Gui A Clinic A Lab Oratorio

Universidad Complutense
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO
DE
MICROBIOLOGÍA II
GUÍA DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Cuarto Curso
2006/2007
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II - UCM
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
• Cualquier alumno que sufra alguna alteración de sus defensas o

inmunocompetencia debe comunicarlo al profesor antes de comenzar las
prácticas.
• El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén

realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad.
• Los laboratorios de investigación son de acceso exclusivo del personal del

Departamento.
• Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el

laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del
laboratorio.
• Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en

el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos...) o
tocarse los ojos, nariz y boca.
• En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u

objetos personales.
• Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del

material asignado, así como de los microscopios que haya usado.
• Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material

inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará
que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el
laboratorio.
• Está prohibido pipetear con la boca.
• Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse

inmediatamente al profesor encargado del grupo.
• No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener

protegidas las manos.
• No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone

de guantes apropiados.
• La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se

realizará utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto.
• Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de
contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio.
2
PRÁCTICA 1.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EXUDADO FARÍNGEO
1.1. INTRODUCCIÓN.
El protocolo que se detalla a continuación
representa el análisis rutinario en busca de
Streptococcus ß-hemolítico grupo A
(Streptococcus pyogenes), pero permite detectar
otros patógenos bacterianos o fúngicos.
1.2. TOMA DE MUESTRAS, EXAMEN

PRELIMINAR Y CULTIVO.
1.2.1. Material:
• Torunda estéril de poliéster.
• Placas de agar-sangre.
1.2.2. Técnica:
1.2.2.1. Toma de muestra.

Se introduce la torunda en la boca, evitando Figura 1.1. Toma de exudado
el contacto con la lengua y otras zonas de la faríngeo.
boca, y se frota contra la mucosa inflamada de la
amígdala o faringe (Figura 1.1).
1.2.2.2. Siembra.
• Frotar el hisopo sobre un segmento de la placa, haciéndolo girar a la vez para
descargar toda la muestra (Figura 1.2.-1).
• Extender el inóculo inicial con el asa bacteriológica (2).
• Con el asa flameada y fría extender
el inóculo sobre otro segmento (3).
• Flamear el asa y repetir dos veces el
paso 2, sin llegar a tocar el inóculo
inicial (4).
• Clavar el asa dos o tres veces en el
agar, al principio de la siembra,
para obtener cultivo bajo la
superficie.
• Incubar las placas 18 h a 35-37°C.
1.3. IDENTIFICACIÓN.
Examinar las placas en busca de
las colonias ß-hemolíticas. La ß-
hemólisis puede ser más evidente
donde se clavó el asa en el agar. Si se
encuentran, se comprueba mediante
tinción de Gram el aspecto típico de los Figura 1.2. Técnica para el aislamiento
estreptococos (cadenas de cocos Gram- de colonias en placa.
3
positivos) y la ausencia de catalasa (ver apartado 4.3). Además de los estreptococos

del Grupo A (Streptococcus pyogenes), son β−hemolíticos los de los grupos B
(Streptococcus agalactiae), C (como Streptococcus equisimilis), D (como
Streptococcus bovis), F (Streptococcus milleri) y G, así como los enterococos
(Enterococcus spp.). Entre ellos pueden estar implicados en faringitis, además del
patógeno habitual (S. pyogenes), los de los grupos C y G.
Para la identificación presuntiva de S. pyogenes, se hace una resiembra en
otra placa de agar sangre, donde se coloca un disco de bacitracina para determinar
su sensibilidad (ver apartado 4.3.2).
Arcanobacterium haemolyticum es un bacilo Gram-positivo que también puede
ser causa de faringitis; sus colonias β-hemolíticas son semejantes a las de S.
pyogenes, y carecen así mismo de catalasa.
Las colonias α-hemolíticas corresponden a estreptococos comensales del grupo
"viridans", aunque podría tratarse de Streptococcus pneumoniae. Hágase una
tinción de Gram para averiguar si presentan aspecto de diplococos Gram-positivos
lanceolados; para su identificación se resiembran en otra placa de agar sangre
donde se coloca un disco de optoquina (ver apartado 4.3.2).
Las secas y amarillentas corresponden a especies comensales de Neisseria
(compruébese mediante tinción de Gram). No se identifican.
Las colonias blancas y cremosas pueden corresponder a Staphylococcus sp.
o a Candida albicans (ver identificación en Práctica 8). S. aureus suele dar colonias
amarillas, cremosas.
Las enterobacterias y Pseudomonas dan colonias más grandes, a veces
mucosas, de color gris a negruzco.
1.4. INTERPRETACIÓN.
En caso de amigdalitis o faringitis se considera resultado positivo el
aislamiento de Streptococcus β-hemolítico grupo A. No procede realizar
antibiograma, por ser de sensibilidad uniforme a penicilina. El aislamiento de
otros patógenos bacterianos responsables de faringitis es mucho menos frecuente.
El aislamiento de Candida albicans permite confirmar un diagnóstico de
candidosis oral.
El aislamiento de otro patógeno en proporción significativa puede ser el reflejo
de una infección de otra zona del aparato respiratorio y debe investigarse.
4
PRÁCTICA 2.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ORINA
2.1. INTRODUCCIÓN.
El análisis microbiológico de la orina va encaminado al diagnóstico de las
infecciones del aparato urinario, esencialmente cistitis y pielonefritis.
También es útil para ayudar al diagnóstico de las infecciones no estrictamente
urinarias, cuando afectan a tejido renal o se excretan bacterias por orina, como
tuberculosis, leptospirosis o fiebre tifoidea.
2.2. TOMA DE MUESTRA.

La muestra más adecuada es la primera orina de la mañana. Debe evitarse la
contaminación por la microbiota normal de la uretra o del perineo, mediante un
lavado de los genitales externos, aclarado con abundante agua y secado, si es
posible, con gasa estéril. Se recoge la porción media de la micción en un frasco
estéril de boca ancha, desechando los primeros y los últimos mililitros.
La muestra debe analizarse inmediatamente, o refrigerarse a 4°C hasta un
máximo de 24 horas.
2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO PRELIMINAR.

Cuando el número de muestras es muy elevado es necesario un método que
permita descartar las negativas sin proceder al cultivo. Algunos de los criterios
empleados son los siguientes:
Depositar una gota de la muestra de orina (que previamente se ha
homogeneizado muy bien) sobre el porta, sin extenderla, dejarla secar y fijarla a la
llama. Teñirla por el método de Gram. Si se aprecia al menos una bacteria en la
mayoría de los campos observados, la muestra debe cultivarse.
Considerar los resultados del examen del sedimento.
Puede utilizarse un equipo automático para detectar bacteriuria.
Las pruebas basadas en la reducción de nitratos, de trifenil-tetrazolio, la
prueba de la glucosa-oxidasa y otras similares no son fiables, por dar un exceso de
falsos negativos.
2.4. UROCULTIVO CUANTITATIVO.

El recuento de bacterias en orina es, por el momento, el método aconsejado
para distinguir una infección urinaria de la contaminación por microbiota normal.
Puede hacerse mediante diluciones seriadas o mediante siembra con asa
calibrada. Este último método es más utilizado por su sencillez.
2.4.1. Material:
• Muestra de orina problema.
• Asa calibrada de 1 µl.
5
• Una placa con medio CLED (Cistina, Lactosa,

Electrolito-Deficiente). En su lugar puede
utilizarse una placa de Agar-sangre y otra de
MacConkey o Levine.
2.4.2. Técnica:
• Homogeneizar bien la orina mediante
inversiones del frasco.
• Sumergir verticalmente el asa y retirarla
asegurándose que lleva una gota de orina
(Figura 2.1).
• Extender la orina contenida en el asa a lo largo
de un diámetro de la placa, pasando varias
veces (Figura 2.2.-1). Extender el inóculo con la
misma asa en estrías muy apretadas
perpendicularmente a la primera estría (2) y
luego perpendicularmente a la segunda con Figura 2.1. Recogida de una
múltiples pasadas del asa, que se superpongan, gota de orina con
hasta cubrir toda la placa (3). el asa para la
• Incubar las placas en posición invertida 18 h a siembra.
35-37 °C.
2.4.3. Interpretación.
Estimar el número de colonias y
multiplicarlo por mil, para obtener el
número de bacterias por ml de orina.
Un recuento de más de 100.000
bacterias/ml es indicativo de
infección (el número no se
correlaciona con la gravedad de la
misma).
Un recuento de menos de 10.000
bacterias/ml hace sospechar una
contaminación de la muestra, Figura 2.2. Siembra en placa para el
especialmente si hay varios tipos urocultivo cuantitativo.
distintos de colonias, pues las
infecciones urinarias son casi siempre debidas a un sólo microorganismo. Las
cifras intermedias son dudosas, y requieren la consulta al clínico y la repetición
del análisis. Hay que tener presente que las muestras obtenidas por punción
suprapúbica o cateterismo aséptico no llevan contaminación, y debe considerarse
positivo cualquier recuento.
En caso de infección se procede siempre a la identificación y al antibiograma.
2.5. IDENTIFICACION.
Los microorganismos responsables más frecuentemente de infección urinaria
varían según el origen comunitario o nosocomial de la infección. En líneas
generales son:
• Escherichia coli, y con mucha menor frecuencia otras enterobacterias, como
Proteus, Klebsiella, Enterobacter y Serratia.
6
• Entre los cocos Gram-positivos, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus

faecalis y Staphylococcus aureus.
• Microorganismos oportunistas, como Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes spp.
Corynebacterium urealyticum y levaduras, como Candida albicans.
Basándose en el aspecto de la colonia y en su tinción, proceda a identificarla
según las técnicas descritas en la Práctica 4.
2.5.1. Observación de las colonias.

