Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

REA ESPECFICA DE:

MICROBIOLOGA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: CDIGO: FECHA DE ELABORACIN: NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: TIPO DE ASIGNATURA:

LABORATORIO DE MICOLOGA FAR 335L MARZO 2002 FORMATIVO DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIN: QFB. Ana Berta Escobedo Lpez MSP. Claudy Lorena Villagran Padilla MC. Gloria Len Tello MSP. Jess Luzuriaga Galicia MSP. Juan Manuel lvarez Lpez QFB. Ma. de la Cruz Meneses Snchez HORAS DE TEORA: 3 HORAS PRCTICA: 2 CRDITOS: 8

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

INDICE
Pgina Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Prctica 4 Prctica 5 Prctica 6 Prctica 7 Prctica 8 Prctica 9 Prctica 10 Prctica 11 Prctica 12 Prctica 13 Prctica 14 Prctica 15 Prctica 16 Seguridad en el laboratorio Aislamiento y siembra de hongos en placa y tubo Reconocimiento de las estructuras bsicas de los hongos Estructuras de reproduccin asexual en hongos saprofticos Identificacin macro y microscpica de los hongos saprofticos ms frecuentes Dermatofitos Identificacin macro y microscpica de los Dermatofitos Pitiriasis versicolor Cromomicosis y esporotricosis Criptococosis Candidiasis Geotricosis Aspergilosis Blastomicosis Y Paracoccidiodomicosis Micosis Evaluacin Bibliografa 22 24 27 29 33 35 37 40 42 43 17 20 15 13 6 8 10

Accin fungicidade los imidazoles empleados en el tratamiento de

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prlogo

La Micologa es una rama dentro de la Microbiologa a la que se le presta poco inters, quizs porque para muchos microbilogos es un rea muy rida, a la cual el acceso a casos clnicos resulta en la mayora de los casos poco accesibles, pero es algo que no debe desalentar ya que los retos hacen que los triunfos se disfruten mucho ms. Los hongos son microorganismos con una gran gama de caractersticas las cuales los hacen muy interesantes, desde su gran variedad en tamao y color de colonia considerando el punto de vista macroscpico hasta la diversidad de sus formas microscpicas los hongos presentan una importancia tanto mdica como industrial. Mdica en la gran diversidad de micosis que pueden causar, desde las ms sencillas como lo es un Pie de atleta hasta las ms complejas como lo puede ser una Criptococosis menngea entre otras. Infecciones que no respetan ni edad ni sexo ya que pueden causar problemas tanto a hombres como mujeres, a nios y adultos. En algn momento pueden resultar fastidiosos cuando despliegan su facilidad para contaminar alimentos y medio ambiente ocasionando un deterioro en los mismos, lo cual puede causar ligeros malestares en las personas que van desde un malestar estomacal hasta una alergia. Pero no todo es nocivo en ellos ya que a nivel industrial son de gran utilidad, ayudan a darle esa calidad a la cerveza durante el proceso de fermentacin, a dar el punto exacto de maduracin a cierto tipo de quesos, a participar como principio activo de ciertos antibiticos y a dar ese sabor exquisito al pan. Por todo esto es importante conocerlos, saber la forma de identificarlos y esta es la finalidad que persigue este Manual el dar a conocer al alumno las caractersticas de identificacin de estos microorganismos as como la forma de poder aislarlos.

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

1.-Llegar puntual a prctica, se dar un tiempo de tolerancia de 10 minutos antes de pasar lista 2.-Traer bata blanca limpia, con botones y entrar con ella ya puesta 3.- Las mochilas sern colocadas en los cajones o en el lugar indicado por el profesor 4.-El lugar de trabajo dentro del laboratorio ser opcional para el alumno pero a partir de la primera practica ese ser su lugar de trabajo 5.-En la mesa de trabajo solo tendr el manual de practicas y los elementos para trabajar (lpices, plumas, cerillos, maskin tape, etc.) 6.-No se debe comer ni tomar lquidos dentro del laboratorio y mucho menos durante la realizacin de la prctica 7.-Queda prohibido fumar 8.-En prcticas donde se requiera pipetear se prohbe hacerlo con la boca 9.-Antes y despus de utilizar el asa de trabajo se debe esterilizar 10.-En el caso de accidente informar INMEDIATAMENTE al profesor responsable. 11.-Todo material que requiera ser desechado se colocara en el lugar indicado ex profeso por el profesor 12.- En cada prctica se deber contestar el cuestionario correspondiente, el cual ser revisado nicamente a los 8 das de realizada la prctica, de lo contrario, se restar medio punto a la calificacin final por cada cuestionario no presentado a tiempo. 13.- El laboratorio se evaluar con un examen terico-prctico al final del curso que corresponder al 20% de la calificacin final de la materia.

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 1. Seguridad en el Laboratorio

Introduccin. Los laboratorios de Micologa son ambientes especiales con respecto a la seguridad de aquellos que trabajan en ellos, las muestras clnicas de pacientes recibidas para su estudio significan un riesgo para el personal debido a los agentes infecciosos que pueden contener . Los cultivos de agentes infecciosos producto de muchas de las actividades del micologo clnico tambien constituyen una amenaza. La educacin del personal que manipula a diario los agentes potencialmente infecciosos y la educacin por medio de avisos sobre riesgos biologicos, as como instrucciones escritas y verbales de aquellos que solo tienen una exposicin limitada al ambiente del laboratorio son las medidas disponibles ms importantes para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio, los riesgos de un laboratorio de Micologa pueden extenderse a laboratorios adyacentes. Adems del riesgo por infeccin los laboratorios de Micologa tambin estn expuestos a todos los riesgos asociados a cualquier ambiente de laboratorio como incendio, riesgos electricos, qumicos, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos, peligros dependientes de desastres naturales, situaciones ambientales como pisos deslizantes, sistemas de circulacin de aire deficiente. Se debe poseer un manual de seguridad que contenga informacin sobre la conducta a seguir en caso de una contigencia Objetivo. Dar a conocer a los alumnos a travs de un seminario las reglas de seguridad a seguir durante el desarrollo de las prcticas a realizar Tcnicas a emplear. Exposicin oral del tema utilizando material didctico ( acetatos, diapositivas) Material a emplear. Acetatos y diapositivas Desarrollo de la prctica. 1.- Exposicin oral 2.- Ronda de preguntas 3.- Aclaracin de dudas

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Reporte. Resumen de lo expuesto durante el Seminario

Cuestionario 1.- Defina que es seguridad 2.- En un laboratorio que factores pueden alterar la seguridad 3.- Que pasos se deben seguir para establecer la seguridad 4.- De los factores que pueden alterar la seguridad cual considera el ms importante 5.- Una breve crtica acerca del tema

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 2 AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE HONGOS EN PLACA Y TUBO. Introduccin. La mayora de los alimentos y productos agrcolas, son invadidos por diversos microorganismos durante su desarrollo y su almacenamiento, siendo los hongos los ms abundantes y la principal causa de los procesos de putrefaccin de los alimentos y de los granos, ocasionando severas prdidas econmicas. Algunos hongos se encuentran como flora normal de diversas cavidades y mucosas del organismo humano, as como estn presentes en el suelo y las plantas, donde se considera que tales sitios son su hbitat normal. Objetivo. El alumno se familiarizar y aprender a manejar las diversas tcnicas de aislamiento y siembra de hongos para su posterior identificacin. Tcnicas a emplear. A).- Tcnica de dilucin y vertido en placa (sustratos slidos o lquidos muy contaminados). 1.- Preparar de 4 a 5 tubos con 9 ml de agua destilada, o bien, solucin salina isotnica, esterilizar y numerar del 1 al 5. 2.- Se suspende en el tubo 1, un ml, o bien, un gramo de alimento muestra a analizar. 3.- Homogenizar perfectamente la prueba. 4.- con ayuda de una pipeta estril, tomar 1 ml del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2; con otra pipeta estril, se toma una alcuota de 1 ml y se lleva al tubo 3; as sucesivamente hasta llegar al tuvo 5. 5.- De las dos ltimas, tomar 1 ml de cada una y depositarlos respectivamente en las placas de Petri estriles y vacas. 6.- Adicionar aproximadamente 20 ml del medio PDA o SDA, estril, fundido y enfriado a 45C. 7.- Homogenizar por rotacin de las placas sobre la mesa. 8.- Dejar solidificar e incubar a 28C por 4 a 5 das. 9.- Hacer observaciones cada 48 hrs. hasta la aparicin de colonias caractersticas de hongos. B).- Tcnica de siembra por puntos en placa o tubo (sustratos slidos poco contaminados). 1.- Fragmentar dentro de una placa el material a estudiar. 2.- Con la ayuda de asas micolgicas flameadas y estriles distribuir de 4 a 5 fragmentos de la muestra sobre la superficie de una placa de Petri con medio SDA o PDA (si utiliza tubo distribuya de 2 a 3 fragmentos de la muestra sobre la superficie del pico de flauta).

