Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Biologa Celular BIO 035

TRABAJO PRCTICO n3: MICROSCOPIA

Alumnos: Emerson Paineman Seccin: 12 Profesores: Alberto Einstein

-abril, 2011-

Introduccin:
Para poder efectuar un estudio celular y de microbiologa nos encontraremos con ciertas dificultades, como por ejemplo el reducido tamao de estas muestras, las que escapan al poder de resolucin el ojo humano, el que est establecido en un valor de 0,2mm, lo que nos permite visualizar solo hasta la separacin de objetos distanciados en un mnimo de 1mm. Para poder solventar estos problemas (la visualizacin), fue desarrollado a mediados del siglo XVII el microscopio y mejorado con el paso del tiempo, adems de mejoramientos en las tcnicas del tratado de muestras: fijaciones, tinciones, etc. Sirvindonos del microscopio seremos capaces de poder superar las dificultades relacionadas con el tamao de la muestra pero aun as nos encontraremos con ciertas interrogantes relacionadas con su utilizacin como: forma en que funcia el microscopio?, Qu afecta a la visualizacin en el microscopio?

Objetivos:
Con esta actividad esperamos comprender el funcionamiento y modo de utilizacin del microscopio, ptico en nuestro caso, adems de los mtodos de fijacin, tincin, las substancias y funcionalidad de los distintos tipos de agentes de tincin. Tambin observar, analizar las estructuras visibles, contabilizar y calcular los tamaos de distintos tipos de clulas de fijacin permanente y analizar muestras celulares de preparacin frescas.

Materiales y mtodos:
Se dio inicio a la actividad observando el microscopio, analizndolo y reconociendo cada una de sus partes, colocando especial atencin en las caractersticas de los lentes (tanto oculares como objetivos) y tomando nota de sus respectivos aumentos y aperturas numricas, adjuntando tambin la apertura numrica del condensador. Conjunto a la apertura numrica mnima de los distintos medios que intervienen dentro de la observacin nos fue posible calcular tanto el lmite de resolucin como el poder de resolucin del equipo. Una vez con los datos anteriores listos dimos paso a comprobar un efecto ptico causado por la cercana del objeto en observacin con los distintos lentes, en el cual el objeto se observaba en posicin invertida adems de visualizar las diferencias entre una observacin efectuada con un lente de 10x y uno de 40x. Ya comprendidas las capacidades de los lentes y la caracterstica de la inversin de la imagen, procedimos a calcular el capo visual de los distintos lentes atreves de la determinacin del dimetro del campo visual del lente de 4x, el que fue determinado por la observacin de un trozo de papel milimetrado preparado en un portaobjetos con agua y un cubre objetos. Una vez concluidas las determinaciones de las caractersticas de de los lentes, tanto de sus capacidades como del tamao de su campo visual proseguimos por la observacin de muestras biolgicas tanto fijadas como frescas. Las observaciones realizadas en muestras fijadas fueron realizadas en muestras de frotis de sangre humana, trozo de hgado bovino y una seccin de intestino delgado de ratn, los que fueron preparados (fijados) con sustancias especiales como acetona, formaldehido o glutaraldehido para preservar su forma y las interacciones, adems de embeberlo en parafina para realizar cortes aptos para la visualizacin, una vez ya cortados son disueltos con solventes orgnicos para su observacin final. Las muestras son analizadas bajo un lente de 100x , tambin conocido como lente de inmersin , ya que para una correcta visualizacin es debido exponerlo a una substancia de mayor apertura numrica que el aire, el aceite de inmersin. Adems de los distintos detalles observados en las distintas muestras, tambin es debido efectuar una contabilizacin estimativa de la cantidad de clulas en campo visual del lente, con lo que podremos saber el tamao de estas. Ya observadas las muestras fijadas continuamos con muestras frescas de catafilos de cebolla, un alga denominada elodea sp y aguas estancadas contenedoras de protozoos denominados euglena. Para poder llevar a cabo la observacin del catafilo de cebolla fue necesario preparar una muestra adecuada para observacin seccionando un trozo fino de tejido con una gillette, posicionarlo sobre un porta objetos preparado con una gota de agua destilada dispuesta por una pipeta Pasteur y cubrirla con un cubreobjetos. Una vez realizada la observacin
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se vuelve a realizar otra mas pero con la muestra de cebolla expuesta al agente de tincin azul de metileno, el cual ingresa a la muestra por capilaridad de la misma, tomando notas de ambas observaciones. Respecto a la observacin de elodea se llevo a cabo la preparacin de la muestra y toma de datos describiendo las estructuras observables. durante la observacin de protozoos, preparados para observacin de muestra fresca, fue distinguible la especie euglena. Todas las muestras an sido graficadas.

