Normas generales de uso del laboratorio

Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad. 1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. 2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. 3. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. 5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos qumicos. 7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 8. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 9. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. 10. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. 11. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. 12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. 13. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. 14. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. 15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullicin rpida, se

retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. 16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. 17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.

El Microscopio ptico compuesto

PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

Sistema ptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecnico o SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, .. o REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 6. Empleo del objetivo de inmersin: . Bajar totalmente la platina. a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. b. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. c. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. d. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. f. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. g. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. h. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el

objetivo de inmersin en posicin de observacin. i. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. 5. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.

Preparacin de colorantes
1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen) o cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos.

Azul de metileno................................................................................1 g Agua destilada...............................................................................100 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................100 ml 4. Colorante para esporas: o Solucin acuosa saturada de verde malaquita 5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml o Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml o Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................100 ml 7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. o Eosina...............................................................................................0,3 g o cido actico glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada...................................................................................100 ml 8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................100 ml 9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. o Fucsina bsica......................................................................................1 g o Etanol 95%........................................................................................10 ml o Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml 10. Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. o Hematoxilina.........................................................................................2 g o Agua destilada......................................................................................1 l 11. Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. o cido lctico.....................................................................................100 ml o Fenol................................................................................................100 g o Glicerol.............................................................................................200 ml o Agua.................................................................................................100 ml 12. Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10

o o

ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales 13. Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. o Yodo...................................................................................................1 g o Yoduro potsico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................300 ml 14. Orcena A: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................45,8 ml o cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua..................................................................................................45,8 ml 15. Orcena B: Tincin de cromosomas. o Orcena................................................................................................2 g o cido actico.....................................................................................55 ml o Agua..................................................................................................55 ml 16. Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.........................................................................................0,25 g o Agua destilada..................................................................................100 m 17. Sudn III: Tincin especfica de grasas. o Alcohol etlico...................................................................................100 ml o Sudn III...................................................................................hasta saturacin 18. Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

Preparacin de un frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber.

REALIZACIN DEL FROTIS 1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya

que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse. FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS 4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases. 5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tincin. TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO 6. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producira la destruccin de las clulas. 7. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 8. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso se debe frotar el porta. 9. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIN

La tcnica siguiente es de aplicacin para cualquier preparacin microscpica que se desee montar de forma definitiva. Se anotar en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparacin, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno. 10. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones mantenindolos un mnimo de 5 minutos en cada bao. La serie de alcoholes puede modificarse en funcin de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparacin quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente bao. a. Alcohol de 70 b. Alcohol de 95 c. Acetona pura d. Acetona-xilol (1:1) e. Xilol 11. Montar la preparacin. Emplear blsamo de Canad, euparal o algn medio de montaje sinttico. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm. Prctica en formato Word 2003: tincionsimple.zip (30Kb)

Observacin de bacterias
OBJETIVOS 1. Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales. 2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda una u otra. 3. Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen. 4. Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersin. MATERIAL

Mechero Bunsen o de alcohol Asa de siembra o aguja enmangada Pinzas Portaobjetos Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc.

Colorantes para tincin: a) Solucin de cristal violeta al 1% b) Solucin de safranina al 0,5% c) Azul de metileno al 1% Microscopio y aceite de inmersin

BACTERIAS DEL YOGUR El yogur es un producto lcteo producido por la fermentacin natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30m de longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio. 1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de agua. 2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa. 3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos. 4. Observar al mximo aumento del microscopio. BACTERIAS DEL VINAGRE El vinagre es una solucin acuosa rica en cido actico resultante de la fermentacin espontnea del vino o de bebidas alcohlicas de baja graduacin. La acetificacin del vino es producida por bacterias aerbicas del cido actico, principalmente Acetobacter aceti, aunque tambin Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares. 1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado. 2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis. 3. Dejar secar y fijar con calor. 4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SARRO DENTAL El sarro dental es un depsito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Est constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metablicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparacin, pero suelen abundar bacterias saprfitas, pudindose observar gran variedad de morfologas: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos. 1. Con una aguja enmangada tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Dejar secar y fijar con calor. 3. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SUELO

La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prcticamente infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso, desconocidas para los microbilogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardn. Despus de varios das, las bacterias se habrn adherido al vidrio y slo habr que fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.

Observacin de clulas de tejido adiposo

MATERIAL

Microscopio Porta y cubreobjetos Bistur o escalpelo Frasco lavador

Cubeta de tincin Tocino u otra grasa animal Formol Sudn III

TCNICA 1. Con ayuda de un bistur, cortar una finsima capa de grasa, colocarla en un porta y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos. 2. Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudn III. Dejar actuar unos 5 minutos. 3. Volver a lavar la preparacin con agua, cubrirla con un cubreobjetos y observar al microscopio.