El agar CLED ha sido diseñado para el análisis de orina. Permite apreciar la
fermentación de lactosa, al llevar azul de bromotimol como indicador de pH, y su
deficiencia en electrolitos impide la invasión de la placa por especies de Proteus. Es
de color verde algo amarillento.
• Las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa hacen virar el medio al
amarillo; es el caso de E. coli, Klebsiella y Enterobacter.
• Las no fermentadoras de lactosa, como Proteus, o fermentadoras lentas,
como algunas estirpes de Serratia, lo dejan de color azul o verde azulado.
Esto mismo ocurre con las bacterias que no fermentan azúcares
(Pseudomonas, Alcaligenes).
• Los cocos Gram-positivos presentan colonias más pequeñas y dejan el color
del medio inalterado o ligeramente amarillo; S. aureus suele formar
colonias muy amarillas por el pigmento que produce.
• Corynebacterium urealyticum forman colonias apenas visibles; es necesario
incubar las placas 48-72 horas.
2.5.2. Tinción de Gram de una colonia.

Deposite con el asa de siembra una gota pequeña de agua en un portaobjetos
limpio. Tome una muestra de una sola colonia, tocándola con el asa de siembra.
Resuspéndala en la gota de agua, extendiéndola uniformemente sobre una
pequeña porción del porta. Déjela secar, sin calentar. Fije a la llama y tiña por el
método de Gram. Una vez seca la tinción obsérvela con el objetivo de inmersión.
2.6. ANTIBIOGRAMA.
Se realiza el antibiograma según se describe en la Práctica 6, y se redacta el
Informe Final con los datos de recuento, identificación y antibiograma.
7
PRÁCTICA 3.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE HECES
3.1. INTRODUCCIÓN.
La técnica de coprocultivo que aquí se describe es un método de rutina para el
aislamiento de Salmonella, Shigella y cepas comensales y patógenas de Escherichia
coli. El aislamiento de Yersinia enterocolitica requiere medios selectivos (medio CIN)
y/o enriquecimiento en frío. Para el aislamento de Campylobacter es necesario
utilizar medio Campy-BAP e incubarlo en microaerofilia a 42°C.
Para aislar Staphylococcus aureus es recomendable añadir una placa de
Chapman-manitol, y para detectar Candida albicans otra de agar Sabouraud.
Estos microorganismos se aíslan e identifican en otras prácticas, por lo que no se
utilizarán aquí esos medios.
3.2. TOMA DE MUESTRAS Y TRANSPORTE.
3.2.1. Material:
• Recipiente estéril de boca ancha, o hisopo estéril con medio de transporte.
3.2.2. Técnica:
Recoger 5-10 g de heces en el recipiente estéril. En algunos casos es aceptable
hacer la toma mediante una torunda rectal (este el método que se empleará en
estas prácticas). Si no puede sembrarse la muestra antes de 2 horas, debe
utilizarse un medio de transporte, como Cary-Blair o Glicerol/Tampón fosfato
(50:50, pH 7).
3.3. COPROCULTIVO.
3.3.1. Material:
• Un tubo de caldo selenito para enriquecimiento.
• Una placa de cada uno de los siguientes tipos de medios de cultivo:
o Medios moderadamente selectivos, como MacConkey o Levine (EMB).
o Medios selectivos, como SS (Salmonella-Shigella), XLD (Xilosa, Lisina y
Desoxicolato) o Hektoen.
o Medios muy selectivos, como BG (Verde Brillante) o BS (Bismuto-Sulfito)
• Una placa de medio CIN (cefsulodina-irgasan-novobiocina) para Yersinia.
• Una placa de medio Campy-BAP para Campylobacter.
3.3.2. Técnica:
Inocular directamente las heces con espátula estéril, asa bacteriológica o el
hisopo empleado para tomar la muestra. Comiéncese por los más selectivos (BS),
que deben inocularse abundantemente porque son muy inhibitorios. El inóculo se
extiende con el asa para obtener colonas aisladas (Figura 1.2).
8
Las placas se incuban a 36°C en aerobiosis durante 48 horas, para que

puedan manifestarse las características diferenciales de las colonias; la lectura
prematura conduce a errores de interpretación.
Para el aislamiento de Salmonella puede hacerse además un enriquecimiento
en medio de selenito. Inocúlese con la muestra de heces un tubo de 10 ml de caldo
selenito, e incúbese a 37 ºC. Si no se ha aislado Salmonella, se hará un subcultivo
a partir del tubo de caldo selenito en medio selectivo para Salmonella.
Para la búsqueda de Yersinia conviene incubar también una placa de
MacConkey a 30 °C, si no se utiliza medio selectivo CIN. Las placas de medio
Campy-BAP para Campylobacter se incuban a 42°C en microaerofilia.
3.4. EXAMEN DE LOS CULTIVOS.

Las placas se examinarán en busca de colonias sospechosas de pertenecer a
alguno de los patógenos intestinales. Para ello se tendrá en cuenta las
características de crecimiento en los distintos medios, como se expone a
continuación:
Agar MacConkey
Características: Es un medio moderadamente selectivo. Las sales biliares y el
cristal violeta inhiben a la mayoría de las bacterias Gram-positivas y algunas
Gram-negativas. La fermentación de lactosa hace virar el indicador a rojo.
Aspecto de las colonias: Los fermentadores típicos de lactosa (E. coli,
Klebsiella y Enterobacter) dan colonias rosas o rojas rodeadas de un halo de sales
biliares precipitadas. Los fermentadores débiles o lentos de lactosa (Citrobacter,
Serratia) pueden dar colonias incoloras a las 24 h y rosadas a las 48 h. Proteus,
Salmonella, Shigella y Yersinia dan colonias incoloras. Enterococcus forma
pequeñas colonias.
Agar Levine
Características: Es un medio ligeramente más selectivo que el MacConkey. La
eosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas y
algunas Gram-negativas. La fermentación de lactosa precipita ambos colorantes al
acidificar el medio.
Aspecto de las colonias: E. coli forma colonias oscuras con brillo metálico
verdoso. Los fermentadores no tan fuertes de lactosa (Klebsiella, Enterobacter y
Serratia) forman colonias moradas en 24 a 48 h. Los no fermentadores de lactosa
(Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia) dan colonias transparentes.
Agar Salmonella-Shigella (SS)

Características: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta
concentración de sales biliares y citrato inhibe todas las bacterias Gram-positivas y
muchas Gram-negativas, incluidos los coliformes. La fermentación de lactosa hace
virar el rojo neutro a rojo. El SH2 formado a partir de tiosulfato da un precipitado
negro al reaccionar con hierro.
Aspecto de las colonias: Los fermentadores de lactosa están bastante
inhibidos y dan colonias rojas. Las colonias de Salmonella aparecen sin inhibir,
transparentes, con el centro negro. Las especies de Shigella son más o menos
inhibidas y dan colonias transparentes sin centro negro. Las colonias de Proteus
son similares a las de Salmonella.
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Agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato)

Características: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. El
desoxicolato inhibe a las bacterias Gram-positivas y frena la invasión por Proteus.
Lleva citrato y tiosulfato para completar el efecto selectivo, los azúcares lactosa,
xilosa y sacarosa, y rojo de fenol como indicador de pH. No se esteriliza.
Aspecto de las colonias: Salmonella comienza por acidificar el medio por
fermentación de xilosa, pero ésta se agota rápidamente y el medio se alcaliniza por
descarboxilación de la lisina. Las colonias de Salmonella aparecen rojas con el
centro negro por la producción de SH2. Las colonias de Proteus pueden ser
semejantes. Los coliformes mantienen el medio ácido por fermentación de lactosa y
sacarosa, que se hallan en exceso, y forman colonias amarillas. Las colonias de
Shigella aparecen rojas al no fermentar ninguno de los azúcares.
Agar entérico Hektoen

Características: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta
concentración de sales biliares inhibe todas las bacterias Gram-positivas y retrasa
el de muchos coliformes. La fermentación de los azúcares hace reaccionar la
fuchsina con el azul timol, dando color amarillo a pH ácido.
Aspecto de las colonias: E. coli y otros fermentadores rápidos de lactosa son
moderadamente inhibidos y dan colonias naranjas o rosadas. Las colonias de
Salmonella aparecen azul-verdosas con el centro negro por la producción de SH2.
Las colonias de Shigella son más verdosas y sin centro negro. Las colonias de
Proteus están inhibidas y son pequeñas y transparentes.
Agar BS (Sulfito de Bismuto)

Características: Es un medio altamente selectivo para Salmonella. El sulfito
de bismuto y el verde brillante inhiben a la mayoría de los coliformes y a otras
bacterias. La producción de SH2 se detecta como en los medios anteriores. No lleva
azúcares ni indicador de pH. No se esteriliza.
Aspecto de las colonias: E. coli y otros coliformes están fuertemente
inhibidos, y si crecen dan colonias pequeñas, color verde o pardo. Las colonias de
Salmonella aparecen con el centro negro por la producción de SH2, el borde más
claro y un halo oscuro en el medio de cultivo que tiene reflejos metálicos, debido a
la reducción del bismuto a metal. Las colonias de Proteus están inhibidas y son
pequeñas y negras, por la producción de SH2.
Agar con Verde Brillante

Características: Es un medio altamente selectivo para Salmonella, a excepción
de Salmonella typhi. El efecto inhibitorio se debe al colorante verde brillante. La
fermentación de lactosa o sacarosa hace virar el indicador, rojo de fenol, dando
coloración amarilla.
Aspecto de las colonias: Las colonias de Salmonella aparecen de color rosa
blanquecina. Algunas cepas de S. typhi y Proteus pueden crecer dando colonias
rojas. Los fermentadores de azúcares, como E. coli, forman colonias amarillo-
verdosas, muy inhibidas.
Agar CIN (para Yersinia)

