mark-Houwink-Sakurada5:

= KM

(9)

Donde, M es la masa molar promedio viscosimtrica y K y son dos constantes que dependen del polmero, del sistema disolvente utilizado y de la temperatura. Al obtener las medidas de densidad y viscosidad de las soluciones de quitosano (tabla 3), se procedi a determinar los valores de los parmetros de la tabla 4.
Tabla 3: Densidades y viscosidades de las soluciones de quitosano a 30 C

Muestra Agua Buffer 1 2 3 4

[CS] (g/100mL) 0 0 0,5000 0,2500 0,1250 0,0625

Densidad (g/mL) 0,99223 1,00137 1,00237 1,00211 1,00198 1,00143

Viscosidad (Pa.s) 0,000797 0,000837 0,016546 0,004239 0,001820 0,001169

Tabla 4: Clculo de las viscosidades relativa, especfica e inherente

Muestra

0,5 0,25 0,125 0,0625 Concentracin (C) (g/100mL) Viscosidad ( ) 0,0165 0,0042 0,0018 0,0012 30C (Pa.s) Viscosidad 19,7683 5,0648 2,1818 1,3968 relativa ( rel) Viscosidad 18,7683 4,0648 1,1818 0,3968 especfica ( esp ) Viscosidad 5,9681 6,4892 6,2412 5,3475 inherente Ln( rel )/C 37,5366 16,2593 9,4544 6,3496 Viscosidad reducida ( esp /C )
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La viscosidad intrnseca es el lmite de la viscosidad inherente y reducida cuando la concentracin se aproxima a cero (C 0). Esta se obtiene graficando Ln(rel)/C y esp/C en funcin de la concentracin y obteniendo su intercepto con la ordenada como se observa en la figura 4.
1800 1600

Viscosidad Intrnseca (L/g)

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

R = 0,9995

R2= 0,9995

0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003

Concentracin (g/mL)

Figura 4. Viscosidad intrnseca vs concentracin

Siendo, []= 400 L/g. Wei Wang 6 report una serie de ecuaciones, en las que se relaciona la masa molecular de una muestra con respecto a la viscosidad intrnseca []. El grado de desacetilacin del quitosano es de 82%, con esto obtenemos los valores de k y :
82% [n] = 0,6432 x 10 -3 Mv0, 98 (mL/g) (10 )

Luego, la masa molecular viscosimtrica del quitosano, es:

Mv = 8,16 x 10 5 Da

Como vemos, la masa molecular del quitosano usado es alta. La masa molecular da una idea de la distribucin del tamao de las cadenas del polmero cuando se encuentran en solucin. Adems, una masa molecular alta nos indica la presencia de cadenas de polmero relativamente largas, generando posible entrecruzamiento entre las cadenas que producen un decrecimiento en la solubilidad.

Preparacin de las partculas de quitosano Las partculas preparadas son hidrogeles fsicos, ya que presentan una red tridimensional formada por uniones que no son completamente estables y son ms dbiles que las uniones covalentes (hidrogeles qumicos). El CS es un policatin y se aprovecha esta propiedad para que interacte mediante fuerzas electrostticas con aniones o molculas aninicas; en nuestro caso con el tripolifosfato (TPP), que es un ion polivalente de pequeo tamao. As, este hidrogel fsico est formado por el CS entrecruzado inicamente por el TPP.
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El proceso de preparacin es relativamente simple y a condiciones suaves, el mtodo usado fue el de gelacin inica, donde el quitosano se disuelve en una solucin acuosa de cido actico para obtener el catin de quitosano.

R-NH2(s) + H 3 O+(ac)

R-NH 3 +(ac) + H 2 O (l)

(11)

Luego, se agrega el PEG hasta disolverse en la solucin de quitosano. A esta solucin se le aade gota a gota con agitacin constante la solucin de TPP polianinica. Debido a la formacin de complejos entre las especies con carga opuesta, el quitosano sufre gelacin inica para formar partculas coloidales (figura5).