Aislamiento de casena y lactosa

MATERIALES Vasos de precipitados Mechero, rejilla y trpode Varilla de vidrio o esptula Trompa de vaco Papel secamanos de laboratorio Erlenmeyer

Leche descremada Actico glacial Carbonato clcico en polvo Etanol 95% Etanol acuoso 25% Carbn activo

1. AISLAMIENTO DE LA CASEINA 1. Introducir 200 ml. de leche descremada en un vaso ancho de 600 ml. No se debe

dejar la leche en reposo durante mucho tiempo antes de utilizarla, ya que la lactosa puede convertirse lentamente en cido lctico, aunque se guarde en la nevera. 2. Calentar la leche hasta aproximadamente los 40 C y aadir gota a gota una disolucin de cido actico diluido (1 volumen de cido actico glacial en 10 volmenes de agua), con un cuentagotas. 3. Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el proceso de adicin. Continuar aadiendo cido actico diluido hasta que no precipite ms casena. Debe evitarse un exceso de cido porque puede hidrolizarse parte de la lactosa. Agitar la casena hasta que se forma una gran masa amorfa. 4. Separar la casena con ayuda de una varilla o esptula y colocarla en otro vaso. 5. Aadir, inmediatamente, 5 g de carbonato de calcio en polvo al primer vaso (que contiene el lquido del que se ha separado la casena). 6. Agitar esta mezcla durante unos minutos y guardarla para utilizarla luego en la siguiente prctica. Debe utilizarse cuanto antes y durante el mismo perodo de trabajo. Esta mezcla contiene lactosa. 7. Filtrar la masa de casena al vaco durante aproximadamente 15 minutos para separar todo el lquido que sea posible. 8. Presionar la casena con una esptula durante la operacin de filtrado. 9. Colocar el producto entre varias toallas de papel para ayudar a secar la casena. Cambiar el producto por lo menos en tres o cuatro ocasiones, poniendo nuevas toallas de papel, hasta que la casena est completamente seca. Dejar que la casena se seque completamente al aire durante uno o dos das y finalmente pesarla. 10. La densidad de la leche es de 1,03 g/ml. Calcular el porcentaje de casena aislada. 2. AISLAMIENTO DE LA LACTOSA 1. Calentar la mezcla que se guardaba del experimento anterior a ebullicin suave durante aproximadamente 10 minutos. Esto causar la precipitacin casi completa de las albminas (proteinas del suero). 2. Filtrar la mezcla caliente al vaco para separar las albminas precipitadas y el carbonato de calcio que an quede. 3. Concentrar el filtrado (transparente), en un vaso de boca ancha de 600 ml. con un mechero Bunsen, hasta aproximadamente 30 ml. Utilizar varias varillas para ayudar a conseguir una ebullicin homognea y evitar las salpicaduras que se produciran al ir aumentando el precipitado. Tambin se puede formar espuma, si la mezcla entra en ebullicin con demasiada fuerza. Esto puede controlarse soplando suavemente sobre la superficie de la disolucin de lactosa. 4. Aadir 175 ml de etanol del 95% (lejos de cualquier llama) y 1 2 g de carbn activo a la disolucin caliente. 5. Despus de haberlo mezclado todo bien, filtrar la solucin caliente al vaco. El filtrado debe ser transparente. El filtrado puede enturbiarse debido a la cristalizacin rpida de la lactosa, despus de la filtracin al vaco. Si la turbidez aumenta con relativa rapidez al dejarla en reposo, debe evitarse otra filtracin, pues se perdera producto.

6. Pasar la disolucin a un matraz Erlenmeyer y dejarla reposar durante la noche o hasta que se inicie el siguiente perodo de trabajo. En algunos casos, se requieren varios das para que la cristalizacin haya finalizado. La lactosa cristaliza en la pared y en el fondo del matraz. 7. Desalojar los cristales y filtrarlos al vaco. 8. Lavar el producto con unos pocos mililitros de etanol acuoso fro al 25 %. La lactosa cristaliza con una molcula de agua, C12H22O11H2O. 9. Pesar el producto cuando est completamente seco. La densidad de la leche es de 1,03 g/ml. Con este valor, calcular el porcentaje de lactosa en la leche.