Características: Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad se debe a
la presencia de sales biliares, cristal violeta e Irgasan, que inhiben el crecimiento
de Gram-positivos y cierto número de Gram-negativos. La cefsulodina y la
novobiocina son dos antimicrobianos que inhiben los organismos entéricos
10
normales. La propiedad diferencial se basa en la fermentación de manitol con

producción de ácido que hace virar el rojo neutro a rojo y que produce una
precipitación de sales biliares alrededor de las colonias.
Aspecto de las colonias: Las colonias de Yersinia enterocolitica son
translúcidas con centro rojo debido al indicador de acidez rojo neutro que indica la
fermentación del manitol y pueden estar rodeadas por una zona de bilis
precipitada. Además de esta especie bacteriana, pueden crecer en el medio otros
microorganismos: Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Aeromonas y Pseudomonas
aeruginosa.
Agar Campy-BAP (para Campylobacter)

Características: Es un medio nutricionalmente rico que permite el
crecimiento de especies de Campylobacter. Suplementado con agentes
antimicrobianos (cefalotina, trimetoprím, vancomicina, polimixina B y anfotericina
B) proporciona un menor crecimiento de bacterias entéricas a la vez que permite la
recuperación de Campylobacter de muestras fecales.
Aspecto de las colonias: Las colonias de Campylobacter aparecen no
hemolíticas, de color gris con bordes irregulares o elevadas y con aspecto mucoide.
Se puede observar un rastro o cola tras la colonia si la superficie del medio está
húmeda.
Los medios menos selectivos (MacConkey o Levine) permiten apreciar la
composición de la microbiota normal aerobia facultativa. En un sujeto sano debe
predominar E. coli, con pequeños porcentajes de otras enterobacterias: Klebsiella,
Enterobacter y Proteus. En MacConkey suelen detectarse también enterococos
(como pequeñas colonias incoloras) que son inhibidos en el medio Levine.
Los medios selectivos se examinarán en busca de colonias típicas de
Salmonella o Shigella. En ellos pueden aparecer otras enterobacterias; las colonias
de Proteus suelen prestarse a confusión, mientras que las de enterobacterias
lactosa-positivas están mucho más inhibidas y se diferencian claramente.
En caso de no detectar Salmonella se sembrarían nuevas placas a partir del
enriquecimiento en Caldo selenito.
La identificación se realizará siguiendo las técnicas habituales (Práctica 4). En
el caso de Salmonella es necesaria la confirmación serológica (Práctica 5), y si se
sospecha de una gastroenteritis por E. coli debe determinarse si se ha aislado una
cepa patógena, mediante serología u otras técnicas.
En el medio CIN selectivo para Yersinia enterocolitica, las colonias típicas
deberán ser analizadas como el resto de las enterobacterias, bien sembrando las
pruebas tradicionales (ver Práctica 4) o utilizando métodos comerciales (Práctica
7).
Para la identificación de Campylobacter véase el apartado 4.5.2.
3.6. INFORME.
Se comunicará el aislamiento del patógeno identificado, o se informará del
hallazgo de microbiota normal o alterada. Como el tratamiento antimicrobiano no
suele estar indicado, sólo se practicará el antibiograma cuando el caso lo aconseje.
11
PRÁCTICA 4.
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS
4.1. INTRODUCCIÓN.
Se ofrecen aquí métodos sencillos para la identificación de los
microorganismos que pueden haber sido aislados en las prácticas anteriores. La
identificación completa puede requerir otras pruebas, descritas en los manuales de
laboratorio de Microbiología Clínica (ver Bibliografía).
Recuérdese que para proceder a la identificación debe partirse siempre de un
cultivo puro, o por lo menos de una colonia aislada.
Debe tenerse siempre en cuenta la diversidad que presentan los
microorganismos, que hace que una cepa en concreto no presente exactamente las
características que definen a la especie. Por tanto, hay que considerar la totalidad
de los resultados coincidentes y no coincidentes, y valorar la importancia
taxonómica de cada uno.
4.2. TÉCNICA.
El primer paso es la tinción de Gram a partir de una colonia aislada, que nos
informará si se trata de una bacteria, de su morfología, y de si es Gram-positiva o
Gram-negativa. A partir de estos datos pueden seguirse los protocolos de los
siguientes apartados.
4.3. COCOS GRAM POSITIVOS.

Sólo se describen aquí los patógenos pertenecientes a los géneros
Streptococcus y Staphylococcus.
Material necesario:
• Cultivo puro de la bacteria problema.
• Colorantes para la tinción de Gram.
• Agua oxigenada de 30 volúmenes.
Técnica:
a) Forma y disposición: Se realiza una tinción de Gram. Los estreptococos suelen
aparecer en cadenas, los estafilococos en agrupaciones irregulares como
racimos.
b) Catalasa: Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30
volúmenes e introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden
burbujas.
CATALASA (+): Staphylococcus

COCOS GRAM(+) 
CATALASA (-): Streptococcus
4.3.1. Identificación de estafilococos.
Material necesario:
• 1 tubo con 0,5 ml de caldo común.
• Plasma de conejo.
12
• 1 placa con medio Chapman-Manitol (Manitol-Sal). Este medio es selectivo para

Staphylococcus al contener un 7,5% de ClNa, y se detecta la fermentación del
manitol al virar el indicador de pH (rojo de fenol) de rosa a amarillo.
Técnica:
Identificar las colonias sospechosas (catalasa positiva) según el siguiente
esquema:
+, MANITOL + : Staphylococcus aureus
COAGULASA  NOVOBIOCINAR: Staphylococcus saprophyticus
 − , MANITOL + ó − 
NOVOBIOCINAS: Staphylococcus epidermidis
a) Fermentación del manitol: Sembrar la bacteria en placa de Chapman-manitol.

Incubar a 37°C, 24-48 horas. Observar si hay fermentación por viraje del
indicador a color amarillo.
b) Coagulasa: Sembrar la colonia en 0,5 ml de caldo común. Incubar 18 horas a
37°C. Añadir una gota de plasma de conejo. Incubar a 37°C. En caso positivo
aparece un coágulo a las pocas horas (puede leerse la prueba al día siguiente).
c) Sensibilidad a novobiocina: Inocular una placa según la técnica del
antibiograma de difusión (Práctica 6). Colocar un disco de 5 µg de novobiocina.
Incubar una noche a 37°C. Un halo de menos de 16 mm significa resistencia.
4.3.2. Estreptococos.
La identificación de estreptococos, una vez comprobada la tinción de Gram y
el carácter catalasa-negativa parte de la observación de la hemólisis en agar
sangre:
Examinar las colonias crecidas 24 horas en una placa de agar sangre.
Observar si hay ß-hemólisis: halo transparente alrededor de las colonias (S.
pyogenes); α-hemólisis: halo verdoso (los grupos Streptococcus milleri, S. mutans, S.
salivarius y S. sanguis, denominados globalmente “estreptococos viridans”, y
Streptococcus pneumoniae); o no hay hemólisis (S. lactis y otros).
BacitracinaS S. pyogenes (Grupo A). Confirmar serológicamente

ß-hemólisis:   S. agalactiae (Grupo B). Hacer prueba CAMP e hidrólisis
BacitracinaR  del hipurato.
 Otros serogrupos (C, G)
OptoquinaS S. pneumoniae. Confirmar por solubilidad en bilis o serología
α -hemólisis: 
OptoquinaR − ): “estreptococos viridans”
Bilis-esculina (−
Sin hemólisis, BacitracinaR Bilis-esculina (+): Enterococcus (Grupo D)

o variable OptoquinaR
Enterococcus spp. puede dar cualquier tipo de hemólisis (aunque no suele ser
hemolítico), y si se sospecha su presencia (por ejemplo, en orina) no es preciso este
primer paso.
Material necesario:
• Placa con agar sangre.
• Discos de optoquina y bacitracina.
• Pinzas.
• 1 tubo con 0,5 ml de caldo glucosado.
• NaOH 0,5 N.
13
• Desoxicolato sódico al 10 % .
• Pipetas de 1 ml. estériles.
• 1 tubo de agar bilis-esculina.
Técnicas:
Sensibilidad a la bacitracina: Sembrar la bacteria por estría apretada en placa de
agar sangre, poniendo en la superficie un disco impregnado con 0,2 U de
bacitracina en la zona donde se espera crecimiento confluente. Incubar 24
horas a 37°C. Streptococcus pyogenes (Grupo A) es sensible, produciéndose un
halo de inhibición alrededor del disco.
Sensibilidad a la optoquina: Se siembra la bacteria en la superficie de una placa
de agar sangre donde se deposita un disco impregnado con una solución de
1/4000 de optoquina. Incubar a 37°C, 24 horas. Streptococcus pneumoniae no
crece en la zona de acción de la optoquina, los demás estreptococos sí.
Solubilidad en bilis: Se resiembra la bacteria en 0,5 ml de Caldo glucosado.
Incubar a 37°C, 18 horas. Añadir una gota de sosa 0,5 N y una gota de
desoxicolato sódico al 10 por 100. En caso positivo se observará inmediatamente
el aclaramiento de la suspensión. Streptococcus pneumoniae se lisa en presencia
de bilis, los demás estreptococos no.
Hidrólisis del hipurato: Esta prueba se describe en el apartado 4.5.2.1.
Streptococcus agalactiae da positiva esta prueba; son los únicos estreptococos
β-hemolíticos que lo hacen.
Prueba de bilis-esculina: Sembrar por estría en la superficie del agar inclinado
bilis-esculina. Incubar 24 horas. Si la bacteria crece e hidroliza la esculina, el
producto de su hidrólisis (esculetina) reacciona con el citrato de hierro dando
coloración negruzca. Los enterococos dan positiva esta prueba.
Prueba CAMP: Inocular una cepa de Staphylococcus aureus productora de β-lisina
en una placa de agar sangre, trazando una sola estría siguiendo un diámetro.
Inocular las bacterias a identificar trazando estrías perpendiculares a la
primera, pero que no lleguen a tocarla (Figura 4.1). Incubar a 37°C durante 18-
24 h.
El resultado positivo se manifiesta por una zona de hemólisis intensa en la
confluencia de las estrías, en forma de flecha apuntando a la estría de S. aureus.
Los estreptococos del grupo B
(Streptococcus agalactiae)
producen una hemolisina cuyo Staphylococcus
Streptococcus
aureus
efecto es potenciado por la β- agalactiae
lisina de S. aureus, una
fosfolipasa C que afecta a la
membrana de los hematíes.
4.4. COCOS
GRAM-NEGATIVOS.
Nos referiremos sólo a los
pertenecientes a los géneros
Neisseria y Moraxella.
Se caracterizan
preliminarmente por su
Listeria
morfología de cocos Gram-
monocytogenes
negativos en parejas,
semejando granos de café, y Figura 4.1. Prueba CAMP.
por dar positivas las pruebas
14
de la catalasa y de la oxidasa.
La identificación se completaría mediante pruebas bioquímicas. Los ensayos
de oxidación de azúcares son difíciles de realizar, y se recomienda el empleo de
alguno de los métodos comercialmente disponibles.
4.4.1. Material necesario:
• Colonias aisladas de la bacteria problema.
• Colorantes para tinción de Gram.
• Agua oxigenada de 30 volúmenes.
• Tira de papel con reactivo de oxidasa.
4.4.2. Técnica:
Catalasa: Ya descrita en el apartado 4.3.
Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre tiras de papel
impregnadas en solución acuosa al 1 por 100 de tetrametil-p-fenilén-diamina.
En caso positivo el papel cambia de color pasando a azul oscuro o negro.
4.5. BACILOS GRAM-NEGATIVOS.

