OBSERVACION DE BACTERIAS Y LA TINCION GRAM OBJETIVOS

Diferenciar bacterias basndose en las diferencias estructurales de sus paredes celulares. Utilizar la tincin GRAM como mtodo para diferenciar las bacterias grampositivas y Gramnegativas.

FUNDAMENTO TEORICO
La tincin de Gram es una prueba rpida, potente y sencilla que permite distinguir entre dos clases fundamentales de bacterias :grampositivas y gramnegativas. Las bacterias se fijan con calor o se dejan secar sobre el porta, se tien con cristal violeta , que es un colorante que se precipita con yodo , y despus se elimina el exceso de colorante lavando el porta con un decolorante cuya base puede ser alcohol o acetona y agua. Se aade despus otro colarante, safranina, para que sirva de contraste y tia las clulas decoloradas. El proceso toma unos pocos minutos . Con este metodo, las bacterias grampositivas se tien de violeta porque el colorante queda atrapado en la gruesa capa de peptidoglucanos de la pared celular a modo de malla entrelazada. Las bacterias gramnegativas en cambio tiene una capa de pptidoglucano mas delgada e incapaz de retener el cristal violeta , de modo que estas clulas adoptan el color de la safranina (rojo )empleada en el ultimo paso del mtodo.

PROCEDIMIENTO Materiales
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Cultivos bacterianos de seudomona staphylococus y eschriricha coli Asa de siembra(asa de kolle) Pinzas para laminas Mechero Alcohol Aceite de inmersin Papel tissue COLORANTES Cristal violeta : colorante bsico Lugol : mordiente Alcohol acetona : agente decolorante Safranina(fucsina): colorante de contraste

Metodo de tincin
Ubicacin de la muestra sobre el porta : Se coloco una pequea gota de agua destilada en el porta. Luego con el asa de siembra se transfiri una pequea cantidad de la superficie del cultivo bacteriano en medio solido a la gota (se tuvo cuidado de no tomar agar, el cual sirve como sustrato del cultivo). Se removi la mezcla con el asa hasta que se formo una suspensin homognea. Luego se procedi a evaporar el agua del porta para que las bacterias queden adheridas al porta, utilizando el mechero de manera muy leve para no producir la lisis de la bacteria.

En el siguiente paso se prosigui a realizar la tincin con los colorantes en el sgte orden y con los sgtes tiempos de exposicin : Cristal violeta : 1 min Lugol : 20s Alcohol acetona : 10s Safranina(fucsina): 15-20s

Despus de la coloracion se enjuago con agua Se seco la muestra con papel tissue , teniendo en cuenta que las bacterias ya haban quedado adheridas al porta.

Y por ultimo se paso a observar las muestras en el microscopio . En este paso se agrego primero una gota de aceite de inmersin sobre la muestra para evitar la presencia de aire entre la muestra y el lente del microscopio.

OBSERVACIONES
Despus de llevar a cabo el procedimiento descrito en la seccin anterior se procedi a observar las muestras en el microscopio: L a primera muestra correspondiente a la pseudomona presentaba un color rojo violeta .Este color era mas apreciable en la parte externa de la muestra ya que en la parte central se observaba una mancha violeta en la que no se podan distinguir las unidades bacterianas debido al exceso de colorante (color violeta) o falta de exposicin al limpiador. En la zona exterior sin embargo ,que haba recibido las cantidades adecuadas de los colorantes, si se notaban unidades en forma de bastones rectos teidos de color rojo rosado o rojo violeta que adems se encontraban normalmente en parejas o en grupos alineados. Lo observado era similar a esta imagen :

En la segunda muestra correspondiente al staphylococus se observaron unidades en su mayora en forma de bastones y algunos cocos. Esta vez estaban todos teidos de un color azul violeta . Lo observado era similar a esta imagen : pero con la diferencia que en su mayora las unidades tenan forma de bastones .

Tambien se preparo una tercera muestra , que supuestamente tenia escherichia coli , en la que se observaron unidades en forma de bastones teidos de azul (ver dicusion en sgte seccin).

RESULTADOS Y DISCUSION
Las observaciones de la primera muestra me permiten decir que la seudomona es una bacteria gramnegativa debido a que adopta el color rojo de la safranina y no el violeta del cristal violeta. Esto esta de acuerdo con la clasificacin de la seudomona , ademas tambin la forma de la bacteria que se observo en el microscopio (bastones) corresponde a la forma de bacilos que la bibliografa describe acerca de la seudomona. De la segunda muestra se puede decir que contena bacterias grampositivas ya que el color de la unidades era azul violeta que se produce en estos casos por la absorcin del cristal violeta en la pared celular de las bacteria grampositivas . Este resultado esta de acuerdo con el hecho de que la muestra era de staphylococus , sin embargo lo que era extrao es que las unidades observadas tenan forma de bastones en vez de cocos como se esperaba . Esto se podra haber debido a que el sustrato sobre el que se cultivo el staphylococus favoreci que los cocos adopten la forma de bacilos . Por ultimo , lo observado en la tercera muestra nos dice que estaba hecha de bacterias grampositivas (debido al color azul violeta que tenan ) esto contradice el hecho de que nominalmente la muestra era de escheiricha coli . Esta observacin se podra haber debido al excesivo uso de colorante cristal violeta y a los cortos tiempos de exposicin al limpiador y a la safranina, esto podra haber hecho que la bacteria gramnegativa escheiricha coli luzca como una bacteria grampositiva despus de la tincin. Otra explicacin a esta observacin seria que la muestra no contena escheiricha coli sino nuevamente staphylococus (en forma de bastones como en la muestra 2) la cual si es una bacteria grampositiva.

CONCLUSIONES
El mtodo de tincin Gram permite concluir lo sgte. La primera muestra corresponde a la bacteria gramnegativa pseudomona . Las bacterias gramnegativas se tien de color rojo. La segunda muestra corresponde a la bacteria grampositiva staphylococus aureus(aunque con forma de bacilos). Las bacterias grampositivas se tien de color azul. Deben utilizarse las cantidades y tiempos adecuados en la aplicacin de los colorantes para evitar un error en el reconocimiento de las bacterias (como posiblemente pas en la muestra 3).