Resultados:
Durante las observaciones de las distintas caractersticas del microscopio hemos distinguido las distintas capacidades de los distintos lentes, las que se detallan a continuacin:

Lentes Objetivos

Aumentos 4x 10x 40x 100x 10x -

aperturas numricas 0,10 0,25 0,65 1,25 18 1,25

Oculares condensador

Apertura numrica: ndice de la capacidad del lente en el aprovechamiento de la luz para el aumento de la imagen la que tambin condiciona la resolucin mxima.

y todo esto con un limite de resolucin de 0,244 um y un poder de resolucin de 4,098 x10^6.

Durante la observacin de la letra fue posible distinguir, tanto bajo un aumento de 10x como de 40x, que esta se visualizaba de manera invertida respecto a la orientacin
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original adems de los respectivos detalles visualizables con el aumento, como la forma de la dispersin de la tinta impresa, distinguible en modo de manchas, la forma del papel, compuesto por micro fibras.

Esquema de la letra visualizada por el microscopio.

La determinacin del campo visual de cada lente objetivo, llevada a cabo en base a la determinacin del dimetro del campo visual del lente de 4x, ha sido determinada en los siguientes valores: Lente objetivo 4x 10x 40x 100x Dimetro de campo visual 9mm 3,6mm 0,9mm 0,36mm

Tabla: lente determinado con el clculo de su respectivo dimetro de campo visual.

La observacin de muestras preparadas, fijadas, a sido realizada sobre muestras de frotis de sangre humana, intestino delgado de rata y un trozo de hgado bovino. En la observacin de la preparacin del frotis de sangre humana realizada en un aumento de 100x, fueron distinguibles varias formas ya conocidas: Glbulos rojos (A) Glbulos blancos, en este caso eosinofilos (B) Trombocitos
Frotis de sangre humana: en es distinguible glbulos rojos, blancos (eosinofilos) y trombocitos, todos ellos de coloracin azulosa debido a los mtodos de fijacin.

Con una estimacin de la cantidad de clulas distinguibles en el rango visual nos sido posible realizar una determinacin del tamao de las clulas de 1,636 um.

La observacin realizada en la muestra de hgado bovino, realizada en un aumento de 100x, nos ha sido posible distinguir el ncleo de las clulas hepticas, de una coloracin purpurea, y el cito plasma de color violeta, debido a el glicgeno dentro de ellas. Con la estimacin de la cantidad de las clulas distinguibles en el campo visual, hemos podido determinar un tamao de 6,923 um

Ilustracin de la observacin la muestra de clulas de hgado bovino

En la observacin de la muestra de intestino delgado de ratn, desarrollada con un lente de 100x, se distingui compuesta por enterocitos, de color rosa claro, encargados de la absorcin y clulas de goblet, con coloracin morada, dedicadas a la secrecin de mucosa. El tamao estimado de las clulas ha sido evaluado en 3,429 um.

Figura: muestra de intestino delgado de ratn, en el cual es apreciable los enterocitos y c. de goblet.

En la observacin del catafilo de cebolla, realizada con el lente de 40x y sin tincin, fueron visualizables las paredes celulares y levemente los ncleos, aunque todo de modo traslucido amarillento, dificultando la visibilidad de los ncleos. Una vez realizada la tincin, adems de verse de color azulado debido al azul de metileno, fue ms fcil la distincin del ncleo y las respectivas paredes celulares.

figura: catafilo de cebolla sin y con tincin. Agente de tincin: azul de metileno.

Observacin realizada en Elodea sp, realizada bajo lentes de 100x. En esta son fcilmente distinguibles elementos como las paredes celulares y los cloroplastos, adems de la vacuola central, aun que en el caso de la vacuola, el citoplasma y la membrana plasmtica son fcilmente confundibles ya que no presentan alguna manera fcilmente de distinguir donde termina una e inicia la otra.

Imagen de clulas de Elodea sp.

En la observacin de la muestra de protozoos, desarrolladas bajo lente de 100x, fue posible distinguir al micro organismo denominado euglena, anexpan, en el que han sido observables una gran cantidad de elementos en su interior como partculas almacenadas de polisacridos sintetizados por fotosntesis, vacuolas contrctiles, fotoreceptores, cloroplastos el ncleo y el casi invisible flagelo.

figura: ilustracin de euglena, en la que se distinguen los polisacridos almacenados (de color caf), el ncleo (de verde oscuro), cloroplastos (verde claro), vacuola contrctil (celeste), fotoreceptor (rojo).

Discusin:
La experimentacin con la letra, la cual nos daba a entender que las imgenes visualizadas a travs del microscopio son de carcter real e invertidas, adems del objetivo del porque de la existencia del microscopio, el aumento de la imagen. Esta inversin de la imagen observada se debe a que los objetos bajo exanimacin se encuentran fuera de la distancia focal del lente objetivo, dando que los rayos de luz reflejados por el objeto de observacin fuesen enfocados ms all de la cara contraria del lente aumentando, invirtiendo y creando una imagen real de lo observado. Los resultados de esta observacin fueron contrarios a los esperados, ya que no consideramos la presentacin de este efecto ptico, el que presentaron los lentes dentro de la observacin. La existencia de sustancias como los aceites de inmersin ha sido una gran innovacin dentro de nuestros conocimientos, no esperbamos que con la inclusin de sustancias ajenas al sistema de lentes fuese posible aumentar la capacidad de aumento de las imgenes, todo esto debido al detalle de aperturas numricas, en el que la apertura numrica del aceite oscila entre los 1,3 a 1,5, superior a la presentada por el aire (1,0), facilitando una visualizacin de mayor capacidad. Respecto a la observacin de muestras celulares ha sido algo distinta a lo esperado, el efecto de los mtodos de fijacin y la inexperiencia en trabajos de observacin de muestras biolgicas bajo microscopio dio como resultado inexactitudes en el inicio de la observacin, como el que el frotis de sangre humana presente una coloracin azulosa, desconcertndonos, esto debido a los procesos de fijacin, embebido y corte, adems de la dificultad, dependiendo de lo que est siendo observado, para determinar los respectivos elementos presentes en los distintos tejidos incluyendo el hecho de la dificultad de delimitacin de las distintas secciones presentes. Las complicaciones de reconocimiento han sido reconocibles principalmente en la observacin en las muestras frescas, el Elodea, Euglena y catafilo de cebolla, las que han sido solventadas comparando las ilustraciones realizadas en la actividad con esquemas de las mismas, siendo nominados solo las estructuras visualizadas en la observacin.

Bibliografa:
o De Robertis y de Robertis, biologa celular y molecular (1991). Ed. El ateneo, undcima edicin-cuarta reimpresin. Buenos Aires, pp. 62-71. -informacin sobre funcionamientos de microscopiao http://es.scribd.com/doc/3929013/Opticageometricaespejos-y-lentes fecha de ingreso:27 abril 2011 -inversin de imagen, figura 6.12, pagina 6-8.o http://bioticderi.blogspot.com/2010/01/practica-12-frotis-de-sangre.html fecha de ingeso:27 abril 2011 -imgenes de esquema de frotis sangre humana.o http://www.histol.chuvashia.com/atlas-en/cytol-en.htm fecha de ingreso:27 abril 2011 -esquema clulas hepticas.o http://instruction.cvhs.okstate.edu/histology/HistologyReference/hrd1.htm fecha de ingreso:27 abril 2011 -esquema del intestino.o http://andreaciencias.blogspot.com/2009_11_01_archive.html fecha de ingreso:27 abril 2011. - imgenes esquemticas de elodea y euglena-

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