Dada la variedad de especies existentes, es preciso tener en cuenta el origen
de la muestra, la etiología posible y los medios de cultivo empleados en su
aislamiento.
En principio pueden distinguirse aquellas que crecen en medios no
enriquecidos y en medios propios para enterobacterias, que pueden pertenecer al
grupo de las enterobacterias o al de los no fermentadores de azúcares. Son
bacterias que se aíslan muy frecuentemente en laboratorios clínicos.
Otras bacterias se aíslan sólo como resultado de un búsqueda específica,
utilizando medios especiales; podemos citar Vibrio y Campylobacter, y por otra
parte los nutricionalmente exigentes como Haemophilus, Brucella, Bordetella y
Legionella.
Consideraremos aquí únicamente la identificación de enterobacterias y de
algunos otros bacilos Gram-negativos.
4.5.1. Identificación de bacilos Gram-negativos no fermentadores.

La identificación puede iniciarse por la prueba de la oxidasa y la de
oxidación/fermentación de glucosa (O/F) como se indica a continuación, pero a
menudo las bacterias no fermentadoras se identifican tras un fracaso en el intento
de clasificarlas como enterobacterias, al comprobar que no fermentan ni lactosa ni
glucosa en el medio de Kligler (tubo "rojo/rojo").
Material necesario:
• Tiras de papel con reactivo de oxidasa.
• Dos tubos con medio de Hugh y Leifson. Este medio contiene glucosa y azul de
bromotimol, como indicador de pH. Se dispensa en tubos estrechos y largos,
para dificultar la difusión del oxígeno, y se hierve brevemente antes de
utilizarlo, para eliminar el oxígeno disuelto. Permite distinguir el metabolismo
oxidativo del fermentativo.
• Vaselina estéril.
• Pipetas Pasteur estériles.
• 1 placa con medio agar F (medio King B).
• 1 placa con medio agar P (medio King A).
15
Técnicas:
a) Oxidasa: Se realiza como se explicó en 4.4.2. El resultado de esta prueba
permite iniciar la clasificación atendiendo al siguiente esquema:
OXIDASA O/F BACTERIA

+ −
+/− Pseudomonas
+ −/− Alcaligenes
+ +/+ Vibrio
− −
+/− Acinetobacter (INMÓVIL)
− −
+/− Stenotrophomonas maltophilia (MÓVIL)
− +/+ Enterobacteriaceae
b) Oxidación/Fermentación (O/F): Sembrar la bacteria en picadura en dos

tubos con medio Hugh y Leifson, utilizando una pipeta Pasteur con la punta
cerrada. Cubrir uno de ellos con vaselina estéril. Incubar a 37° C, 48 horas.
Las bacterias fermentadoras producen ácido de la glucosa
independientemente de la existencia de oxígeno; por tanto, los dos tubos viran a
amarillo (+/+).
Las bacterias oxidativas (metabolismo respiratorio) sólo utilizan la glucosa en
el tubo descubierto; el medio es capaz de detectar la acidificación producida por el
CO2 disuelto y por tanto vira al amarillo sólo el que está sin cubrir de vaselina
(+/-).
Si no vira ninguno (-/-), la bacteria no utiliza azúcares.
c) Detección de pigmentos: A partir de una colonia aislada sembrar dos o tres
estrías paralelas en una placa de agar F y otra de agar P. Incubar a 37°C.
La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre la placa de agar F se
manifiesta por la aparición de un pigmento amarillo fluorescente (fluoresceína)
difusible en el medio, y un pigmento azul (piocianina) sobre la placa de agar P.
Pseudomonas fluorescens sólo produce fluoresceína. La composición de sales de
cada uno de estos medios potencia la producción de uno de los pigmentos e inhibe
la del otro.
• Extracción de piocianina: añadir 1-2 ml de cloroformo al medio para extraer el
pigmento piocianina que es soluble en cloroformo. Dejar en reposo el tubo y
esperar a que se formen dos capas: en la parte superior quedará el cloroformo
con el pigmento.
• Observación de fluorescencia: Iluminar las placas con una lámpara de luz
ultravioleta, en la oscuridad. La fluoresceína emite fluorescencia, la piocianina
no.
16
 P. aeruginosa : CRECE A 42°C; PIOCIANINA +; FLUORESCEINA +

Pseudomonas  P. fluorescens : CRECE A 4°C; PIOCIANINA − ; FLUORESCEINA +
 Otras especies
4.5.2. Identificación de Campylobacter jejuni

El género Campylobacter agrupa bacilos Gram-negativos de morfología
curvada (a menudo con doble curvatura) y móviles. Únicamente pueden cultivarse
en condiciones de microaerofilia.
Si se aíslan a partir de muestras de heces colonias sospechosas (grises,
dejando algunas de ellas un rastro alargado en la dirección de la siembra) en un
medio selectivo para Campylobacter (como el medio de Campy-BAP), se procederá a
su identificación. Compruébese primero la tinción de Gram y la morfología; puede
hacerse también una prueba de movilidad al microscopio. Las colonias deben dar
positivas las pruebas de la catalasa (4.3) y oxidasa (4.4). Con estos resultados
puede clasificarse como Campylobacter sp. Campylobacter jejuni es la especie que
suele causar diarrea en el ser humano, y se caracteriza por su capacidad de
hidrolizar el hipurato. Campylobacter coli no hidroliza el hipurato, y Campylobacter
fetus no crece a 42 ºC, por lo que no puede haberse aislado en las condiciones
empleadas.
4.5.2.1. Hidrólisis rápida del hipurato.
Esta técnica puede emplearse también para otras bacterias.
Material necesario:
• Cultivo puro de una bacteria hipurato-negativa (Enterococcus faecalis).
• Solución de hipurato sódico al 1% en agua destilada (recién preparada o
conservada congelada como máximo durante 6 meses).
• Reactivo de ninhidrina: 3,5 g de ninhidrina en 100 ml de acetona/butanol a
partes iguales (v/v).
Técnica:
• Inocular una suspensión densa de bacterias en un tubo de hipurato. Preparar
también un control negativo. Incubar 1-2 horas a 35ºC en baño de agua.
• Añadir 0,2 ml de reactivo de ninhidrina. Si aparece un color morado intenso la
prueba es positiva (puede necesitar 15 minutos más de incubación).
4.5.3. Identificación de enterobacterias (Enterobacteriaceae).

Son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, oxidasa-negativa,
catalasa-positiva, que fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Su
identificación se basa en pruebas bioquímicas, que pueden realizarse en una
batería de tubos o utilizando un sistema comercial (Práctica 7). Con fines
didácticos, la batería de pruebas se dividirá en dos partes, escogiendo las pruebas
de la segunda parte en base a los resultados de la primera. La prueba más
importante es la que se realiza en medio Kligler o T.S.I.
4.5.3.1. Primera batería de identificación.
Material necesario:
• 1 tubo con medio de Kligler o T.S.I. (Hierro-Tres- Azúcares)
• 1 tubo con agua de peptona.
• 1 tubo con medio agar movilidad.
• 1 tubo con agar citrato de Simmons.
17
• 1 tubo con agar urea Christensen.