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

3.- Incubar a 28C durante 3 a 4 das observando el desarrollo alrededor de los fragmentos cada 48 hrs. C).- Tcnica de exposicin de placa (medio ambiente) 1.- Distribuir placas con medio SDA o PDA en los sitios donde se desee hacer el aislamiento. 2.- Destaparlas y exponerlas al ambiente de 5 a 10 minutos, taparlas. 3.- Incubar a 28C durante 4 a 5 das y observando cada 48 horas hasta la aparicin de colonias de hongos. Material a emplear. 1.- Suelo. 2.- Refrescos embotellados. 3.- Granos (arroz, trigo, frjol, etc.) 4.- Alimento (chocolate, yogurt, queso, etc.) 5.- Placas con medio SDA o PDA. 6.- Tubos con tapn de rosca con medio SDA o PDA. 7.- Tubos con solucin salina isotnica, o bien, agua estril. 8.- Placas de Petri y pipetas de 1 mL estriles. PDA= Papa Dextrosa Agar. SDA= Sabouraud Dextrosa Agar. Desarrollo de la prctica. 1.- Proceder al aislamiento de hongos por la tcnica de dilucin y vertido en placa. 2.- Proceder al aislamiento de hongos por la tcnica de puntos en placa o tubo. 3.- Proceder al aislamiento de hongos por la tcnica de exposicin de placas. Cuestionario 1.- Defina el trmino aislamiento 2.- Cules son las tcnicas de aislamiento para hongos? 3.- Cul es la composicin qumica de los medios de cultivo para hongos? 4.- Cmo define un hongo contaminante? 5.- Cul es la temperatura adecuada de crecimiento de un hongo? 6.- Menciona si la muestra estaba libre de contaminacin, en caso de haber estado contaminada por hongos o levaduras menciona cuantas colonias aislaste por mL de muestra.

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 3. RECONOCIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS BSICAS DE LOS HONGOS. Introduccin. La mayora de los que deben relacionarse con la rama micolgica, a menudo se sienten confundidos y desalentados en sus tentativas para estudiar los hongos debido a la gran variacin en el aspecto macroscpico de las colonias, a la multiplicidad de las estructuras microscpicas y a la nomenclatura poco conocida. Sin embargo, estas dificultades son ms psicolgicas que reales y cuando se llegan a dominar unos cuantos conceptos bsicos basados en las morfologas macroscpica y microscpica, la identificacin de los hongos resulta ms fcil y rpida que en otras bacterias ordinarias. Los hongos emiten una o ms prolongaciones tubulares llamadas tubos germinales o tambin llamadas hifas, que se alargan por el crecimiento de su extremo distal. La hifa puede dividirse por formacin de paredes transversales a intervalos regulares. Las hifas divididas por tabiques se denominan hifas tabicadas, sin embargo algunos hongos no desarrollan tabicaciones en las hifas y se denominan no tabicadas o cenocticas. Finalmente, el conjunto de hifas desarrollan lo que se conoce como micelio, la diferenciacin de los hongos se basa principalmente en su aspecto colonial y morfologa microscpica. l.- La morfologa colonial se basa en los siguientes parmetros: - Aspecto - Consistencia. - Pigmentacin de la colonia. - Difusin de pigmento al medio. - Luz reflejada. - Luz transmitida. - Bordes. ll.- Morfologa microscpica ( referente al micelio ) - Tabicado o septado. - Cenoctico. - Hialino. - Pigmentado ( fugilaginoso, carotenoide ) - Macrosifonado - Microsifonado. Objetivo. El alumno ser capaz de diferenciar las colonias de los hongos y los diversos tipos de estructuras bsicas, como por ejemplo, el micelio por medio de tcnicas de observacin en fresco o directa y algunas preparaciones facilitadas por el profesor, valorando estos parmetros como fundamentales en la identificacin de los hongos.

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Tcnicas a emplear. A).- Tcnica de resiembra en tubo. 1.- Con el asa micolgica en ngulo de 90 tomar un pequeo fragmento de loas colonias con morfologa diferente y depositarlo en un tubo con medio inclinado PDA o SDA. 2.- Incubar a 28C. 3.- Observar cada 40 horas el desarrollo de las colonias. B).- Tcnica de observacin microscpica en fresco. 1.- Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodn lactofenol. 2.- Con el asa micolgica tomar un pequeo fragmento de la colonia y colocarlo sobre el porta objetos. 3.- Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de hongos con esporulacin abundante). 4.- Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de diseccin o bien con la misma asa micolgica. 5.- Colocar sobre la preparacin un cubre objeto evitando formar burbujas de aire. 6.- Observar al microscopio a seco dbil y seco fuerte, nunca usar aceite de inmersin. Material a emplear. 1.- Colonias de hongos aisladas en la prctica anterior. 2.- Colonias de hongos proporcionadas por el profesor. 3.- Tubos con medio PDA o SDA. 4.- Colorante azul de algodn. 5.- Preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 6.- Porta y cubre objetos. Desarrollo de la prctica. 1.- Observar las colonias aisladas de los sustratos (prctica # 1). 2.- Escoger diferentes tipos de colonias y resembrarlas en tubos con medio PDA o SDA. 3.-Observar comparativamente las caractersticas macroscpicas de las colonias desarrolladas. 4.- Hacer preparaciones en fresco con azul de algodn lactofenol de las colonias aisladas resultando de la prctica anterior. 5.- Observar comparativamente el micelio de las muestras aisladas con las preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. Dibujos: a.- Hifa. b.- Micelio. c.- Micelio macrosifonado septado. d.- Micelio macrosifonado cenoctico. e.- Micelio septado fugilaginoso. f.- Micelio microsifonado.

10

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Descripcin macroscpica de las cepas tipo proporcionadas por la responsable del laboratorio. Cuestionario 1.- Defina el trmino hifa y micelio 2.-Mencione la clasificacin del micelio segn: a.- Funcin b.- Dimetro c.- Continuidad d.- Coloracin 3.- Por la morfologa macroscpica y microscpica, cmo puede ser un hongo? 4.-Cmo fue el crecimiento obtenido de la practica anterior? 5.-Mencione los parmetros utilizados en la lectura de morfologa colonial de hongos

11

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 4. ESTRUCTURAS DE REPRODUCCIN ASEXUAL EN HONGOS SAPRFITOS. Introduccin. La espora se refiere a un rgano que tiene como funcin la multiplicacin del hongo, las esporas tienen una forma definida que puede ser redonda, ovalada, ms o menos larga etc. Pueden ser unicelulares o pluricelulares; su tamao vara de 2 a varias decenas de micras, su pared es sencilla o doble. Las esporas asexuadas se forman ya sea en el interior de un saco por lo que se conoce como endosporas o en el exterior conocindolas como exosporas, fijadas a la extremidad o sobre el trayecto de una hifa. Tambin pueden ser producidas por rganos especiales, al ser puestas en libertas las esporas pueden multiplicarse y dar origen a una colonia. Las esporas asexuadas son el resultado de la transformacin de la hifa, sin el concurso de fenmenos sexuales y se dividen en tres grupos: A).- Talosporas que a su vez se subdividen en: - Artrosporas. - Blasrtosporas. - Dictiosporas. - Clamidosporas. - Aleuriosporas. B).- Conidiosporas. C).- Esporangiosporas. Objetivo. Que el alumno se introduzca en el conocimiento bsico de las diferentes estructuras de reproduccin asexual, parmetro bsico e importante en la identificacin microscpica de los diferentes hongos filamentosos y levaduriformes. Tcnicas a emplear. Preparacin de placas para microcultivo. 1.- Seleccionar placas Petri de 20 x 100 mm. 2.- Colocar dentro de la placa un crculo de papel filtro. 3.- Sobre el crculo de papel colocar una varilla de vidrio de 8 mm de dimetro doblada en V. 4.- Sobre la varilla colocar un porta y un cubre objetos (22 x 22 mm). 5.- Esterilizar las placas as preparadas. 6.- Colocar glicerol al 10% estril. 7.- Formol al 10%. 8.- Pinzas, pipetas estriles. 9.- Placa con medio de cultivo SDA o PDA (se deber seccionar en cuadros pequeos en una zona estril).