Tripolifosfato (TPP)

Quitosano (CS)

Agitacin

Polietilenglicol (PEG)

Formacin espontnea de partculas de CS

Figura 5. Esquema de la preparacin de las partculas coloidales de quitosano

La eficiencia del mtodo de gelacin inica es dependiente de la masa molecular y grado de desacetilacin del quitosano. Cuanto mayor es el peso molecular del quitosano, existe mayor nmero de grupos amino protonados en una solucin cida de quitosano. De este modo, hay un mayor nmero de cargas positivas que pueden interaccionar con las cargas negativas del TPP, lo que se traduce en un mayor grado de entrecruzamiento. Adems, cuanto mayor es el grado de desacetilacin del quitosano, se presentarn mayor cantidad de grupos amino para protonarse, as mayor interaccin inica con el TPP, obteniendo una mayor eficiencia de gelificacin y mayor grado de entrecruzamiento. Al caracterizar al quitosano se obtuvo una masa molar alta de 8,16 x 105 Da y un grado de desacetilacin de 82%; por lo tanto con el quitosano utilizado se debera obtener una alta eficiencia de gelacin. Se realizaron varias pruebas experimentales en la preparacin de las partculas de quitosano. Con la concentracin de CS de 1mg/mL y de TPP de 1mg/mL se obtuvo satisfactoriamente las partculas coloidales con las caractersticas deseadas: suspensin opalescente, que se mantuvo estable por semanas, sin sedimentarse y con el tamao de partcula de 100 a 400nm. Las medidas de tamao realizadas con el DLS se encuentran en la tabla 5, donde los resultados mostraron un grado de polidispersidad aceptable, y la mayor distribucin segn el tamao de las partculas se encuentre a escala nanomtrica.

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Tabla 5: Partculas de CS (1mg/mL) entrecruzadas con TPP (1mg/mL)

[PEG] (mg/mL) 0 10 30 50

Tamao (nm) 129,3 167,8 231,1 311, 3

Polidispersidad 0,199 0,238 0,253 0,264

La microscopa de transmisin electrnica nos mostr un tamao de partcula entre 20-120nm para el CS sin PEG (figura 6a) y de 100 a 400nm para las partculas de CS con PEG (50mg/mL) (figura 6b). Podemos observar que las partculas sin PEG tienen una morfologa esfrica ms definida que las modificadas con PEG, que tienen una forma irregular. Se realizaron las espectroscopas FTIR de las partculas liofilizadas de CS-TPP y CS-TPP modificadas con PEG. En el espectro FTIR del quitosano (figura1) se observan tres picos caractersticos, uno en 3365 cm-1 correspondiente a la (OH), 1153cm-1 para la (COC) y 1579 -1 cm para la (NH2). El espectro de las partculas coloidales CS-TPP (figura7) se muestra diferente a la de quitosano matriz. En el caso de las partculas de CS-TPP el ensanchamiento de la banda correspondiente a la (OH) indica probabilidad de formacin de enlace hidrgeno entre los oxgenos del tripolifosfato y los hidrgenos de los grupos amino del quitosano. La vibracin correspondiente a la flexin NH2 a los 1579 cm-1 desaparece; en cambio, aparecen dos nuevos picos 1638cm-1 y 1700cm-1; esto, probablemente, debido a la protonacin de los grupos NH2 que ahora son iones NH3+ y a la formacin del enlace hidrgeno entre los O-TPP y los H de los grupos amino libres. Para las partculas de CS-TPP modificadas con PEG, los cambios en el perfil del espectro FTIR son similares a los explicados para los de CS-TPP; adems, de que en el espectro con PEG la banda de (O-H) se hace ms pronunciada por la posible formacin del enlace hidrgeno entre el O del PEG con los H-CS. En el espectro tambin se observan bandas caractersticas del PEG en 1104cm-1 correspondiente a la (C-O) y 1340 cm-1 correspondiente a la (CH2).Adems de observarse una banda en 2880cm-1 que le correspondera a la (C-H). a b

Figura 6. Micrografa de partculas de CS entrecruzadas con TPP(a), y modificadas con PEG(b).