• Reactivo de Ehrlich (p-dimetil-amino-benzaldehido).
Técnicas:
a) Siembra en medio Kligler: Con el hilo recto se toma de la colonia y se siembra
en picadura; después se siembra en la superficie por estría. Incubar a 37°C
durante 24 horas. Observar los resultados:
• Fermentación de glucosa: fondo amarillo.
• Fermentación de lactosa: superficie amarilla.
• Producción de SH2: picadura negra.
• Producción de gas: burbujas o rotura del agar.
Como la concentración de glucosa es baja, su fermentación afecta sólo al fondo
del tubo, en condiciones poco aeróbicas. En la superficie del agar la bacteria
respira, con lo que la producción de ácido es menor, ya que el CO2 se elimina. La
concentración de lactosa es diez veces mayor, con lo que la producción de ácido es
suficiente para el viraje del indicador incluso en la superficie del agar inclinado.
En realidad, la fermentación de lactosa enmascara la de glucosa, pero esto no
importa, pues para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar
glucosa.
El SH2 producido se detecta en forma de sulfuro de hierro.
b) Producción de indol: Se siembra en agua de peptona. Incubar a 37°C, 24-48
horas. Añadir unas gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del
tubo. En caso positivo aparece un anillo rojo en la interfase. Esto es debido a la
reacción con el indol producido por la bacteria a partir del triptófano.
c) Movilidad: Sembrar por picadura con hilo recto en medio agar movilidad.
Incubar a 37°C, 48 horas. Observar si el crecimiento está sólo en la picadura o
se extiende a los lados de ella. La baja concentración de agar de este medio (3
por mil) permite que las bacterias lo invadan si son móviles.
d) Crecimiento en citrato: Sembrar en la superficie inclinada del medio de
Simmons. Cultivar a 37°C, 24 horas. En caso positivo el medio vira de verde a
color azul. El medio contiene citrato sódico como única fuente de carbono. Las
bacterias capaces de utilizarlo alcalinizan el medio, y hacen virar el indicador
azul de bromotimol, a la vez que muestran crecimiento en superficie.
e) Producción de ureasa: Sembrar en estría en la superficie inclinada del agar
urea de Christensen. Incubar a 37° C, 24 horas. En caso positivo aparece color
rojo cereza. Es debido a la alcalinización del medio por producción de amonio a
partir de la urea que contiene el medio, lo que hace virar el rojo de fenol.
Intentar la identificación mediante la Tabla 4.1. Si no se puede completar,

prepare una segunda batería de pruebas.
4.5.3.2. Segunda batería de identificación.

Si la bacteria no ha fermentado la lactosa en el medio de Kligler es
imprescindible hacer la prueba del O.N.P.G. para determinar si es fermentadora
lenta o si realmente no es fermentadora de lactosa. Las demás pruebas se
escogerán según necesidades de identificación.
Material necesario:
• 2 tubos con medio de Clark y Lubs (caldo tamponado con glucosa)
• 1 tubo con agar de fenilalanina.
• 1 tubo con 0,5 ml de agua destilada estéril.
• 1 disco de papel impregnado con O.N.P.G.
• Solución de alfa naftol al 6% en etanol de 60°.
18
• Solución de sosa al 16 por 100.

• Solución de rojo de metilo al 0,5% en etanol de 60°.
• Solución de cloruro férrico al 10% .
Técnicas:
a) O.N.P.G. (orto-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido): Hacer una suspensión espesa
de la bacteria en 0,5 cc de agua destilada estéril, poner un disco de O.N.P.G.
Incubar a 37°C, 2 horas. En caso positivo aparece color amarillo. El O.N.P.G.
penetra en la bacteria y es hidrolizado por la ß-galactosidasa, liberándose
nitrofenol de color amarillo.
b) Rojo de metilo: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37ºC. A 2 ml
del cultivo se añaden dos gotas de la solución de rojo de metilo. En caso positivo
aparece color rojo. El rojo de metilo vira a pH muy bajo, detectando únicamente
la producción de grandes cantidades de ácidos, típico de la ruta fermentativa
ácido-mixta.
c) Voges-Proskauer: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37° C. A 1
ml del cultivo se agrega 0,5 ml de solución de alfa naftol y 1 ml de solución
sosa. Se agita. En caso positivo a los 10 minutos aparece un color rosa. El alfa-
naftol da un complejo coloreado al reaccionar con la 2,3-butanodiona, formada
por oxidación en medio alcalino del 2,3-butanodiol, que han producido las
bacterias que llevan a cabo la fermentación butilén-glicólica.
d) Desaminación de la fenilalanina (APP): Sembrar la bacteria en la superficie del
medio agar-fenilalanina. Incubar a 37°C, 24 horas. Añadir unas gotas de
solución de cloruro férrico. En caso positivo aparece coloración verde. Las
bacterias que poseen fenilalanina desaminasa transforman dicho aminoácido en
ácido fenil pirúvico (APP), que da reacción coloreada con el cloruro férrico. Esta
prueba puede sustituirse por la desaminación del triptófano (TDA: triptófano-
desaminasa), que da lugar a la formación de ácido indolil-pirúvico.
Una vez realizadas todas las pruebas, determinar el género y la especie con
ayuda de la Tabla 4.1.
19
TABLA 4.1. CLASIFICACIÓN DE ALGUNAS ENTEROBACTERIAS SEGÚN PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
MEDIO DE KLIGLER Ó TSI INDOL CITRATO UREASA APP ONPG MÓVIL RM VP

INCLINADO FONDO GAS SH2
Escherichia coli A A + - + - - - + + + -
Klebsiella spp. A A + - -/+ + +/- - + - V V
Enterobacter spp. A A + - - + V - + + - +
Citrobacter freundii V A + + - + +/- - + + + -
Citrobacter diversus V A + - + + +/- - + + + -
Serratia spp. K A -/+ - - V -/+ - + +/- V V
Shigella spp. K A - - V - - - -/+ - + -
Salmonella typhi K A - + - - - - - + + -
Salmonella spp. K A -/+ +/- - + - - - + + -
Proteus mirabilis K A - + - +/- + + - + + +/-
Proteus vulgaris K A - + + -/+ + + - + + -
Yersinia enterocolitica K* A - - +/- - +/- - + - ** + -
A: acidifica; K: alcaliniza; V: variable según especies (los resultados pueden variar según la cepa, y muchos de ellos sólo pueden considerarse
orientativos).
RM: Rojo de metilo; VP: Voges-Proskauer.
*En TSI acidifica por fermentación de sacarosa. **Inmóvil a 37°C; móvil a 25°C.
20
PRÁCTICA 5.
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN
5.1. INTRODUCCIÓN
Se describen dos técnicas de aglutinación aplicadas al diagnóstico
microbiológico.
Una de ellas es una aglutinación pasiva, y se utiliza para la identificación de
Staphylococcus aureus.
La otra técnica es una aglutinación directa para el serotipado de Salmonella.
5.2. IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus POR AGLUTINACIÓN EN

LÁMINA.
Los sistemas disponibles se basan en la actividad coagulasa de
Staphylococcus aureus y en la presencia de proteína A en la superfice de sus
células. El reactivo consta de partículas de látex o de hematíes de cordero (según la
marca comercial empleada) recubiertos de fibrinógeno (sensibilizados) y de
anticuerpos contra la proteína A.
La aglutinación se produce tanto a través de los anticuerpos como de la
reacción de coagulación con el fibrinógeno, por lo que es suficiente que la cepa
posea uno de los dos factores (coagulasa o proteína A) para obtener un resultado
positivo.
5.2.1. Técnica.
• En una lámina o portaobjetos limpio se deposita una gota de reactivo.
• En ella se emulsiona con el asa una o dos colonias a analizar tomadas de una
placa de medio Chapman-manitol. Se hace rotar suavemente el porta durante
unos segundos.
5.2.2. Lectura e interpretación.

La aglutinación debe aparecer en unos 15 segundos.
5.3. SEROLOGÍA DE Salmonella.

Las pruebas bioquímicas por sí solas son insuficientes para diferenciar las
cepas de una misma especie, y en el caso de Salmonella para asegurar que se trate
de esa bacteria. Por tanto, las cepas que dan reacciones bioquímicas típicas se
someten a reacciones de aglutinación para determinar los antígenos O y H (Tabla
5.1)
5.3.1. Material:
• Antisuero
• 1 tubo de solución salina.
• Portaobjetos.
• Pipetas Pasteur.
• Cepa problema.
• Asa de cultivo.
1
5.3.2. Técnica:
• Comprobar que el microorganismo está en fase lisa. Depositar una gota de
solución salina en un portaobjetos limpio, con el asa de cultivo o con una
pipeta Pasteur y emulsionar una colonia. Si el microorganismo está en fase
lisa, no deben formarse agrupaciones ni grumos.
• Depositar una gota de antisuero polivalente en otro portaobjetos, tomar una
colonia con asa de cultivo y emulsionarla hasta obtener una suspensión
uniforme. La lectura se realiza de 1 a 3 minutos, observándose la presencia
o ausencia de aglutinación.
5.3.3. Interpretación
Si se ha utilizado un suero polivalente anti-Salmonella, un resultado positivo
confirma la identificación bioquímica. Los sueros polivalentes suelen contener
anticuerpos contra los antígenos representativos de los grupos A, B, C, D y E, y
contra el antígeno capsular Vi. De este modo se detectan los serovares más
comunes, así como Salmonella typhi, que puede dar reacción negativa al
enmascarar su antígeno Vi los antígenos somáticos O.
Un resultado negativo indica que no se trata de Salmonella o que pertenece a
otros serogrupos diferentes, y requeriría su comprobación por un laboratorio de
referencia.
Para identificar el serovar (por ejemplo, S. typhimurium o S. enteritidis ) es
necesarios utilizar antisueros monovalentes contra antígenos O y H.
Tabla 5.1. Composición antigénica de algunos serotipos de Salmonella.
Serotipo Serogrupo Antígenos O (y K) Antígenos H*