12

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Material a emplear. 1.- Colonias de hongos aisladas en la prctica anterior. 2.- Colonias de hongos proporcionadas por el profesor. 3.- Cultivos de Candida albicans en medio de Agar Harina de Maz o medio para clamidosporas. 4.- Preparaciones fijas proporcionadas por el profesor Desarrollo de la prctica. 1.- Realizar la tcnica de microcultivo a partir de las colonias obtenidas en tubo. 2.- Observar y comparar al microscopio los diversos tipos de esporas asexuales en preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 3.- Hacer los dibujos y anotar en nombre del hongo correspondiente: a.- Artrosporas. b.- Blastosporas. c.- Clamidosporas. d.- Esporangiosporas. e.- Conidiosporas. f.- Macroconidias. g.- Dictiosporas. h.- Fialosporas Cuestionario 1.-Defina el termino espora 2.- Mencione los grupos de esporas por las cuales se reproducen los hongos 3.- Un hongo filamentoso, porque tipo de esporas se reproduce? 4.- Una levadura, porque tipo de esporas se reproduce? 5.- Que tcnica se utiliza para la observacin microscpica de las esporas?

13

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 5. IDENTIFICACIN MACRO Y MICROSCPICA DE LOS HONGOS SAPROFITOS MS FRECUENTES. Introduccin. La presencia de hongos en alimentos y productos alimenticios no es una novedad, se conoce desde hace mucho tiempo y de hecho estos hongos, levaduras o mohos han sido utilizados para alterar de manera deseable el sabor y olor de algn alimento (maduracin de quesos y carnes, produccin de vinos y cerveza). Los hongos tambin se conocen como descomponedores de los alimentos, actualmente existen ciencias especializadas en el estudio de los hongos, ya que stos han demostrado gran relevancia en las reas mdica, alimenticia, agrcola, etc... En el rea mdica por los diversos cuadros clnicos que producen en el humano, causando hasta la muerte (esto es cuando no se lleva a cabo un buen diagnstico de laboratorio y mdico). En el rea de la industria alimenticia posee gran valor como contaminantes de materia prima y producto terminado, causando en la mayora de los casos perdidas econmicas a la empresa, o bien son utilizados como elementos de gran valor en la produccin de diversas enzimas, antibiticos y vitaminas. En el rea agrcola, pueden producir destruccin de cosechas, o bien se asocian a otros microorganismos del suelo contribuyendo al logro de cultivos frondosos. Los diferentes tipos de hongos saprfitos pueden entonces tener efectos nocivos o bien aportar beneficios. Objetivo. Que el alumno establezca los diversos parmetros macro y microscpicos para la identificacin propia y definitiva de los hongos saprfitos ms frecuentes. Material a emplear. 1.- Preparaciones obtenidas a partir del microculivo. 2.- Preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 3.- Sepas de hongos saprfitos proporcionados por el profesor. Desarrollo de la prctica. 1.- Desmontar la preparacin del microcultivo. Teir y sellar. 2.- Hacer comparaciones microscpicas entre las preparaciones obtenidas por los equipos y las preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 3.- Hacer los dibujos correspondientes a: a.- Rhizopus. b.- Mucor. c.- Aspergillus.

14

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

d.- Penicillum. e.- Geotrichum. f.- Hormodendrum. 4.- Describir la morfologa macroscpica de los hongos filamentosos. 5.- Describir la morfologa macroscpica de los hongos levaduriformes. Cuestionario 1.-Que parmetros se deben considerar para hacer una identificacin microscpica de los hongos 2.- Anote la ficha de identificacin de los siguientes hongos a.- Rhizopus b.- Mucor c.- Aspergillus niger d.- Penicillum sp e.-Ulocladium sp f.- Alternaria sp g.- Sacharomyces cereviceae h.- Rodhotorula sp

15

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 6. DERMATOFITOS (Tias) Introduccin. Las tias constituyen un grupo de micosis causadas por hongos taxonmicamente relacionados que afectan los tejidos queratinizados: piel, cabello, uas en el humano, plumas, cuernos y piel de animales. Estos hongos pertenecen a numerosas especies agrupadas en tres gneros: Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton. Los hongos pertenecientes a estos gneros tienen como caracterstica comn la de poseer enzimas queratinofilicas para atacar a la queratina presente en la piel y otras estructuras del hospedero, por lo que se conocen con el nombre de dermatofitos y dermatofitosis o tias a las enfermedades que ellos producen. Los dermatofitos manifiestan su estado parasitario a travs de hifas ramificadas o bien hifas con artrosporas, esta forma la adquieren en el tejido que atacan. En el estado saprofito o vegetativo estos hongos presentan estructuras ornamentadas y variadas que se toman como base para la diferenciacin entre diferentes gneros y especies a nivel microscpico. Objetivo. Familiarizar al alumno con las diversas tomas de muestras clnicas de acuerdo a la zona afectada por los dermatofitos; instruirlo en el manejo de las tcnicas en fresco a travs de la cual buscara el estado parasitario de los mismos en las diferentes muestras clnicas Tcnicas a emplear. A).- Obtencin de escamas. 1.- El laboratorista deber de proveerse de alcohol, gasa, lancetas estriles, placas de Petri y un marcador. 2.- Se localiza la parte afectada y se analiza macroscpicamente la lesin anotando si hay o no descamacin, resequedad, si hay bordes, etc. 3.- Se limpia la zona afectada con gasa y alcohol. 4.- Se hace un raspado ligero con uno de los bordes de la lanceta (de ser posible obtener fragmentos de la lesin con pinzas). NOTA: Cuando el paciente es un nio y no resiste el raspado, o si la descamacin no es visible, la muestra se toma adhiriendo a la piel un trozo de cinta "SCOTCH" y retirndola de golpe, la cual se colocara en un porta objeto para su transporte y observacin. 5.- El producto de la lesin se recolecta en placas de Petri. 6.- Se toman los datos del paciente escribindolos con marcador en la parte superior de la placa. 7.- En el laboratorio, con una parte de la muestra se realiza una preparacin en fresco de la siguiente manera: a).- Sobre un porta objetos agregar una gota de NaOH o KOH del 5 al 10% (solucin aclarante).

16

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

b).- Se deposita un pequeo fragmento de muestra y se deja reposar por 10 minutos. c).- Se deposita un cubre objetos sobre la preparacin, tratando de no formar burbujas de aire y se deja reposar la muestra por 15 minutos. d).- La preparacin se observa al microscopio con el objetivo seco dbil y seco fuerte, tratando de buscar la fase parasitaria del hongo. 8.- En zona de esterilidad junto a un mechero, la muestra clnica sobrante se siembra por la tcnica de punto en placa y en tubos con medios de cultivo que contengan SDA, PDA, Agar microbitico, etc. 9.- Se encuban las placas a 28C durante 4 a 5 das haciendo la revisin de las siembras cada 48 horas harta la aparicin de las colonias caractersticas. B).- Tcnica del raspado de uas. 1.- Se sienta al paciente en alto y se procede a limpiar la ua afectada con alcohol. 2.- El borde del dedo afectado se deposita sobre el margen de la placa de Petri. 3.- Se raspa la ua con una navaja de afeitar nueva, yendo de la parte proximal a la dixtal. 4.- La muestra se recolecta en la caja de Petri y se tapa para su transporte. NOTA: SI ms de una ua est afectada, se debe usar un equipo limpio para cada ua (navajas limpias). C).- Tcnica de obtencin de cabellos. 1.- examinar el cuero cabelludo del paciente. 2.- Depilar con pinzas los cabellos afectados y al mismo tiempo colectar las escamas que se hallen sobre el cuero cabelludo. 3.- Depositar las muestras sobre una placa de Petri estril y cerrarla. 4.- Cuando el paciente es un nio que no resiste la depilacin los cabellos se toman con una cinta "Scotch". 5.- A partir de entonces se procede igual que en el paso # 7 de la primera tcnica descrita en est prctica. Material a emplear. 1.- Diversas muestras clnicas parasitadas por dermatofitos. 2.- Tubos con medio SDA, PDA, Micobiotico. 3.- KOH o NaOH al 5-10%. 4.- Cepas de: a.- Trichophyton (T. mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, T. concentricum ). b.- Microsporum gypseum. c.- Epidermophyton floccosum. Desarrollo de la prctica. 1.- Hacer preparaciones en fresco con las muestras de pelo y/o escamas, de piel y/o uas. 2.- Buscar artrosporas e hifas ramificadas (fase parasitaria comn de los dermatofitos) 3.- Cultivar las muestras clnicas por la tcnica de punto en placa o en tubo, empleando los diversos medios de cultivo. 4.- Hacer microcultivo de las cepas tipo proporcionadas por el profesor. 5.- Hacer la descripcin macroscpica de las cepas tipo proporcionadas por el profesor.