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100
NPs de CS-TPP NPs de CS-PEG-TPP

80

Transmitancia (%)

60
1700

3365

1638

40
1340 2880
2515 1104

940

20 4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Longitud de onda (cm )

-1

Figura 7. Espectro FTIR de las partculas de quitosano

Efecto de la modificacin del PEG Como ya vimos con los resultados del TEM (figura 6b), las partculas de CS-TPP modificadas con PEG tienen una forma irregular. La tabla 6 muestra los valores de tamao de las partculas modificadas con PEG. El aumento de tamao a medida que se aumenta la concentracin del PEG, es un buen indicador de la incorporacin del PEG en la estructura de la partcula coloidal.
Tabla 6: Partculas de CS (1mg/mL) entrecruzadas con TPP (1mg/mL)

[PEG] (mg/mL) 0 10 30 50

Tamao (nm) 129,3 167,8 231,1 311, 3

Polidis persidad 0,199 0,238 0,253 0,264

Se ha mencionado anteriormente, gracias a los espectros IR, que la incorporacin de PEG en el sistema de gel es a travs de enlaces de hidrgeno intermoleculares entre los atmos electropositivos del hidrgeno amino del quitosano y los tomos electronegativos de oxgeno de PEG, formando as una red semi-interpenetrada de CS / PEG. El PEG ha sido aadido a la solucin de quitosano antes de la gelificacin. Sin la incorporacin del TPP, el PEG no tiene una interaccin lo suficientemente fuerte para gelificarse con el quitosano, pero los grupos amino del quitosano pueden presentar interaccin con el tomo de oxgeno de PEG. As, el PEG puede competir con los iones TPP en su interaccin con los grupos amino del quitosano. Esto podra crear un menor grado de entrecruzamiento inico y obtener un hidrogel de menor estabilidad mecnica. Por lo tanto, se debe buscar un equilibrio adecuado de PEG y TPP. Con toda la informacin analizada, podramos suponer que el PEG se encuentra recubriendo a la
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partcula aumentando su tamao y neutralizando un poco la carga superficial positiva del CS. As: Las partculas tendrn menor tendencia a juntarse y aglomerarse (figura 8). Comportndose como un agente antiagregante. Da una proteccin frente a la hidrlisis del CS por parte de las hidrolasas del organismo, obteniendo partculas ms estables en los fluidos fisiolgicos. Podra disminuir la velocidad de liberacin del frmaco.

Figura 8. Interaccin entre el CS y PEG.

Estudio de la variacin del tamao de las partculas de quitosano en el tiempo En general, se observa (figura 9), para todas las partculas preparadas de CS-TPP a diferentes concentraciones de PEG, un aumento de tamao que no es muy representativo en ms de dos semanas.
700

600

Tamao promedio (nm)

500

400

300

200

100 0 5 10 15 20

Tiempo (das)

Figura 9. Estudio de la variacin del tamao en el tiempo de las partculas de CS (1mg/mL) entrecruzadas con TPP (1mg/mL).

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Adems, es necesario mencionar que las partculas se encontraban todava en suspensin y con la turbidez caracterstica. Podramos decir entonces que las particulas obtenidas son estables en el tiempo sin variacin de su medio. *En la figura 9 se observa un aumento drstico de tamao (en comparacin a los dems) para el PEG de 50mg/mL; presumimos que se pueda deber a la aglomeracin del PEG alrededor de las partculas, debido a que se encuentra en grandes concentraciones. Efecto inico sobre la variacin del tamao de las partculas de quitosano Se realizaron las medidas a la concentracin de 0,15M ya que es la concentracin salina del fluido fisiolgico. La fuerza inica, I, es una funcin de la concentracin de todos los iones presentes, definida como:

Ic =

1 2

2 cB z B

(12)

B=1

Donde: CB es la concentracin molar de iones B, ZB es la carga de cada ion, y el sumatorio se refiere a cada una de las especies inicas presentes en el medio. As, para la disolucin formada por cloruro de sodio, NaCl, la fuerza inica es igual a la concentracin, dado que en el medio hay iones Na+ y Cl , ambos de igual carga (1) pero signo contrario. Por lo tanto, la fuerza inica del medio es 0,15M. La fuerza inica del medio puede influir sobre el hinchamiento de las partculas, ya que la + presencia de Na en el medio interacta inicamente con los O del TPP, de igual forma el Cl va a interactuar con la amina protonada del CS. Por lo tanto, estos iones competiran por el TPP y CS, debilitando las interacciones entre CSTPP, lo que se traduce en una disminucin del entrecruzamiento y por lo tanto la aparicin del hinchamiento, debido a que se producira un aumento en la separacin de las cadenas del quitosano.
240

Tamao promedio (nm)

220 200 180 160 140 120 100 0 20 40 60

Tiempo (min)

Figura 10. Efecto de la solucin salina fisiolgica en la variacin del tamao de las partculas de CS

En general, se observa un aumento de tamao que no es muy representativo (figura 10). Podramos decir nuevamente que las partculas obtenidas son relativamente estables en una solucin salina fisiolgica.
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Efecto inico sobre la variacin del tamao de las partculas de quitosano a diferentes concentraciones de cloruro de sodio Si se aumenta la fuerza inica del medio de 0M a 0,05M y a 0,15M, se va a esperar un aumento progresivo del tamao de las partculas, debido a que cada vez ms iones compiten por la interaccin con el TPP y CS, debilitando su interaccin inica, disminuyendo su entrecruzamiento y aumentando el hinchamiento, como analizamos anteriormente. Comportamiento que se observa en la figura 11. Podemos concluir que a pesar de ser un hidrogel fsico, con entrecruzamiento inico, caractersticas que no dan una buena estabilidad mecnica, el efecto de hinchamiento con el tiempo y debido al efecto inico no influyen de manera representativa sobre las partculas de CS obtenidas, podramos decir que permanecen relativamente estables, esto es consecuente con los resultados obtenidos experimentalmente de alta masa molecular y porcentaje de desacetilacin del quitosano, que ofrecen a las partculas un mejor entrecruzamiento y as resistencia al hinchamiento.
180 175

Tamao promedio (nm)

170 165 160 155 150 145 140 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 170

Concentracin de NaCl (mmol/L)

Figura 11. Efecto salino en la variacin del tamao de las partculas de CS a diferentes concentraciones de cloruro de sodio.

Estudio de estabilidad de las partculas de quitosano a diferentes pH El hinchamiento es influenciado principalmente por las interacciones inicas entre las cadenas de quitosano, que dependen de la densidad de entrecruzamiento establecidos durante la formacin de la red. Un aumento de la densidad de entrecruzamiento induce una disminucin del hinchamiento y sensibilidad del pH, mejorando la estabilidad de la red. Sin embargo, en un hidrogel fsico, entrecruzado inicamente la densidad de entrecruzamiento se modifica por las condiciones externas despus de la administracin, principalmente por el pH del medio. Influye la densidad de carga global del quitosano y del entrecruzante TPP, los que directamente determinan la densidad de entrecruzamiento, la interaccin y el hinchamiento. En cambio, en los hidrogeles qumicos, entrecruzados covalentemente, la densidad de entrecruzamiento no se modifica despus de la administracin ya que estos hidrogeles estn vinculados por lazos irreversibles. En consecuencia, los hidrogeles entrecruzados inicamente no slo se pueden hinchar en cido, sino tambin en las condiciones bsicas (figura 12)7.

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Se analiz la estabilidad de las partculas de CS(1mg/mL) entrecruzadas con TPP (1mg/mL) a pH 1,2 y 7,4 a 37C, simulando el fluido gstrico e intestinal, respectivamente. Si el pH disminuye, habr mayor concentracin de H+ que neutralizarn algunos iones TPP; entonces la densidad de carga del entrecruzante TPP y por lo tanto la densidad de entrecruzamiento disminuir, lo que conduce al hinchamiento. Por otra parte, el hinchamiento es favorecido por la repulsin de los grupos amino libres protonados del quitosano. Si la disminucin del pH es demasiado grande, la disociacin de los enlaces inicos y la disolucin de la red del hidrogel se puede producir, lo que parece que ocurri al exponer las partculas de CS al pH 1,2, la suspensin de partculas de CS-TPP pasaron de ser una suspensin opalescente a ser translcida. Como se muestra en la figura 13a, se trabaj en el rango UV de 200 a 400nm, ya que la muestra es incolora, a la izquierda del grfico vemos unas curvas que son errores del equipo por encontrarse cerca de los 200nm. Observamos que se da una transmisin del 100%, desde el inicio hasta las 24hrs de medicin, lo que nos dice que probablemente las partculas de quitosano se disolvieron completamente, transmitiendo al 100% la radiacin. Si el pH aumenta, disminuye la protonacin del quitosano e induce una disminucin de la densidad de entrecruzamiento, lo que permite el hinchamiento debido a que se producira un aumento entre la separacin de las cadenas del quitosano. A medida que se aumenta el pH del medio esta separacin aumentar; as, las cadenas de quitosano irn quedando libres y empezaran a precipitar ya que el quitosano es menos soluble en medio bsico. Ambos efectos se unen para aumentar el tamao de las partculas, lo que concuerda con el aumento de la turbidez de la suspensin inicial de partculas de CS-TPP.

p H -sensitive swelling of crosslinked chitosan hydrogel ionic molecule as crosslinker; crosslinker, , uncharget ionic positive charge of chitosan; interaction; , chitosan.

an ionically containing an , charget ionic crosslinker; +, , ionic

Figura 12. Hinchamiento dependiendo del pH de un hidrogel de quitosano de 7 entrecruzamiento inico .

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120

120

a
100 100

b
Transmitancia (%)
80 60 40 20

Transmitancia (%)

80

Inicio
60

1 hora
40

Inicio 1 hora 24 horas

24 horas
20 0 200 300 400

0 200 300 400

Longitud de onda (nm)

Longitud de onda (nm)

Figura 13. Estudio de estabilidad de las partculas de quitosano a pH 1,2 (a) y 7,4 (b).

Observamos en la figura 13b, que al inicio se transmite casi el 100% de la radiacin, y conforme transcurre el tiempo disminuye la transmitancia, lo que nos puede indicar un aumento de tamao de las partculas debido al hinchamiento explicado anteriormente, ya que una suspensin de partculas con mayor tamao transmiten menor cantidad de radiacin. Si el pH es demasiado alto los grupos amino del quitosano se neutralizan con los OH del medio y el entrecruzamiento inico se inhibe. Si la densidad de entrecruzamiento se vuelve demasiado pequea, las interacciones inicas ya no sern lo suficientemente fuertes para evitar la disolucin y el entrecruzante inico TPP se libera. CONCLUSIONES 5 Se obtuvo el grado de desacetilacin y masa molar del quitosano siendo 82% y 8,16 x 10 Da, respectivamente; ambos valores altos con los que se podra obtener un buen grado de entrecruzamiento. Las partculas coloidales de quitosano se reconocieron como una suspensin opalescente, cuyo rango de tamao fue de 100 a 400nm. Las partculas de quitosano sin PEG mostraron una forma esfrica, mientras que las modificadas con PEG mostraron una forma irregular. Al aadir PEG el tamao de las partculas de quitosano aumenta. Se estudiaron algunos factores que influencian la estabilidad de las partculas de quitosano, donde se vio que el efecto del tiempo y fuerza inica producan un hinchamiento poco representativo de las partculas, pero el efecto del pH si fue marcado. Las partculas de CSTPP probablemente sufren disolucin a pH 1,2 mientras que a pH 7,4 muestra hinchamiento. AGRADECIMIENTOS A los laboratorios de Microscopa electrnica y Pelculas delgadas de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Ingeniera. Al Mg. Christian Jacinto por su valioso apoyo en la realizacin de la investigacin.

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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

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