Paratyphi A A 1,2,12 a/1,5
Paratyphi B B 1,4,5,12 b/1,2
Typhimurium B 1,4,5,12 i/1,2
Paratyphi C C 6,7,(Vi) c/1,5
Enteritidis D 1,9,12 g,m/1,7
Typhi D 9,12,(Vi) d
* Antígenos correspondientes a la expresión de flagelos fase 1/fase 2
2
PRÁCTICA 6.
ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN AGAR
6.1. INTRODUCCIÓN.
Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de
una bacteria de crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método
utilizado es el de difusión en agar. El método de dilución se describe en la Práctica
7.
Se utilizarán dos métodos; el método clásico puesto a punto por Kirby y
Bauer, conocido vulgarmente como el método "disco-placa", y el más reciente
epsilómetro o ε-test, que permite determinar directamente la concentración
mínima inhibitoria (CMI).
La técnica de antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo
puro. Por ello se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa (Figura
1.2).
6.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO:
6.2.1. Material:
• Tubo con 10 ml de solución salina.
• Cultivo de la bacteria problema.
6.2.2. Técnica:
• Cultivar la bacteria aislada en un tubo
de medio líquido apropiado (Caldo
nutritivo, Infusión cerebro-corazón), o
preparar una suspensión directa
usando el siguiente método:
• Tomar de una colonia aislada con el
asa, y resuspender en el tubo de
solución salina frotando en la pared del
tubo (Figura 6.1). Homogeneizar bien,
y ajustar la densidad óptica con un
patrón de turbidez n° 0.5 de
McFarland (0,5 ml de cloruro de bario
0,048 M y 99,5 ml de ácido sulfúrico Figura 6.1. Preparación de una
0,36 M). Esto equivale suspensión bacteriana.
aproximadamente a una densidad de
108 células/ml.
• Diluir si es necesario la suspensión, o añadir más inóculo.
6.3. ELECCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS A ENSAYAR:

Al no poder ensayarse todos los antibióticos existentes, debe hacerse una
selección basada principalmente en la especie aislada y el tipo y lugar de la
infección.
3
Tabla 6.1. Elección de antimicrobianos para el antibiograma.
BACTERIA ANTIBIOTICO CRITERIOa

Staphylococcus Penicilina G, oxacilina (isoxazolil-penicilinas) 1
spp. Cefalotina 1
Gentamicina 1
Clindamicina, vancomicina, eritromicina 1
Trimetoprím+Sulfametoxazol 1
Ofloxacina 2
Rifampicina 2
Enterococcus Penicilina G o ampicilina 1
spp. Estreptomicina, gentamicina 1
Vancomicina 1
Nitrofurantoína 3
Enterobacterias Ampicilina o amoxicilina 1
Amoxicilina + ácido clavulánico 1
Carbenicilina o ticarcilina, piperacilina o mezlocilina 2
Aztreonam, imipenem, meropenem 2
Cefalotina o cefuroxima 1
Cefoxitina, ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima y cefepima 2
Fosfomicina, trimetoprím+sulfametoxazol, 2
Acido nalidíxico, pipemídico, nitrofurantoína 3
Pseudomonas Carbenicilina o mezlocilina o ticarcilina 1
spp. Azlocilina o piperacilina 1
Ciprofloxacina 1
Ceftazidima 1
Imipenem, meropenem 1
Tobramicina, amicacina 1
Ticarcilina + ácido clavulánico 2
Aztreonam 2
Fosfomicina 2
a
1: Primera elección, 2: Segunda elección, 3: Sólo para infecciones urinarias.
Para algunos grupos de antibióticos es posible escoger un representante y no

ensayarlos todos. La Tabla 6.1 es sólo orientadora, y debe actualizarse
periódicamente.
6.4. ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN SEGÚN KIRBY-BAUER

Se basa en la formación en el gel de agar de un gradiente de concentración de
antibiótico a partir de un disco impregnado con una determinada cantidad. Al
crecer las bacterias inoculadas previamente sobre la superficie de la placa se
forman halos de inhibición alrededor de los discos, que define la zona en la que la
concentración de antibiótico es mayor que la CMI. Por lo tanto, su diámetro está
directamente relacionado con la CMI del antibiótico, y permite determinar la
sensibilidad o resistencia siempre que se respeten una serie de parámetros:
espesor del medio en la placa, su composición, inóculo bacteriano y tiempo de
incubación, principalmente. No puede utilizarse para bacterias de crecimiento
lento (> 24 h), porque desaparece el gradiente de concentraciones.
4
6.4.1. Material:
• Una placa con agar Mueller-Hinton.
• Hisopo o pipeta Pasteur.
• Pinzas.
• Discos de 6 mm de diámetro, impregnados cada uno con un antibiótico,
escogidos según se ha descrito en el apartado anterior.
6.4.2. Técnica:
Impregnar una torunda con la suspensión del inóculo; escurrirla contra la
pared del tubo y sembrar con ella toda la superficie de la placa, mediante estrías
cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben colocarse los discos de
antibióticos.
Con pinzas flameadas y frías (o con un aplicador automático) se disponen los
discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y
unos 30 mm entre sí. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al
agar presionando ligeramente con las pinzas.
A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 35-37º C (a 35° C como
máximo para poder detectar Staphylococcus resistentes a meticilina)
6.4.3. Lectura.
Se realiza a partir de las 16 horas (24 para detectar Staphylococcus
resistentes a meticilina). Medir los halos con calibrador o regla graduada,
considerando la zona que esta libre de crecimiento. En caso de bacteriostáticos es
aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de colonias en el interior del
halo indica contaminación, cultivo mixto o aparición de resistencia.
Consultar la Tabla 6.2 para interpretar el antibiograma.
6.5. EPSILÓMETRO (ε-TEST )
El epsilómetro o Epsilon-test (ε-test) es un método cuantitativo de

determinación in vitro de sensibilidad a antibióticos por difusión. El sistema
consiste en una tira de plástico impregnada con un antibiótico en un gradiente de
concentración, que difunde en un medio de agar inoculado con el microorganismo.
Tras la incubación aparece un área de inhibición de forma elipsoidal (de ahí el
nombre de la técnica). La concentración mínima inhibitoria (CMI) se lee
directamente en una escala dibujada sobre la tira, en el punto donde el elipsoide
de inhibición intersecciona con la tira.
Mediante esta técnica se puede determinar la sensibilidad a varios
antibióticos en la misma placa, disponiendo las tiras según los radios de la placa.
En esta práctica se utilizará un sólo antibiótico, ya que se hace de forma
complementaria al método de Kirby-Bauer.
6.5.1. Material
• Una placa con agar Mueller-Hinton.
• Tiras de ε-test (conservadas congeladas hasta el momento de su utilización).
• Un tubo con 5 ml de agua destilada estéril.
• Torundas estériles de algodón.
• Pinzas.
• Un cultivo puro del microorganismo problema.
5
6.5.2. Técnica.
• Utilizar el inóculo preparado como se ha descrito en el apartado 6.2.
• Impregnar la torunda con la suspensión del inóculo y sembrar con ella toda la
superficie de la placa de Mueller-Hinton.
• Con la ayuda de las pinzas (previamente flameadas y frías) coger una tira de
ε-test y colocarla sobre la superficie del agar.
Incubar a 37ºC, 18-24 horas y realizar la lectura de la CMI.
6.5.3. Interpretación.
• Leer la CMI sobre la tira de ε-test
Interpretar el resultado en términos de sensibilidad o resistencia, comparando
la CMI con las concentraciones críticas indicadas en la Tabla 6.2.
6
Tabla 6.2. Criterios de interpretación del antibiograma según NCCLS y MENSURAa

Diámetro del halo (mm) ó CMI (µg/ml)
Antimicrobiano Carga
Resistente Sensible
del disco Intermedio
β-LACTÁMICOS: ≤ mm µg/ml ≥ ≥ mm ≤ µg/ml
Penicilina G 10 U
Staphylococcus 28 0,25 29 0,12
Neisseria gonorrhoeae (b) 26 2 27-46 47 0,06
Streptococcus pneumoniae - 2 - 0,06
Streptococcus pyogenes 19 4 20-27 28 0,12
Enterococcus (c) 14 16 15 8
Oxacilina 1 µg
Staphylococcus 10 4 11-12 13 2
Streptococcus pneumoniae (d) 19 - 20 -
Ampicilina 10 µg
Listeria monocytogenes 19 4 20 2
Streptococcus pyogenes 21 2 22-29 30 0,12
Enterococcus 16 16 17 8
Haemophilus spp. 21 7 22-29 25 1
Enterobacterias 13 32 14-16 17 8
Ampicilina/Sulbactama 10/10 µg
Haemophilus spp. 19 4 20 2
Amoxicilina/Clavulanato 20/10 µg
Haemophilus 19 4 20 2
Otras bacterias 13 32 14-17 18 8
Carbenicilina 100 µg
Pseudomonas aeruginosa 13 128 14-16 17 64
Mezlocilina 75 µg 17 128 18-20 21 16
Piperacilina 100 µg
Pseudomonas aeruginosa 14 128 15 16
Aztreonam 30 µg 14 8 15 1
Ticarcilina 75 µg
Pseudomonas aeruginosa 14 18 15 32
Imipenem 10 µg
Enterobacterias, P. 13 16 14-15 16 2(4)*
aeruginosa*
Haemophilus spp. e e e 26 2
7
Tabla 6.2. (continuación)a
Diámetro del halo (mm) ó CMI (µg/ml)