17

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Dibujos. Muestra positiva a fase parasitaria. Descripcin macroscpica de las cepas tipo. Cuestionario 1.-Defina el termino tia 2.- Por su topografa cmo se clasifican las tias? 3.- Qu tcnicas se emplean en la toma de muestras para tias? 4.- Qu solucin se emplea para realizar el en fresco de una muestra de tia? 5.- Qu se debe observar en la preparacin en fresco para determinar que se trata de una tia? 6.- Hacer un reporte de la muestra utilizada con la siguiente informacin: a) Tipo de muestra b) Observaciones de la lesin c) Microorganismo aislado d) Conclusiones

18

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 7. IDENTIFICACIN MACRO Y MICROSCPICA DE LOS DERMATOFITOS. Introduccin. Se ha podido llegar a una clasificacin simplificada de los dermatofitos mediante el cultivo de los mismos y la seleccin de ciertos caracteres morfolgicos especficos como criterios para la diferenciacin entre gneros y especies. Por este mtodo, Emmons demostr con claridad mxima que tan solo procede considerar tres gneros: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton, la diferenciacin de los gneros y sus respectivas especies se basa en las caractersticas macroscpicas de las colonias y en la morfologa microscpica. Gnero Trichophtyon: Por examen macroscpico, la colonia tiene aspecto algodonoso, pulverulento o polvoriento o velloso, liso o creo. La pigmentacin vara notablemente, ya que en cultivo pueden ser blancos, rosados o rojos, purpreos, violetas, anaranjados, amarillos o pardos. Puede presentarse pigmento difusible al medio, que se aprecia al reverso de la placa o tubo; este pigmento puede variar del color beige al caf o rojo vino intenso. Por examen microscpico las macroconidias son raras o no existen en algunas especies, a menos que el hongo se desarrolle sobre un medio de cultivo apropiado y se observan como grandes estructuras fusiformes en mazo, de pared gruesa o lisa de 4 a 6 micras de ancho por 10 a 50 micras de longitud. Pueden verse tambin otras estructuras como micelio en raqueta, clamidosporas y cuerpos nodulares o hifas en espiral. Gnero Microsporum: En cultivo desarrollo un micelio areo, algodonoso, lanudo, pulverulento o polvoriento, cuyo color vara del ante al blanco o matices ms intensos del pardo. Por examen microscpico, la pared espinosa de las macroconidias caracteriza al gnero, puede ser pequea (de dos septos) o grande (de 6 a 12 septos), fusiforme u oval, de pared gruesa o delgada, se presentan microconidias, se advierten tambin hifas septadas similares a clamidosporas. Gnero Epidermophyton: Por su aspecto macroscpico, los cultivos son caractersticamente aterciopelados o pulverulentos, con surcos radiales ventrales y color amarillo verdoso. Por examen microscpico solo producen grandes macroconidias de pared delgada, lisas, multitabicadas y en mazo. En el micelio se ven clamidosporas e hifas en raqueta, este gnero solo incluye una especie (E. floccosum ) Objetivo. Familiarizar al alumno con los parmetros macro y microscpicos de los dermatofitos en base a las cepas tipo.

19

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Material a emplear. 1.- Microcultivos sembrados en la prctica anterior. 2.- Cepas tipo proporcionadas por el profesor. 3.- Formol al 10%. 4.- Colorante azul de algodn. 5.- Barniz de uas transparente. Desarrollar la prctica. 1.- Hacer un anlisis macroscpico de los cultivos obtenidos a partir de la muestra problema y cepas tipo proporcionales por el profesor. 2.- Desmontar los microcultivos despus de haber desactivado con formol al 10% por lo menos 45 minutos antes y hacer un anlisis microscpico comparativo con preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 3.- Hacer la descripcin macroscpica de las cepas tipo proporcionadas por el profesor. Dibujos. a.- Trichophyton Tonsurans. b.- Trichophyton Rubrum. c.- Trichophyton Mentagrophytes. d.- Microsporum Gypseum. E.- Epidermophyton Floccosum. Descripcin macroscpica de las cepas tipo. Cuestionario 1.-De la clasificacin con gnero y especie de Dermatofitos 2.- Qu tipo de tejido atacan los Dermatofitos? 3.- Cul es el sustrato que degradan los Dermatofitos? 4.- Que poseen los Dermatofitos para poder degradar este sustrato? 5.- En trminos generales cmo es la morfologa macroscpica de un Dermatofito?

20

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 8. Pitiriasis versicolor Introduccin. Micosis superficial causada por Malassezia furfur, afecta sobre todo tronco y races de extremidades, se caracteriza por manchas lenticulares asintomticas de color rosado, marrn o hipocromicas cubiertas de escama fina y de evolucin crnica. Su distribucin es cosmopolita , afecta a ambos sexos con ligero predominio en mujeres, es rara en nios y ancianos pero se ha observado desde antes de las dos semanas de edad hasta despus de los 90 aos , con predominio de los 20 a los 30 aos de edad, se manifiesta en cualquier raza y nivel socioeconmico. Se consideran como factores predisponentes desnutricin, infeccioines crnicas, embarazo, administracin de glucocorticoides, aplicacin de aceites y lubricantes en la piel , uso de prendas sinteticas, no se ha demostrado contagio. Objetivo. Familiarizar al alumno con la toma de muestra clnica de lesiones caractersticas de esta micosis; instruirlo en el manejo de la tcnica en fresco a travs de la cual se buscara el estado parasitario del agente etiologico en la muestra clnica seleccionada Tcnicas a emplear. A).- Obtencin de escamas. 1.- El laboratorista deber de proveerse de alcohol, gasa, lancetas estriles, placas de Petri y un marcador. 2.- Se localiza la parte afectada y se analiza macroscpicamente la lesin anotando si hay o no descamacin, resequedad, si hay bordes, etc. 3.- Se limpia la zona afectada con gasa y alcohol. 4.- Se hace un raspado ligero con uno de los bordes de la lanceta ola muestra se toma adhiriendo a la piel un trozo de cinta "SCOTCH" y retirndola de golpe, la cual se colocara en un porta objeto para su transporte y observacin. 5.- El producto de la lesin se recolecta en placas de Petri. 6.- Se toman los datos del paciente escribindolos con marcador en la parte superior de la placa. 7.- En el laboratorio, con una parte de la muestra se realiza una preparacin en fresco de la siguiente manera: a).- Sobre un porta objetos agregar una gota de NaOH o KOH del 5 al 10% ms una gota de azul de Parker b).- Se deposita un pequeo fragmento de muestra y se deja reposar por 10 minutos. c).- Se deposita un cubre objetos sobre la preparacin, tratando de no formar burbujas de aire y se deja reposar la muestra por 15 minutos. d).- La preparacin se observa al microscopio con el objetivo seco dbil y seco fuerte, tratando de buscar la fase parasitaria del hongo.

21

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

8.- En zona de esterilidad junto a un mechero, la muestra clnica sobrante se siembra por la tcnica de punto en placa y en tubos con medios de cultivo que contengan SDA, PDA, Agar Micobitico, etc a los cuales se les agrega 5% de aceite de oliva 9.- Se encuban las placas a 37C durante 4 a 5 das haciendo la revisin de las siembras cada 48 horas harta la aparicin de las colonias caractersticas.