Observacin microscpica de hongos

OBJETIVOS 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. 2. Observar la morfologa de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan MATERIAL

Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol Aguja enmangada o lanceta

Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos Solucin de lactofenol al azul algodn Cinta adhesiva transparente

PREPARACIN EN FRESCO DE MOHOS

TCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar la muestra. 2. Tomar el material a observar en una mnima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidiforos. 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que ser ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas

tapizadas en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente sobre la gota o se seccionarn con un bistur. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado. 5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios. PREPARACIN EN CINTA ADHESIVA

TCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado gruesa. 2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. 3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas. 4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. 5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro. RESULTADOS

Moho del tomate: x600 x1500 Aspergillus: x150 x600 (foto a / foto b) Penicillum: x600 x1500

Prctica en formato Word 2003: ho

xtraccin "casera" de ADN

(y comparacin con el protocolo normalizado)
La presente prctica se puede realizar perfectamente en una cocina normal de una casa. Es ms, en un laboratorio de un centro de enseanza media es frecuente que no se disponga de aparatos o reactivos necesarios para llevarla a cabo y que, por el contrario, siempre hay en una cocina (nevera con congelador, batidora, hielo, etc.) MATERIAL Y REACTIVOS

Muestra vegetal Agua (destilada o mineral) Sal de mesa Bicarbonato sdico Detergente lquido o

Batidora Nevera Colador o centrfuga Vaso

champ Alcohol isoamlico a 0C

Tubo de ensayo Varilla fina

FUNDAMENTO La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separado de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico, probablemente el nico reactivo de esta prctica que no suele haber en una cocina. REALIZACIN 1. Preparar el tampn con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un bao de hielo triturado: o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo. o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. o 5 g de bicarbonato sdico. o 5 ml de detergente lquido o champ. 2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos. 3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. As se rompern muchas clulas y otras quedarn expuestas a la accin del detergente. 4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampn fro y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar despus los restos vegetales ms grandes del caldo molecular hacindolo pasar por un colador lo ms fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y despus pipetear el sobrenadante. 5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y aadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamlico enfriado a 0C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo ste inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el tampn. 6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separacin entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs y poco a poco se irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedar adherido a su estremo con el aspecto de un copo de algodn mojado.

RESULTADOS El producto filamentoso obtenido de la extraccin no es ADN puro ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin "profesional" se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN. Resulta curioso comparar este mtodo de extraccin con el correspondiente protocolo que siguen los laboratorios de anlisis: Protocolo QIAGEN de purificacin de ADN

Reconocimiento de glcidos

Tubos de ensayo Gradilla Pinzas Mechero Pipetas Solucin de Lugol

MATERIALES Solucin de Fehling A y B Solucin alcalina (sosa, potasa, bicarbonato, etc.) ClH diluido Soluciones al 5% de glucosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa y almidn.

1. ESTUDIO DE AZCARES REDUCTORES FUNDAMENTO Los monosacridos y la mayora de los disacridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molcula. Este carcter reductor puede ponerse de manifiesto por medio de una reaccin redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reaccin con el glcido reductor se forma xido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reaccin y que, por lo tanto, el glcido presente es reductor. TCNICA 1. Poner en los tubos de ensayo 3ml de la solucin de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o sacarosa (segn indique el profesor). 2. Aadir 1ml de solucin de Fehling A (contiene CuSO4) y 1ml de Fehling B (lleva NaOH para alcalinizar el medio y permitir la reaccin) 3. Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan. 4. La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo y ser negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso. 5. Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prcticas con las distintas muestras de glcidos. 2. HIDRLISIS DE LA SACAROSA

FUNDAMENTO La sacarosa es un disacrido que no posee carbonos anomricos libres por lo que carece de poder reductor y la reaccin con el licor de Fehling es negativa, tal y como ha quedado demostrado en el experimento 1. Sin embargo, en presencia de ClH y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molcula de agua y se descompone en los monosacridos que la forman, glucosa y fructosa, que s son reductores. La prueba de que se ha verificado la hidrlisis se realiza con el licor de Fehling y, si el resultado es positivo, aparecer un precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrlisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloracin verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrlisis parcial de la sacarosa. TCNICA 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tomar 3ml de solucin de sacarosa y aadir 10 gotas de ClH diluido. Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos. Dejar enfriar. Neutralizar aadiendo 3ml de solucin alcalina. Realizar la prueba de Fehling como se indica en el experimento 1. Observar y anotar los resultados. 3. INVESTIGACIN DE POLISACRIDOS (ALMIDN) FUNDAMENTO El almidn es un polisacrido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reaccin qumica sino a la adsorcin o fijacin de yodo en la superficie de la molcula de amilosa, lo cual slo ocurre en fro. Como reactivo se usa una solucin denominada lugol que contiene yodo y yoduro potsico. Como los polisacridos no tienen poder reductor, la reaccin de Fehling da negativa. TCNICA 1. 2. 3. 4. 5. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solucin de almidn. Aadir 3 gotas de la solucin de lugol. Observar y anotar los resultados. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color. Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cmo, a los 2-3 minutos, reaparece el color azul.