Carga
Antimicrobiano Resistente Sensible
del disco Intermedio
≤ mm µg/ml ≥ ≥ mm ≤ µg/ml
CEFALOSPORINAS:
Cefazolina,cefalotina, 30 µg 14 32 15-17 18 4
cefuroxima, cefoxitina,
ceftazidima y cefepima
Cefotaxima, moxalactama 30 µg 14 8 15-22 23 1
Cefminox, cefotetán 30 µg 14 32 15-17 18 2
Ceftriaxona 30 µg 13 8 14-20 21 1
AMINOGLUCÓSIDOS:
Kanamicina 30 µg 13 32 14-17 18 8
Estreptomicina 10 µg 11 - 12-14 15 -
Amicacina 30 µg 14 32 15-16 17 8
Gentamicina, tobramicina 10 µg 12 16 13-14 15 4
QUINOLONAS:
Acido nalidíxico 30 µg 13 32 14-18 19 4
Norfloxacino 10 µg 12 8 13-16 17 1
Ciprofloxacino 5 µg 15 4 16-20 21 0,1
Ofloxacino 5 µg 12 8 13-15 16 0,5
OTROS ANTIMICROBIANOS:
Eritromicina 15 µg
Streptococcus spp. 15 2 15-20 21 0,5
Otras bacterias Gram (+) 13 2 14-22 23 0,5
Clindamicina 2 µg 14 4 15-20 21 0,5
Vancomicina 30 µg 9 32 10-11 12 4
Fosfomicina 50 µg 13 64 14 16
Nitrofurantoína 300 µg 14 128 15-16 17 64
Trimetoprím/ 1,25/ 10 8/152 11-15 16 2/38
/Sulfametoxazol 23,75 µg
Tetraciclina 30 µg
Haemophilus spp. 25 4 26-28 29 2
Neisseria gonorrhoeae 30 2 31-37 38 0,25
Otras bacterias 14 16 15-18 19 4
(a) Esta tabla está elaborada sólo para la realización de las prácticas, y no debe usarse con
fines clínicos sin actualizar. (b) Detectar ß-lactamasa con nitrocefín. (c) Moderadamente sensible;
debe utilizarse una asociación con un aminoglicósido. (d) Las cepas con un halo de inhibición para la
oxacilina ≥20 mm son sensibles a la penicilina (CMI 0,06 µg/ml). Si el halo de inhibición es ≤19 debe
estudiarse la CMI para la penicilina. (e) La ausencia de cepas resistentes impide determinar los halos
8
de inhibición para esta categoría. Ante una cepa con halo categorizado como "no sensible" debe
realizarse la determinación de la CMI y enviarse a un centro de referencia.
9
PRÁCTICA 7.
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Y DETERMINACIÓN DE LA
C.M.I. MEDIANTE PANELES COMERCIALES
7.1. INTRODUCCIÓN.
Los paneles de micropocillos que contienen sustratos o distintas
concentraciones de antibióticos, en forma liofilizada o congelada, permiten
identificar bacterias y determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de
varios antibióticos de forma rápida y sencilla.
Es suficiente añadir el inóculo bacteriano al panel (con lo que se hidrata a la
vez el sustrato o el antibiótico), incubar unas 18 horas, y detectar el crecimiento o
las reacciones bioquímicas. La detección puede hacerse en la mayoría de los casos
mediante equipos informatizados, que interpretan los resultados.
El sistema escogido en este caso es el panel Wider MIC/ID para bacterias
Gram-negativas, que
permite determinar la
CMI de 16 antibióticos por Tabla 7.1. Antibióticos y concentraciones utilizadas en el
microdilución en caldo e panel Wider 6W.
identificar la bacteria a
nivel de especie mediante Siglas Antibiótico Concentración (µg/ml)
26 pruebas bioquímicas.
7.2. Material:
• Colonias aisladas de la
bacteria problema.
• Tubo con 3 ml de agua
destilada.
• Tubo con 25 ml de
agua destilada/0,5%
Tween 80.
• Paneles Wider 6W.
• Aplicador.
7.3. Preparación del

inóculo:
• Tomar 4 ó 5 colonias
(más si son muy
pequeñas) con el asa
de siembra y
resuspenderlas homogéneamente en 3 ml de agua destilada frotando en la
pared del tubo (Figura 6.1).
• Ajustar a la turbidez del patrón 0,5 de McFarland, añadiendo más cultivo o
más agua, según sea preciso.
• Pasar 0,1 ml a un tubo con 25 ml de agua destilada/0,5% Tween 80.
10
7.4. Inoculación del panel:

• Verter los 25 ml de inóculo en la placa de inoculación.
• Cargar el inoculador y descargarlo sobre los pocillos del panel.
• Cubrir con aceite mineral los pocillos que aparecen subrayados (GLU, URE,
H2S, LYS, ARG, ORN y DCB).
• Apilar unos 5 paneles y cubrir con una tapa o un panel vacío.
• Incubar 18-20 horas a 36ºC.
Tabla 7.2. Interpretación de las pruebas bioquímicas del panel Wider W6
Las pruebas del panel que no se recogen en esta Tabla requieren la interpretación informatizada por la
casa productora, y no se utilizan en esta práctica.
11
7.5. Lectura del panel:

• Quitar el agua de condensación del fondo del panel
• El pocillo control (-) debe estar transparente, y el control (+) mostrar
crecimiento. En caso contrario, deséchese el panel.
7.5.1. Pruebas bioquímicas.

• Para la lectura de pruebas bioquímica consulte la Tabla 7.2. En algunos
pocillos es necesario añadir los correspondientes reactivos.
• Rellene con los resultados la plantilla que aparece en el Informe de la Práctica.
• Utilice la siguiente clave dicotómica para orientase; confirme los resultados con
los datos de la Tabla 7.3 para identificar la bacteria aislada. Algunas pruebas
del panel WIDER no aparecen en la citada tabla; es necesaria la información de
la casa comercial para su interpretación.
 + Enterobacter (INDOL−,VP−,LACTOSA+)
 Serratia (INDOL−, LACTOSA TARDÍA)
 Citrobacter diversus (INDOL+ VP+)
 + Klebsiella ODC 
 Enterobacter 
 Serratia  Klebsiella (INMÓVIL, UREASA RÁPIDA)
 Citrobacter  − Citrobacter freundii (MÓVIL, UREASA −/+)
 + Escherichia CITRATO 
 Klebsiella 
 Enterobacter   + E. coli (MÓVIL, LACTOSA+)
 Citrobacter  Escherichia LDC 
 Serratia  − coli  − Yersinia (INMÓVIL, LACTOSA−)
 Yersinia Yersinia
ONPG  + Proteus  + Proteus mirabilis (INDOL− ,SH2+)
  Providencia ODC  Morganella morganii (INDOL+, SH 2− )
  Morganella  − Proteus vulgaris (SH2+)
  Providencia (SH2− )
 Salmonella APP 
 Shigella 
 Proteus   + Salmonella (MÓVIL, SH2+)
 − Providencia  Salmonella CIT 
Morganella  − Shigella  − Shigella (INMÓVIL, SH2− )
12
Tabla 7.3. Identificación bioquímica de algunos bacilos Gram-negativos.
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter aerogenes
Aeromonas hydrophila
Klebsiella pneumoniae
Yersinia enterocolitica
Serratia marcescens
Citrobacter freundii
Providencia stuartii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Salmonella sp.
Shigella sp.
Prueba bioquímica: Siglas:
Oxidasa1 - - - - - - - - - - - + +
Oxidación/Fermentación O/F F F F F F F F F F F F O O
β-galactosidasa ONPG + + + + + + - - - - - - +
Producción de Indol IND + - - - -2
v - v + - + - +
Rojo de metilo RM + - (-) + (-) + + + + + + +
Voges-Proskauer VP - + + - + - - - - v - - -
Producción de SH2 H2 S - - - (+) - - + - + + - - +
Ureasa URE - - + v (-) (+) - - + + v v -
APP (TDA) TDA - - - - - - - - + + + - -
Lisina descarboxilasa LYS + + + - + - + - - - - - v
Arginina dihidrolasa ARG (-) - - v - - v - - - - + +
Ornitina descarboxilasa ORN (+) + - (-) + + (+) v - + - - -
Utilización de citrato CIT - + + + + - (+) - (-) v + + -
Utilización de malonato MAL - + + (-) - - - - - - - + -
Utilización de tartrato TAR v + + + (+) (+) + v (+) (+) + v -
Hidrólisis de esculina ESC (-) + + - + (-) - - V - - - +
Producción de ácido a partir de:
Glucosa GLU + + + + + + + + + + + - +
Adonitol ADO - + + - v - - - - - - - -
Arabinosa ARA v + + + - + (+) v - - - - +
Inositol INO - + + - (+) v v - - - + - -
Lactosa + + + v - - - - - - - - v
Melobiosa MEL v + + v - - + v - - - - -
Rafinosa RAF (-) + + v - - - v - - - - -
Ramnosa RHA (+) + + + - - (+) v - - - - -
Sorbitol SOR (+) + + + + + + v - - - - -
Sacarosa SUC (-) + + v + + - - + (-) v - +
(+): habitualmente positivo; (-): habitualmente negativo; v: variable según cepas.
1
Si es necesaria la prueba de la oxidasa debe realizarse por separado (ver apartado 4.4)
2
El pigmento de Serratia marcescens puede simular un falso positivo en la prueba del Indol.
7.5.2. Antibiograma.
• Aplique la definición de CMI a cada antibiótico, teniendo en cuenta que los
pocillos que aparecen transparentes el crecimiento ha sido inhibido, y en los
que aparecen turbios hay crecimiento. Algunas situaciones dudosas se
comentan en la Figura 7.1.
13
• Para determinar en cada caso si la bacteria es sensible o resistente

utilice la Tabla 7.4.
Figura 7.1. Interpretación del crecimiento para la determinación de la CMI en los paneles Wider 6W.
14
15
PRÁCTICA 8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Candida albicans
8.1. INTRODUCCIÓN.
En esta práctica se plantea la detección de levaduras patógenas y la
identificación presuntiva de Candida albicans.
La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o
faríngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis.
8.2. MATERIAL:
• Torunda con muestra de exudado.
• Tubo con agua destilada estéril.
• Tubo con 0,5 ml de suero de caballo.
• Una placa de agar-sangre (ver Práctica 1).
• Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para hongos,
debido a su pH ácido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse por adición
de antibióticos antibacterianos, como tetraciclina o cloranfenicol.
8.3. TÉCNICA:
8.3.1. Siembra.
Se realiza con el hisopo según el método ya descrito (Práctica 1). Cuando se
pretende aislar únicamente hongos se empleará el medio de Sabouraud; en caso
contrario se utilizará agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura de
incubación: 25°C para hongos, y 37°C para levaduras y bacterias indistintamente.
8.3.2. Identificación.
Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura.
Pueden observarse en fresco (a 40x) o teñidas por el método de Gram (los hongos
salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x.
8.3.2.1. Prueba de la filamentación:
Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 ó 3 gotas
de esa suspensión y añadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37°C
durante 3 horas.
Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos.
La morfología celular permite asegurar que se trata de una levadura. La
producción de filamentos permite identificar presuntamente a Candida albicans
(también los produce Candida stellatoidea). La identificación puede confirmarse
mediante pruebas bioquímicas y de necesidades nutricionales (auxonograma).
16
BIBLIOGRAFIA
• Bailey-Scott Diagnostic Microbiology, 11th Ed. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y