Material a emplear. 1.- Diversas muestras clnicas parasitadas por Malassezia furfur 2.- Tubos con medio SDA, PDA, Micobiotico ms 5% de aceite de oliva 3.- KOH o NaOH al 5-10%. 4.- Azul de Parker 4.- Cepas de: a.- Malassezia furfur . Desarrollo de la prctica. 1.- Hacer preparaciones en fresco con las muestras de escamas,. 2.- Buscar acmulos de blastosporas y filamentos cortos 3.- Cultivar las muestras clnicas por la tcnica de punto en placa o en tubo, empleando los diversos medios de cultivo. 4.- Hacer microcultivo de las cepas tipo proporcionadas por el profesor. 5.- Hacer la descripcin macroscpica de la cepa tipo proporcionada por el profesor. Dibujos. Muestra positiva a fase parasitaria. Descripcin macroscpica de las cepa tipo. Cuestionario 1.-Defina el termino Pitiriasis 2.- En que tipo de pacientes es frecuente esta micosis? 3.- Qu tcnicas se emplean en la toma de muestras para este padecimiento? 4.- Qu solucin se emplea para realizar el en fresco de una muestra de Pitiriasis? 5.- Qu se debe observar en la preparacin en fresco para determinar que se trata de una Pitiriasis? 6.- Hacer un reporte de la muestra utilizada con la siguiente informacin: a) Tipo de muestra b) Observaciones de la lesin c) Microorganismo aislado d) Conclusiones

22

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 9 CROMOMICOSIS Y ESPOROTRICOSIS (MICOSIS SUBCUTNEAS) Introduccin. Esporotricosis.- Es una micosis generalmente subcutnea y benigna, pero que en raros casos puede ser generalizada y mortal. Afecta especialmente las extremidades superiores e inferiores y excepcionalmente produce enfermedad pulmonar primaria al penetrar por va respiratoria. La esporotricosis prevalece en campesinos, empacadores de alfarera y vendedores de diversos zacates, la va de entrada es a travs de la piel, mediante un traumatismo cutneo con espinas u otros objetos vegetales. En su fase parasitaria, el hongo se observa como levaduras gemantes alargadas (en forma de puro) o redondeadas de 3 a 10 micras de dimetro. En la fase saprobia el hongo tiene micelio delgado (1 a 2 micras de dimetro), tabicado, ramificado, que esporula mediante conidiforos en forma de flor de margarita. El examen directo del pus no permite en general visualizar al hongo; raramente se pueden observar las formas parasitarias en frotes de pus teidos por el mtodo de Hotchkiss-Mac Manus. El cultivo es el mejor mtodo diagnostico de la esporotricosis, mediante la siembra del pus en placa con SDA, las colonias al principio son pequeas y blancas y crecen de micelio ereo; a medida que aumenta el crecimiento, la superficie de la colonia adquiere aspecto hmedo, rugoso y membranoso, el color puede variar del crema al negro. Cromomicosis.- Es una micosis verrucosa, crnica, de evolucin lenta, generalmente se localiza en miembros inferiores. Se caracteriza por la formacin de ndulos cutneos verrucosos y lesiones ulcerocostrosas que a veces son pedunculadas, dando apariencia de coliflor. Es prevalente en campesinos del sexo masculino, especialmente en los que no protegen sus pies adecuadamente de los traumatismos causados por plantas, en algunas lesiones, el hongo se halla en las escamas, en el pus y los tejidos subcutneos a travs de biopsias. En el examen en fresco de estos productos biolgicos, se observan unas clulas redondeadas de color castao y paredes gruesas, aisladas, o en grupos, llamadas Corpsculos de Meddlar, en ocasiones, estas llamadas clulas fumagoides miden de 6 a 12 micras de dimetro y aparecen divididas transversalmente. Esta micosis es producida por diversos hongos negros, todos pertenecientes al grupo de los Dematiceos, entre los ms conocidos cabe citar al gnero Phialophora, que posee una sola especie patgena: P. verrucosa, caracterizada por la produccin de filides en forma de botella que producen esporas en su interior, las cuales son expulsadas por el cuello de la filide, aparentando un florero Cladosporium carrionil.- nica especie considerada patgena, se identifica porque slo puede esporular en forma de cladosporio, es decir, cadenas de conidias acroptalas de longitud moderada.

23

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

El gnero Fonsecae comprende a las especies siguientes: F. pedrosoi, F. compacta, F, dermatitidis, especialmente F. pedrosoi esporula de tres maneras diferentes: acrotecas, cladosporios y por filides. Acroteca.- Se caracteriza por la produccin de conidiforos semejantes a clavas, de donde nacen las conidias en la punta y a los lados. Objetivo. Familiarizar al alumno con el manejo y conocimiento macro y microscpico de las cepas como agentes etiolgicos de la esporotricosis y cromomicosis. Tcnicas a emplear. A).- Tcnica de observacin directa o en fresco. B).- Tcnica de microcultivo (cepas tipo). Material a emplear. 1.- Placas para microcultivo. 2.- Placas con agar Saboraud seccionadas en cuadros. 3.- Glicerol estril al 10%. 4.- Formol al 10%. 5.- Pipetas estriles. 6.- Colorante azul de algodn. 7.- Cepas proporcionadas por el profesor. 8.- Porta y cubre objetos. Desarrollo de la prctica. 1.- Sembrar microcultivo con las cepas tipo. 2.- Hacer preparaciones directas a partir de las cepas tipo (es recomendable no usar colorante para que se observe el tipo de micelio en el caso de los hongos dematiceos). 3.- Hacer la descripcin macroscpica de las cepas tipo. Dibujos. a.- Sporothrix schenkii. b.- Phialophora verrucosa. c.- Fonsecae pedrosoi. d.- Cladosporium carrionii. Descripcin macroscpica de las cepas tipo.

24

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Cuestionario 1.- Cules son las micosis subcutneas mas frecuentes en Mxico? 2.-Mencione los gneros que pertenecen al grupo de los Demateaceos 3.- Los Demateaceos, cmo se observan al microscopio en su fase de levadura? 4.-La morfologa macroscpica de un Demateaceo en general cmo es? 5.-Mencione el tipo de esporulacin de cada uno de los Demateaceos

25

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 10. CRIPTOCOCOSIS (MICOSIS OPORTUNISTAS) Introduccin. La criptococosis es una micosis oportunista que afecta primariamente a pulmones, producindose una enfermedad que generalmente cursa en forma asintomtica, pudiendo diseminarse a cualquier rgano de la economa, particularmente a meninges y sistema nervioso central, donde produce meningitis subaguda o crnica. El hongo fue aislado por primera vez por Emmons del excremento y nidos de palomas; Sanfelice lo aisl del zumo de frutas. El diagnstico de laboratorio se hace en base a los productos biolgicos como esputo y lquido cefalorraqudeo, el hongo se manifiesta en el producto de la lesin como un organismo en forma de levadura con pared gruesa y en gemacin, de 5 a 20 micras de dimetro, rodeado por una cpsula ancha, refrctil. Deben cultivarse todos los materiales en agar sangre a 37C y en agar Saboraud a temperatura ambiente, puede aadirse cloranfenicol al medio para evitar la presencia de bacterias en las muestras, pero nunca cicloheximida, dada la sensibilidad de Criptococcus neoformas a la misma. Sobre agar glucosa Saboraud a temperatura ambiente, el organismo crece con lentitud, produciendo colonias en forma de levadura que al principio pueden ser blancas, rugosas y granulosas. En las preparaciones macroscpicas se comprueba la presencia de organismos y clulas en gemacin con tubos germinales, en la etapa de crecimiento no se advierte cpsula, la colonia se desarrolla a 37C sobre agar Saboraud con apariencia mucoide, viscosa, de color crema a pardo, en su morfologa se observan levaduras encapsuladas al teir con tinta china. Objetivo. Familiarizar al alumno con la bsqueda de la fase parasitaria del hongo a travs de la tincin con tinta china y que a la vez conozca la morfologa colonial macroscpica del agente etiolgico. Tcnicas a emplear. A).- Obtencin de esputo. B).- Concentracin de esputo. C).- Obtencin de Lquido Cefalorraqudeo ( es preferible que esta muestra sea obtenida por un profesionista experto en la obtencin de dicho lquido ). CONCENTRACIN DEL LQUIDO CEFALORRAQUDEO. 1.- Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 20 minutos.

26

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

2.- Con pipeta Pasteur estril separar cuidadosamente el sobrenadante y pasarlo a un tubo estril. 3.- Utilizar el sedimento para las pruebas diagnsticas de rutina. TINCIN NEGATIVA (con tinta china) 1.- En un porta objetos poner una gota de tinta china. 2.- Con una asa bacteriolgica poner una o dos asadas del sedimento (ya sea esputo o LCR) 3.- Poner un cubre objetos tratando de no formar burbujas de aire. 4.- Montar la muestra y observar al microscopio a seco dbil y seco fuerte, tratando de hallar la fase parasitaria del hongo. Material a emplear. 1.- Frascos de boca ancha estriles. 2.- Tinta china. 3.- Asa bacteriolgica. 4.- Porta y cubre objeto. 5.- Pepsina al 1%. Desarrollo de la prctica. 1.- Obtener muestras patolgicas y concentrarlas siguiendo las tcnicas ya descritas. 2.- Hacer preparaciones en fresco con la tinta china. 3.- Buscar la fase parasitaria de C neoformans en las preparaciones con tinta china. 4.- Observar las caractersticas coloniales de C. neoformans en agar Saboraud. Dibujos. a.- Criptococcus neoformans. Descripcin macroscpica de las cepas tipo. Cuestionario 1.- Qu estructura es caracterstica de Criptococcus neoformans? 2.- Qu tcnica de coloracin se utiliza para observar al agente etiolgico de la Criptococosis? 3.- Cules son los cuadros clnicos mas graves que puede ocasionar este hongo? 4.- Qu tipo de muestras se pueden utilizar en el diagnostico de una Criptococosis? 5.- A qu antibitico es sensible Criptococcus neoformans?

27

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 11. CANDIDIASIS (MICOSIS OPORTUNISTA) Introduccin. La Candidiasis, por los diversos cuadros clnicos que presenta, puede causar desde una micosis superficial, una subcutnea, hasta una profunda o bien comportarse como oportunista. Candida albicans puede causar infeccin aguda o subaguda, produciendo lesiones en boca, vagina, piel, uas, bronquios, pulmones y ocasionalmente, septicemia, endocarditis o meningitis. Como pueden aislarse cepas patgenas de Candida albicans en piel normal, mucosa oral y vaginal normales y en la materia fecal de individuos sanos, salta a la vista que la mayor parte de las infecciones tienen un origen endgeno y la determinacin de la fuente de infeccin constituye un problema tan difcil como en el caso de infecciones de Staphylococcus aureus. La presencia de Candida en el individuo normal explica la diseminacin durante las enfermedades debilitantes, padecimientos malignos del sistema hamatopoytico, diabetes, lupus eritemetoso, enfermedades granulomatosas, etc... La Candidiasis ataca a personas de todas las edades y razas y en ambos sexos, habindose reconocido ciertos factores predisponentes. Los antibiticos de amplio espectro y las drogas citotxicas favorecen la infeccin por Candida albicans y otras especies de Candida. Actualmente, Candida albicans y Candida stellatoidea son los agentes etiolgicos que se presentan con mayor frecuencias es casos de candidiasis, pero existen otras especies tambin capaces de producir enfermedad en el hombre: Candida krusei; Candida tropicalis; Candida guillemondii; Candida pseudotropicalis; Candida parakrusei. Objetivo. El alumno ser capaz de seleccionar las tcticas de trabajo que lo lleven a la identificacin de Candida albicans a partir de diversos especmenes clnicos. Tcnicas a emplear. A).- Tomar de exudados farngeos. 1.- El paciente debe presentarse si haber tomado alimentos, con aseo bucal hecho al menos 12 horas antes de tomar la muestra. 2.- Se coloca al paciente sentado en posicin odontolgica. Auxiliarse con una lmpara adecuada para visualizar perfectamente la cavidad oral. 3.- Mediante un abatelenguas estril sujetar la lengua e introducir un hisopo estril, raspando con la punta del algodn las partes ms afectadas de las amgdalas, sin tocar vula. 4.- Repetir la operacin con otro hisopo estril. 5.- Se colocan los hisopos dentro de un tubo con solucin salina estril.

28

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

B).- Toma de exudados vaginales. 1.- La paciente debe presentarse sin aseo o aplicacin de medicamentos vaginales por lo menos 24 horas antes de la toma de la muestra y sin estar mestruando, a menos que sea estrictamente necesario. 2.- Se coloca a la paciente en posicin ginecolgica y se introduce en la vagina un espejo vaginal en posicin paralela a los labios; se debe ir rotando el espejo con mucho cuidado hasta tenerlo en posicin horizontal. Se localiza con cuidado el cuello y se fija el espejo (de preferencia evitar el uso de sustancias lubricantes). 3.- Se toma la muestra con dos hisopos estriles del sitio donde se localice la lesin (de preferencia del fondo del saco y cuello de la matriz). 4.- Uno de los hisopos se rota sobre un porta objetos, para tincin de Gram. 5.- Se introducen los dos hisopos en un tubo con solucin salina isotnica. C).- Tcnica de siembra por punto en tubo y placa. En el caso de que la muestra sea de escamas o raspado de uas. D).- Tcnica de observacin en fresco con KOH o NaOH. Tincin de Gram. 1.- Fijar el frote por calor. 2.- Cubrir el porta objetos con cristal violeta por un minuto. 3.- Lavar con agua corriente. 4.- Cubrir la preparacin con lugol durante un minuto. 5.- Lavar con agua corriente. 6.- Decolorar con solucin alcohol-cetona. 7.- lavar con agua corriente. 8.- Contrastar con safranina por 30 segundos. 9.- Lavar con agua corriente. 10.- Examinar al microscopio con aceite de inmersin. Aislamiento por estra cruzada 1.- Depositar suavemente el inculo del hisopo rotndolo sobre la superficie del medio de cultivo, en la zona perifrica de uno de los sectores de la placa. 2.- Extenderlo con el asa bacteriolgica (prevenir flameada y enfriada en el medio), sin separarla de la superficie del medio: dibujar de 4 a 5 trozos en zig-zag continuo y separado. 3.- Quemar el asa y enfriar dentro del medio. 4.- Repetir la operacin anterior cuidando de tocar solamente los extremos de las ltimas estras. 5.- La siguiente estra se lleva hasta el centro del medio sin tocar en ningn momento las estras de los otros sectores.

29

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Identificacin rpida de Candida albicans. A).- Tubo germinativo en suero. 1.- Inocular una pequea cantidad de clulas en 0.5 ml del suero (de preferencia de pacientes diabticos). 2.- Incubar a 37C en agitacin durante 30 a 60 minutos o en condiciones estacionarias durante 2 horas. 3.- Montar entre portada y cubre objetos una gota de la suspensin y observar al microscopio a seco dbil y seco fuerte. B).- Produccin de clamidosporas (Tcnica de Dalmov) 1.- Marcar en dos partes iguales el reverso de las placas de Petri con medio Oxgall y Clamidosporas o bien Harina de Maz. 2.- En uno de los sectores de cada medio, descargar el inculo de la cepa problema, trazando un zig-zag abierto con el asa, procurando no sobrepasar la superficie de 2 cm cuadrados. 3.- Flamear el asa y repasar la estra en sentido contrario. 4.- Flamear el cubre objetos y colocarlo sobre la siembra, presionndolo ligeramente con el extremo contrario del asa. 5.- Repetir la misma operacin en el sector contrario y con cepa testigo. 6.- Incubar las placas a 28C durante 48 a 96 horas. 7.- Destapar las placas y observar al microscopio directamente sobre el agar y cubre objetos a seco dbil y seco fuerte. De la cepa problema hacer una suspensin en solucin salina estril para sembrar los medios para la fermentacin y asimilacin de carbohidratos. Zimograma: 1.- Utilizar una serie de tubos de hemlisis conteniendo cada uno 4 ml de medio base de Wickerham y 1 ml de los azcares a probar al 6%. Adicionar una campana de Durham como indicador de la produccin de gas. 2.- Inocularlos con dos gotas de la suspensin. 3.- Incubar a 28C durante 72 horas. 4.- Hacer las lecturas de produccin de cido y gas. Auxonograma. 1.- Utilizar una serie de tubos de 16 x 150 mm con tapn de rosca, conteniendo cada uno 4.5 ml del medio base y 0.5 ml de los azcares a probar al 5%. 2.- Inocular con dos gotas de la suspensin. 3.- Incubar a 28C y observar el crecimiento cada 48 horas. Material a emplear. 1.- Cepa del gnero Candida ( Candida albicans ). 2.- Exudado farngeo.

30

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

3.- Exudado vaginal. 4.- Suero humano. 5.- Placas Petri con: - Gelosa sangre. - Saboraud dextrosa. - Clamidospora. - Oxgall y Biggy. 6.- Tubos de medio de: - Saboraud inclinado. - Micobiotico inclinado. 7.- Medio base de Wickerham. 8.- Medio base para asimilacin de carbohidratos. 9.- Solucin salina estril. 10.- Abate lenguas e hisopos estriles. 11.- Pipetas Pasteur estriles. 12.- Equipo de tincin de Gram. 13.- NaOH o KOH al 10%. 14.- Preparacines fijas. Desarrollo de la prctica. 1.- Proceder a la toma del exudado farngeo. 2.- Trabajarlo simultneamente con las muestras proporcionadas por el profesor ( exudado vaginal y/o uas o escamas ), siguiendo la metodologa para el diagnstico de Candida. 3.- Identificar hasta especie las levaduras aisladas de las muestras problema. 4.- Observar la morfologa parasitaria de Candida albicans en preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. Dibujos. a.- Observacin en fresco de exudado farngeo. b.- Observacin en fresco de exudado vaginal. c.- Frote de exudado farngeo. Tincin de Gram. d.- Frote exudado vaginal. Tincin de Gram. Cuestionario 1.-Aparte de Candida albicans, qu otras especies existen? 2.-Cules son los cuadros clnicos que con mayor frecuencia produce Candida albicans? 3.-Para la produccin de Clamidosporas, en qu medio de cultivo se debe hacer crecer a Candida? 4.-En una tincin de Gram, cmo se observa a este agente etiolgico? 5.- Qu pruebas de laboratorio se utilizan para determinar la especie de este hongo?

31

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 12. GEOTRICOSIS (MICOSIS OPORTUNISTAS) Introduccin. La Geotricosis es una micosis oportunista causada por un hongo levaduriforme denominado Geotrichum candidum, afecta pulmones, intestinos y raramente boca y piel, es una enfermedad cosmopolita . Es un hongo ubicuo que se ha aislado de diversas partes como son : tierra, detritus vegetales, tomates, diferentes frutas sobre todo citricos, del medio ambiente, inclusive es utilizado en la maduracin de algunos quesos blandos. En la actualidad se considera como parte de la flora de diversas partes del cuerpo, sobre todo de mucosas. La va de entrada puede ser endogena debido a que el hongo integra parte de la flora normal sobretodo a nivel de intestinos y boca, exgena a partir del medio ambiente , su entrada es por aspiracin de esporas del hongo. El sexo y la edad no influyen en la enfermedad aunque la mayora de casos se presentan en adultos, no es considerada enfermedad ocupacional pero en individuos que trabajan en la fabricacin de quesos blandos estan ms expuestos a aspirar grandes cantidades de esporas. Como factores predisponentes ms importantes tiene postuberculosis, diabetes, linfomas, leucemias y terapia inmunosupresora. Objetivo. Familiarizar al alumno con la bsqueda de la fase parasitaria del hongo a travs del examen en fresco y que a la vez conozca la morfologa colonial macroscpica del agente etiolgico. Tcnicas a emplear. A).- Obtencin de espectoracin, escamas, exudados B).- Realizar examen directo empleando KOH al 10% C).- Cultivo en Agar Saboraud o Agar Papa Dextrosa de 2 a 5 dias a 28C Material a emplear. 1.- Frascos de boca ancha estriles, placas Petri esteriles, medio de transporte 2.- KOH al 10%. 3.- Asa micologica. 4.- Porta y cubre objeto. 5.- Agar Saboraud y/o Agar Papa Dextrosa.

32

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Desarrollo de la prctica. 1.- Obtener muestras patolgicas siguiendo las tcnicas ya descritas. 2.- Hacer preparaciones en fresco con KOH AL 10%. 3.- Buscar la fase parasitaria de Geotrichum candidum 4.- Observar las caractersticas coloniales de Geotrichum candidum en el agar correspondiente. Dibujos. a.- Geotrichum candidum. Descripcin macroscpica de las cepas tipo. Cuestionario 1.- Qu estructura es caracterstica de Geotrichum candidum? 2.- Qu tcnica de coloracin se utiliza para observar al agente etiolgico de la Geotricosis? 3.- Cules son los cuadros clnicos mas graves que puede ocasionar este hongo? 4.- Qu tipo de muestras se pueden utilizar en el diagnostico de una Geotricosis? 5.- A qu antifungico es sensible Geotrichum candidum?

33

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 13. ASPERGILOSIS (MICOSIS OPORTUNISTAS) Introduccin. La Aspergilosis es micosis de animales y seres humanos causadas por hongos oportunistas del gnero Apergillus en especial A. fumigatus, A. niger y A. flavus.

Pueden dar enfermedad pulmonar alrgica o invasora, aspergiloma, diseminarse a sistema nervioso central u otros rganos o localizarse, en inmunodeprimidos es sistemica y letal. Es una enfermedad cosmopolita y rara que afecta a cualquier edad , raza o sexo, predomina en varones adultos, los aspergilomas se ha observado en tuberculosos curados.
Las formas alergicas parecen ms frecuentes en campesinos y en quienes trabajan con granos, como los empleados de silos y molinos. Como factores predisponentes estan el uso de antibiticos de amplio espectro, citotxicos y glucocorticoides, leucemia, transplantes de rganos en especial mdula sea, infecciones por citomegalovirus, no suele observarse en pacientes con SIDA. En aves como pavos y pollos hay epidemias de aspergilosis de vas respiratorias por consumo de granos contaminados, en bovinos y ovinos ocasionan abortos

Objetivo. Familiarizar al alumno con la bsqueda de la fase parasitaria del hongo a travs del examen en fresco y que a la vez conozca la morfologa colonial macroscpica del agente etiolgico. Tcnicas a emplear. A).- Obtencin de espectoracin, escamas, exudados, raspado de uas B).- Realizar examen directo empleando KOH al 10% o SSI C).- Cultivo en Agar Saboraud o Agar Papa Dextrosa de 1 a 3 dias a 28C Material a emplear. 1.- Frascos de boca ancha estriles, placas Petri esteriles, medio de transporte 2.- KOH al 10%. 3.- Asa micologica, lancetas estriles 4.- Porta y cubre objeto. 5.- Agar Saboraud y/o Agar Papa Dextrosa. Desarrollo de la prctica. 1.- Obtener muestras patolgicas siguiendo las tcnicas ya descritas.

34

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

2.- Hacer preparaciones en fresco con KOH AL 10% o SSI. 3.- Buscar la fase parasitaria de las especies de Aspergillus 4.- Observar las caractersticas coloniales de las especies de Aspergillus en el agar correspondiente. Dibujos. a.- Especies de Aspergillus. Descripcin macroscpica de cada una de las cepas tipo. Cuestionario 1.- Qu estructura es caracterstica de las especies de Aspergillus? 2.- Qu tcnica de coloracin se utiliza para observar a los agentes etiolgicos de la Aspergilosis? 3.- Cules son los cuadros clnicos mas graves que puede ocasionar las diferentes especies de este hongo? 4.- Qu tipo de muestras se pueden utilizar en el diagnostico de una Aspergilosis? 5.- A qu antifungico son sensibles las diferentes especies de Aspergillus?

35

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 14. BLASTOMICOSIS Y PARACOCCIDIODOMICOSIS (MICOSIS PROFUNDAS) Introduccin. Blastomicosis.- Es una infeccin crnica producida por Blastomyces dermatitidis. Se caracteriza por la formacin de lesiones granulomatosas y supuradas en cualquier parte del cuerpo, pero de preferencia en pulmones, piel y huesos. Se cree que su fuente de infeccin es el suelo, aunque no se ha recuperado de este sustrato. Ha sido descrita en pacientes desde dos meses hasta 80 aos de edad, presentndose con mayor frecuencia en hombres que en mujeres. El material biolgico til para examinar como producto de la lesin local puede ser de escamas o pus y cuando se sospeche de infecciones generalizadas, deben examinarse el esputo, la orina y el lquido cefalorraqudeo. Se aconseja el uso de NaOH o KOH del 5 al 10% para el estudio en fresco del producto biolgico. Blastomyces dermatitidis se observa en estas preparaciones en forma de clulas esfricas de 8 a 15 micras de dimetro provistas de pared gruesa y refrctil. La yema se adhiere en forma caracterstica a la clula progenitora por un tabique ancho. En agar glucosa Saboraud a temperatura ambiente, predomina la fase micelial del hongo, con desarrollo final de una colonia area, blanca y algodonosa que toma color pardo con la edad. Sin embargo, cuando se cultivan por primera vez del material infectado, tienden a persistir colonias del tipo levaduriforme durante u lapso breve, durante el cual la colonia se cubre de micelio blanquecino, dejando apariencia de Geotrichum. A partir de la superficie surgen prolongaciones filamentosas que permiten explicar la llamada "etapa espinosa" del crecimiento; ms tarde la superficie en su totalidad se cubre de micelio areo blanco. Paracoccidiodomicosis.- Es una micosis crnica severa caracterizada por lesiones pulmonares primarias de donde disemina ampliamente a vsceras, ganglios linfticos, mucosa oral, nasal y rectal, as como la piel. Con frecuencia produce grandes lesiones destructivas e inclusive la muerte. La fuente de infeccin se considera el suelo principalmente y algunos materiales vegetales. Su incidencia es mayor entre los 30 y 0 aos, predominando en el sexo masculino, el diagnstico se basa en la observacin de levaduras multigemantes en los productos patolgicos. Los materiales infectados ( pus, productos de raspado o biopsias de ganglios ) deben cultivarse sobre placas de agar sangre a 37C y en tubos con agar inclinado de Saboraud a temperatura ambiente. Procede conservar los cultivos cuando menos cuatro semanas antes de descartarlos, ya que el hongo crece lentamente durante su aislamiento primario en agar sangre a 37C y forma colonias de tipo levadura lisa o cerebriforme. Por examen microscpico, dichas colonias estn compuestas por clulas levaduriformes con gemacin mltiple. En agar glucosa Saboraud a la temperatura ambiente desarrolla la fase micelial del hongo como una colonia rugosa y membranosa, exuberante, de crecimiento lento y con micelio areo blanco provisto de vellosidades cortas que tienden a tomarse pardo con la edad. Por examen microscpico pueden verse algunos cocidios ssiles, ovales o

36

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

redondeados parecidos a los vistos en cultivos de Blastomyces dermatitidis conservados solo a temperatura ambiente. Objetivo. Familiarizar al alumno con el estudio de la fase parasitaria de los hongos a partir de muestras biolgicas, as como con el conocimiento de la morfologa colonial macroscpica. Tcnicas a emplear. A).-Obtencin de esputo. 1.- Proporcionar al paciente un recipiente estril de boca ancha. 2.- Recoger la primera expectoracin de la maana evitando que sea solamente saliva o moco nasofarngeo. 3.- Ayudar al enfermo a toser y expectorar puede usarse propilenglicol o solucin salina isotnica o hipertnica. NOTA: La muestra se puede refrigerar despus de colectada adicionando carbonato de sodio, lo que ayuda a suprimir contaminantes y a reducir el mal olor. B).- Digestin y concentracin de esputos y lavados bronquiales. 1.- A 20.0 ml de esputo aadir 10 ml de pepsina al 1%. 2.- Incubar a 37C durante 2 horas. 3.- centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos. 4.- Decantar el sobrenadante y utilizar el sedimento para las pruebas de diagnstico. C).- Obtencin de lquido drenante de abscesos fistulosos. 1.- Con el borde de una lanceta para grupos sanguneos, levantar las costras de las lesiones. 2.- Presionar el tejido y aspirar con una jeringa o pipeta Pasteur estril el lquido suerosanguinolento. 3.- Depositar la muestra en tubos estriles para efectuar el diagnstico. Material a emplear. 1.- Frascos de boca ancha estriles. 2.- Pepsina al 1%. 3.- Lancetas para grupos sanguneos. 4.- Jeringas estriles. 5.- Tubos estriles. Desarrollo de la prctica. 1.- Efectuar la concentracin del esputo. 2.- Realizar una preparacin en fresco con una asada del esputo concentrado y observarla al microscopio tratando de buscar la fase parasitaria del hongo.

37

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

3.- Hacer la descripcin macroscpica de las cepas de hongos causantes de la blastomicosis y paracoccidiodomicosis. Dibujos. a.- Fase parasitaria de Blastomyces dermatitidis. b.- Fase parasitaria de Paracoccidiodes brasiliensis. Descripcin macroscpica de las cepas tipo. Cuestionario 1.-Cules son los cuadros clnicos mas representativos de una Paracoccidiodomicosis? 2.-Cmo se observa a Paracoccidiodes brasiliensis en una preparacin en fresco? 3.-Cmo es el crecimiento de Paracoccidiodes brasiliensis en Agar Glucosa Saboraud? 4.-Cmo son las lesiones causadas por Blastomyces dermatitidis? 5.-Qu material biolgico se utiliza para detectar una Blastomicosis?

38

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 15. Accin fungicida de los imidazoles empleados en el tratamiento de micosis

Introduccin. La terapia contra los hongos ha estado presente desde que se tiene conciencia de las micosis, algunos tratamientos han perdurado a travs del tiempo, por su efectividad, escasos efectos colaterales y bajo costo, tal es es el caso de la solucin yodada. Con el advenimiento de la griseofulvina como primer antimictico oral se desencaden la bsqueda de nuevos productos propios del metabolismo antagnico de hongos as se obtuvo a finales de la dcada de los 50s la nistatina y anfotericina B, si bien es cierto que estos antifungicos tienen gran efectividad y amplio espectro, presentan muchos efectos colaterales y su absorcin es deficiente. Los imidazoles son derivados del ncleo imidazol , todos ellos tienen un mecanismo de accin similar, son fungistaticos e inhiben la formacin de la membrana celular, interrupiendo la sntesis de ergosterol, dando paso a lanosterol y como consecuencia dejan una membrana celular defectuosa. La mayora se utilizan en forma de cremas y soluciones a concentraciones de 1-2% tienen un espectro amplio son efectivos para la mayora de los agentes etiologicos . En general son frmacos bien tolerados por la piel y pocas veces provocan sensibilizacin drmica los ms comunes son : Clotrimazol, Isoconazol, Miconazol, Ketoconazol, Sulconazol, Bifonazol, Oxiconazol, Tioconazol, Econazol Objetivo. Determinar la accin de los diferentes agentes antimicticos contra hongos causantes de las micosis ms frecuentes. Tcnicas a emplear. A).- Preparacin de placas Petri con em medio de cultivo seleccionado B).- Preparacin de los diferentes imidazoles a las concentraciones a probar C).- Purificar las cepas de hongos causantes de micosis Material a emplear. 1.- Placas Petri 2.- Agar Saboraud y/o Agar Papa Dextrosa. 3.- Asa micologica 4.- Clotrimazol, Isoconazol, Miconazol, Ketoconazol, Sulconazol, Bifonazol, Oxiconazol, Tioconazol, Econazol 5.- Cepas a probar

39

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Desarrollo de la prctica. 1.- Previamente las placas fueron preparadas con una mezcla entre los antimicticos y el agar correspondiente 2.- Sembrar las diferentes cepas a probar en las cajas Petri con la mezcla previa 3.- Deberan prepararse 2 placas por cada una de las cepas, una solo con agar, la segunda con agar y el imidazol 4.- Los imidazoles debern encontrarse a una concentracin conocida, la primera placa ser la relacin del imidazol con el agar correspondiente de uno a uno, la segunda sin ninguna concentracin del agente 5.- Diariamente por aproximadamente una semana ser medido el crecimiento radial de cada una de las placas, para poder llevar as un control de crecimiento Reporte. Todas las mediciones sern graficadas para denotar la relacin de crecimiento entre estas, para poder identificar as el mejor imidazol

Cuestionario 1.- Defina que es un imidazol 2.- De los imidazoles conocidos cual o cuales son los ms efectivos 3.- Que imidazoles presentan una elevada toxicidad 4.- Que otros antimicoticos se conocen 5.- Los hongos pueden crear resistencia a los imidazoles y a otros antimicoticos

40

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

Prctica No. 16. EVALUACION

A los alumnos se les evaluara al trmino de la realizacin de todas las prcticas de la siguiente manera : 1.- Identificacin macroscopica de hongos trabajados durante las prcticas 2.- Identificacin microscopica de hongos y estructuras fungicas observadas durante el desarrollo de la prctica 3.- Examen teorico con preguntas del cuestionario de cada prctica realizada 4.- Revisin de Manual de prcticas

41

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

BIBLIOGRAFIA BASICA 1.- Segretain,G., E.Drouhet y F.Mariat. 1995. Diagnstico de Laboratorio en Micologa Mdica. 7 reimpresin. Traduccin de Ernesto Macotela Ruiz. La prensa Mdica Mexicana. Mxico. 2.- Conant, N.F., D. Trillerson smith, R. Denia Baker, J. Lamar. 1994. Micologa. Nueva Editorial Interamericana. 3.- Velasco, C.O., J.Tay Zavala. 1995. Introduccin a la Micologa Mdica. Ed. Francisco Mndez Cervantes. 4.- Clayton, Y.M., G.Garoth, R.J.Hay, A. Lagni, P.Vanbreuseghem. 1994. Biomedical topics. Micosis Superficiales. Ed. Centro de Publicaciones Cientficas. Farmitalia Carlo Erba. Milano, Italia. 5.- Ramrez Cueto, M.A. Manual de Laboratorio de Micologa. Facultad de Ciencias Qumicas, Departamento DE Microbiologa. BUAP. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA 1.-Arenas, R. Micologa Mdica. 2 Ed; Ed. Interamericana. (1993) 2.-Bonifaz, A. Micologa Mdica Bsica. 4 Ed; Ed. Mndez Cervantes. (1997) 3.-Koneman. Diagnostico Microbiolgico. 3 Ed; Ed. Panamericana. (1996) 4.-Murray, P.R. Microbiologa Mdica. 2 Ed; Ed.Harcourt-Brace. (1997) 5.-Torres, R.J. Micologa Mdica. 4 Ed; Ed. MASSON. (1995) 6.-Torres, R.J. Micosis que afectan piel y mucosas. 3 Ed; Ed. DOYMA. (1996) 7.- Zapater, R.C. Micologa Mdica. 6 Ed; Ed. El Ateneo. (1996)

42

Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICOLOGA Q.F.B

43