Weisfsfeld, A.S. Mosby, 2002.
• Diagnóstico Microbiológico. Texto y atlas color, 5ª Ed. Koneman, E.W., S.D.
Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. Panamericana, 1999.
• Bacteriología Clínica. Struther, J.K. y Westran, R.P. Masson, 2005.
• Microbiología Sanitaria y Clínica. Rotger, R. Síntesis, 1997.
• Microbiología Médica, 2ª Ed. Mims, C., J.H. Playfair, I.M. Roitt, D. Wakelin y
R. Williams. HARCOURT-BRACE, 1999.
• Manual of Clinical Microbiology, 8th Ed. Murray, P.R. ASM Press, 2003.
17
CALENDARIO DE PRÁCTICAS (normal)

1ª SEMANA Teoría: Práctica:
LUNES Organización del laboratorio PRÁCTICA 1: EXUDADO FARÍNGEO: (POR PAREJAS) PRÁCTICA 2: UROCULTIVO
Infecciones del Tracto TOMAR MUESTRA, TINCION DE GRAM SIEMBRA (INDIVIDUAL)

Urinario SIEMBRA EN AGAR SANGRE
MARTES Infecciones faríngeas PRÁCTICA 1: OBSERVAR COLONIAS, TINCIONES DE PRÁCTICA 2: RECUENTO, TINCIÓN DE GRAM Y
GRAM, RESIEMBRA DE β-HEMOLÍTICOS Y PRUEBA DE SIEMBRA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
LA BACITRACINA (PRÁCTICA 4) (PRÁCTICA 4)
Recoger torunda para la toma de heces.
MIÉRCOLES Gastroenteritis PRÁCTICA 1: LEER PRUEBA DE LA BACITRACINA PRÁCTICA 2: LEER PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN.
bacterianas (1) SEMBRAR PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
HACER INFORME
PRÁCTICA 3: COPROCULTIVO (INDIVIDUAL)
JUEVES Métodos de difusión para el PRÁCTICA 3: IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter PRÁCTICA 2: LEER PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.
ensayo de la sensibilidad a PRÁCTICA 5: AGLUTINACIÓN DE Staphylococcus PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN
antibióticos
ε-TEST (sobre bacteria del urocultivo)
VIERNES Gastroenteritis PRÁCTICA 3: INTERPRETACIÓN DEL COPROCULTIVO. PRÁCTICA 6: LEER ANTIBIOGRAMA Y ε−TEST Y
bacterianas (2) AISLAMIENTO DE BACTERIAS PARA IDENTIFICACIÓN. HACER INFORMES 2 Y 6.
PRÁCTICA 8 y 4: AISLAMIENTO DE Candida y
Streptococcus agalactiae (POR PAREJAS)
2ª SEMANA Vaginitis y vaginosis PRÁCTICA 7: INOCULACIÓN DE PANELES WIDER (Y PRÁCTICA 8: PRUEBA DE FILAMENTACIÓN DE
MOVILIDAD) CON EL AISLAMIENTO DEL Candida. PRUEBA CAMP PARA Streptococcus
LUNES COPROCULTIVO. (PRÁCTICA 4)
MARTES Métodos de antibiograma PRÁCTICA 7: LECTURA DE LOS PANELES WIDER: PRÁCTICA 8: LEER PRUEBAS CAMP Y
por dilución IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA. FILAMENTACIÓN
PRÁCTICA 5: AGLUTINACIÓN DE Salmonella
HACER INFORMES
MIÉRCOLES EXAMEN 1
INFORME DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
APELLIDOS, NOMBRE:
GRUPO: FECHA:
PRACTICA 1. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EXUDADO

FARÍNGEO
Muestra propia:
Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias: Tinción de Gram:
Muestras con ejemplo de hemólisis (identificación):
Muestra A:
Muestra B:
2
PRACTICA 2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ORINA.
Muestra n°:
Urocultivo
Recuento: colonias/ml
Identificación (Práctica 4)
Tinción de Gram:
Pruebas Bioquímicas: Resultados:
Aglutinación, si procede:
Resultado de la identificación:
Antibiograma: (Práctica 6)
Antibiótico (carga del disco): Ø del halo: R/I/S
Antibiótico recomendado (justifique su elección):
3
PRACTICA 3. COPROCULTIVO
Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias:
Medio: Muestra propia: Muestra clínica:
Informe:
Aislamiento e
identificación
Aglutinación,
si procede:
4
PRACTICA 7. IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA CON PANELES

WIDER
Resultado de las pruebas bioquímicas:
+ –
5
Identificación:
Resultado del antibiograma:
Antibiótico CMI S/R/I
Amicacina
Amoxicilina
Amoxicilina/Clavulanato
Cefotaxima
Cefoxitina
Ceftazidima
Ceftazidima/Clavulanato
Cefuroxima
Ciprofloxacina
Fosfomicina
Gentamicina
Imipenem
Meropenem
Ácido Nalidíxico
Piperacilina/Tazobactama
Nitrofurantoína
Ticarcilina
Trimetoprím/Sulfametoxazol
Tobramicina
6
PRACTICA 8. ANÁLISIS MICROBIÓLOGICO DE EXUDADO VAGINAL
Resultado del cultivo: Tinción de Gram y/o observación

en fresco (esquema):
En agar-sangre:
En agar Sabouraud:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

Prueba de filamentación (esquema):
Identificación:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

Pruebas de identificación:
Resultado:

Gui A Clinic A Lab Oratorio

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Universidad Complutense

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

• Cualquier alumno que sufra alguna alteración de sus defensas o

• El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén

• Los laboratorios de investigación son de acceso exclusivo del personal del

• Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el

• Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en

• En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u

• Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del

• Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material

• Está prohibido pipetear con la boca.

• Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse

• No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener

• No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone

• La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se

1.2. TOMA DE MUESTRAS, EXAMEN

1.2.2.1. Toma de muestra.

positivos) y la ausencia de catalasa (ver apartado 4.3). Además de los estreptococos

2.2. TOMA DE MUESTRA.

2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO PRELIMINAR.

2.4. UROCULTIVO CUANTITATIVO.

• Una placa con medio CLED (Cistina, Lactosa,

• Entre los cocos Gram-positivos, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus

2.5.1. Observación de las colonias.

2.5.2. Tinción de Gram de una colonia.

3.2. TOMA DE MUESTRAS Y TRANSPORTE.

Las placas se incuban a 36°C en aerobiosis durante 48 horas, para que

3.4. EXAMEN DE LOS CULTIVOS.

Agar Salmonella-Shigella (SS)

Agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato)

Agar entérico Hektoen

Agar BS (Sulfito de Bismuto)

Agar con Verde Brillante

Agar CIN (para Yersinia)

normales. La propiedad diferencial se basa en la fermentación de manitol con

Agar Campy-BAP (para Campylobacter)

4.3. COCOS GRAM POSITIVOS.

CATALASA (+): Staphylococcus

4.3.1. Identificación de estafilococos.

• 1 placa con medio Chapman-Manitol (Manitol-Sal). Este medio es selectivo para

a) Fermentación del manitol: Sembrar la bacteria en placa de Chapman-manitol.

BacitracinaS S. pyogenes (Grupo A). Confirmar serológicamente

Sin hemólisis, BacitracinaR Bilis-esculina (+): Enterococcus (Grupo D)

4.5. BACILOS GRAM-NEGATIVOS.

4.5.1. Identificación de bacilos Gram-negativos no fermentadores.

OXIDASA O/F BACTERIA

b) Oxidación/Fermentación (O/F): Sembrar la bacteria en picadura en dos

 P. aeruginosa : CRECE A 42°C; PIOCIANINA +; FLUORESCEINA +

4.5.2. Identificación de Campylobacter jejuni

4.5.3. Identificación de enterobacterias (Enterobacteriaceae).

• 1 tubo con agar urea Christensen.

Intentar la identificación mediante la Tabla 4.1. Si no se puede completar,

4.5.3.2. Segunda batería de identificación.

• Solución de sosa al 16 por 100.

TABLA 4.1. CLASIFICACIÓN DE ALGUNAS ENTEROBACTERIAS SEGÚN PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

MEDIO DE KLIGLER Ó TSI INDOL CITRATO UREASA APP ONPG MÓVIL RM VP

5.2. IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus POR AGLUTINACIÓN EN

5.2.2. Lectura e interpretación.

5.3. SEROLOGÍA DE Salmonella.

Tabla 5.1. Composición antigénica de algunos serotipos de Salmonella.

Serotipo Serogrupo Antígenos O (y K) Antígenos H*

6.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO:

6.3. ELECCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS A ENSAYAR: