Clonagem de DNA

CLONAGEM DE DNA
CLONAGEM: multiplicar assexuadamente.
Na Biologia Molecular, significa mais especificamente crescer uma colnia de bactrias a partir de uma clula nica. Clonagem de genes essencialmente o processo de amplificar seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactria e clonando a bactria.

Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram mostrados no incio da dcada de 1970.

Avanos conceituais e tecnolgicos que contriburam para a tcnica de clonagem: Na dcada de 60: identificao de pequenas molculas de DNA circular denominadas plasmdeos, que carregam genes de resistncia bacteriana a antibiticos. No final da dcada de 60: descoberta e caracterizao de endonucleases

de restrio (Werner Arber, Hamilton Smith, Daniel Nathans; H. Smith e T.

Kelly) 1967: Gellert - purificao da enzima DNA ligase 1972: Janet Mertz e Ronald Davis usaram DNA ligase para juntar fragmentos digeridos com Eco RI. 1972: o grupo de Paul Berg conseguiu inserir genes do bacteriofago l e genes de E. coli no genoma do virus SV40, construindo molculas

recombinantes

Por que clonar?

Sequenciamento de DNA Separar fragmentos de DNA em clones independentes Estudar a transcrio e a traduo do gene Fazer estudos de expresso funcional

Sintetizar protenas para produo de anticorpos

Sintetizar protenas para uso teraputico etc, etc

Para clonar necessrio um VETOR

Um vetor de clonagem uma molcula de DNA que tem 3 caractersticas
fundamentais: capaz de replicar independentemente do cromossomo da clula hospedeira. Organismos contendo o vetor devem poder se desenvolver preferencialmente em um dado meio, porque o vetor confere ao organismo alguma propriedade fsica ou qumica, ou ambas, que lhe permite este crescimento preferencial. O vetor aceita a insero de DNA adicional em sua molcula de DNA.

Enzimas de restrio

Enzimas de restrio foram primeiramente identificadas pela sua

capacidade de restringir o crescimento de certas viroses em algumas linhagens de E. Coli. Por isso, foram denominadas

enzimas de restrio.

Essas enzimas fazem parte do mecanismo natural de defesa das

bactrias contra a invaso de DNA estranho.

Stios de reconhecimento para enzimas de restrio so curtas sequncias reconhecidas e clivadas por vrias endonucleases

Bactrias com endonucleases de restrio tambm tm as enzimas

correspondentes que metilam as bases especficas no stio de

reconhecimento, assim o seu prprio DNA fica protegido de autodigesto.

As enzimas de restrio catalizam a quebra da ligao fosfoster (hidrlise) entre o oxignio na posio 3 de uma base, e o fosfato ligado ao oxignio na posio 5 da base seguinte. P P
OH

OH

Corte com extremidades coesivas stick ends 5 pendente ou 3 pendente

Enzimas de restrio

Corte com extremidades rombas blunt ends

A enzima se movimenta ao longo da major groove (difuso linear). Quando a seqncia especfica encontrada, h um notvel rearranjo estrutural, tanto da enzima quanto do DNA. O DNA sofre uma dobra de cerca de 50o no centro do stio de reconhecimento. Mg2+ essencial para a hidrlise e entra no stio cataltico apenas quando a seqncia alvo

encontrada.
Eco RV endonuclease : 5 G - A - T - A - T - C 3 3 C - T - A - T - A - G 5

Fragmentos produzidos pela clivagem dos ~36 kb do DNA genmico de adenovirus 2 com Eco RI e Hind III

GAATTC CTTAAG

AAGCTT TTCGAA

Exemplo de clivagem com enzima de restrio

Algumas endonucleases de restrio e seus stios de reconhecimento

As enzimas so nomeadas com as abreviaes das linhagens de bactrias das quais foram isoladas

As duas enzimas da tcnica de clonagem de DNA: - Enzimas de restrio 1962 - Arber - ENZIMAS DE RESTRIO - DNA ligases 1967 Gellert - DNA LIGASE

Extremidades pendentes menores que 15 nucleotdeos no fornecem

pareamentos estveis na temperatura de 37oC. Para que os diferentes

segmentos de DNA permaneam juntos (o plasmdeo e o DNA que se quer clonar) preciso restabelecer a ligao fosfoester com a LIGASE.

Os vetores de clonagem pertencem a duas classes gerais:

- Plasmdeos - Fagos

Tipos de vetores usados para clonagem

Clonagem de DNA usando plasmdeos

como vetores

Plasmdeos
Pequenas molculas circulares de DNA dupla fita, no incorporadas ao genoma das bactria

So formas autoreplicativas de DNA

Todas as enzimas necessrias para a replicao de um

Plasmdeo so produzidas pela bactria hospedeira,

embora protenas codificadas pelo plasmdeo auxiliem na regulao de sua replicao.

Plasmdeos utilizados para clonagem foram construdos a partir de fragmentos do plasmdeo pBR-322 de E. coli.

Todos os plasmdeos usados como vetor devem ter:

REPLICATOR ou origem de replicao

Marcador de seletividade
Stio de clonagem

Origem de replicao (replicator, replicon): uma sequncia especfica do plasmdeo, com cerca de 1.000 pb, na qual tem incio a replicao do DNA. Neste local h um conjunto de elementos regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero feitas numa nica bactria. No pBR322: replicon pMB1 - h produo de 15 a 20 cpias/clula No pBlue Script: forma mutada do mesmo replicon h produo de 500 a 700 cpias/clula

MARCADOR DE SELETIVIDADE

O marcador de seletividade permite a identificao da bactria que recebeu o plasmdeo. No vetor ao

lado, so genes que

codificam protenas que degradam antibiticos.

Amp: betalactamase
que degrada ampicilina

STIO DE CLONAGEM
O stio de clonagem consiste de uma seqncia de nucleotdeos que corresponde a stios de interao com enzimas de restrio, e que adicionada ao vetor por engenharia gentica. Para clonar, escolhemos uma enzima que corte em um ou dois destes locais. Seqncia polylinker ou multiple-cloning-site (MCS) que inclui uma cpia do stio de reconhecimento para cada uma das 10 enzimas indicadas

Plasmdeo UC19

Ligao de fragmentos de restrio com

extremidades coesivas

As ligases usadas no laboratrio:

T4 DNA ligase: produzida pelo bacteriofago T4 liga tanto extremidades coesivas, como extremidades cegas. DNA ligase de E. Coli: liga apenas extremidades coesivas

Digesto do vetor para clonagem Se a ligao no vetor feita aps a digesto com enzimas de restrio que produzem extremidades cegas (blunt ends), ou se o vetor foi linearizado com apenas uma endonuclease de restrio, necessrio desfosforilar a extremidade 5-P do vetor, para evitar auto-ligao.

Enzima: Fosfatases Removem grupos fosfato da extremidade 5 das moleculas de DNA, substituindo-os por -OH.

Vetor cortado com uma nica enzima que corta no ponto a:

O vetor ficar com as extremidades (a) e (a) que so compatveis. Ao ser adicionada a
ligase, o vetor ser novamente fechado, sem inserto. Para que isso no ocorra, preciso usar fosfatase, que remove o P da extremidade 5

Se duas enzimas distintas forem usadas para

abrir o vetor, as extremidades se tornam incompatveis. Ele no fechado pela ligase.

O DNA a ser inserido deve ser cortado com as mesmas duas

enzimas, para ter extremidades compatveis com o vetor.

Que tipo de fragmento de DNA podemos inserir em um vetor:

O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita. Enzimas de restrio s cortam DNA dupla-fita. O fragmento de DNA pode ser : cDNAs sintetizados as partir de mRNAs Produto de digesto de DNA genmico com endonucleases de restrio Produto de PCR

DNA dupla fita de qualquer origem

Os fragmentos de DNA a serem clonados so

cortados com as
mesmas enzimas utilizadas para linearizar (abrir) o vetor

Aps a obteno do plasmdeo recombinante contendo a sequncia de

interesse, o prximo passo coloc-lo na bactria. Esse processo denominado transformao.

A transformao um processo ineficiente, porm eficiente o bastante para nossos propsitos.

Tipicamente, de 109 clulas em contato com 1 ug de plasmdeo (~ 1011 molculas), apenas aprox. 105 recebero o plasmdeo (1: 106)

Como a probabilidade de uma clula captar um plasmdeo baixa, a

probabilidade de uma clula captar dois ou mais extremamente baixa.

Insero do plasmdeo em bactrias: Choque trmico (bactrias tornadas competentes) Eletroporao (bactrias normais, em meio de baixa fora inica)

Seleo das bactrias transformantes

(marcador de seletividade)

resistncia a antibitico

Seleo das bactrias transformadas com plasmdeos recombinantes: alfa complementao do gene da betagalactosidase
(colnias azuis ou brancas)

Transformao das bactrias

Ao transformar as bactrias, cada uma receber um nico plasmdeo.

Cada clone de bactrias ter um nico plasmdeo.

Assim os fragmentos que antes estavam misturados, agora esto individualizados

Represso removida por IPTG

Lac repressor

O fragmento a da betagalactosidase (LacZ)

codificada pelo plasmdeo.

A insero do DNA a ser clonado interrompe

a sequncia do LacZ.

pUC plasmid- genrico

Fragmento da
betalactamase produzido pela bactria

-complementao

lacZ inteiro () + : Betagalactosidase ativa Cliva X-gal Colnias azuis

Laz segmentado Betagalactosidase inativa

Colnias brancas

Purificao do plasmdeo

Genomic Relaxed

Supercoiled

Quando usar plasmdeos:

So utilizados para clonagem de fragmentos relativamente pequenos (no mximo 20 kb) So de fcil manuseio Existem vrios tipos de plasmdeos comercialmente disponveis, cada um com vantagens e aplicaes especficas:

vetores para sntese de RNA e protenas (vetores de expresso)

vetores com genes reprteres plasmdeos para produo de protenas de fuso

etc

Vetores plasmdeos para transfeco de clulas eucariotos:

So vetores usados para expressar genes clonados em clulas animais ou vegetais. Estes vetores possibilitam a expresso de genes tanto em bactrias como em eucariotos.

- Para replicao em bactrias, carregam um replicon (origem de replicao) bacteriano e um gene de resistncia a antibitico.

- Para propagao em eucariota, carregam um promotor viral e um enhancer localizados 5 da regio codificante do gene a ser clonado e um stio de poliadenilao 3 do gene. Alguns tambm incluem um intron, antes ou depois da regio codificante.

No primeiro vetor eucariota utilizado, estes elementos foram provenientes do virus SV40.
Uma vez inserido na clula, a protena codificada no plasmdeo passa a ser expressa aps algumas horas. Neste estgio, a maioria do DNA do plasmdeo inserido na clula

extracromossomal. Aps vrios dias, algumas molculas de plasmdeo se integram no

genoma de raras clulas.

Vetores de expresso

Vetores de expresso tpicos tm:

Promotores que dirigem a sntese de grande quantidade de mRNA do gene
que se quer expressar Sequncias que permitam a replicao autnoma em bactria (origem de

replicao)
Seqncias que codificam traos genticos que possibilitam reconhecer as clulas que contm o vetor Seqncias que aumentam a eficincia da traduo do RNA

Expresso de protenas recombinantes:

Expresso em E. coli Vantagem: simplicidade e baixo custo

Expresso em clulas eucariotas Vantagens: quase sempre as protenas so expressas no compartimento subcelular correto e corretamente processadas. Desvantagem: difcil produzir em larga escala (clulas de mamferos, por ex.) Produo em levedura eficiente

Expresso da protena recombinante em procariotas:

Clonar o cDNA a partir de mRNA processado, pois preciso lembrar que bactrias no removem introns. Retirar tambm as regies 5UTR e 3UTR.

Adicionar a seqncia Shine Dalgarno (AGGAGG, 5 a 12 bases antes do ATG), para expresso em procariota. Esta seqncia contribui para localizao da metionina inicial.

ATG inicial que codifica uma formil-metionina em bactrias, pode eventualmente ser removida, apenas se o segundo amino cido for um amino cido com cadeia lateral pequena. Leucina deve ser evitada nesta posio.

STOP codon

A seqncia de Shine-Dalgarno favorece a atividade tima dos ribossomos

Expresso em procariota (E. coli)

Codon usage: A diferena entre o uso do cdigo (codon usage) pode ser um motivo para expresso ineficiente em procariotas. Codons que so muito raramente usados em E. coli correspondem a poucas molculas do tRNA especfico. Isso torna a sntese de uma protena eucariota muito ineficiente em E.coli. Soluo: Fazer co-expresso dos tRNAs raros Modificar o codon, para um codon mais comum em E.coli, preservando o amino cido.

Promotor:
A transcrio do gene alvo em procariotas controlada por dois sistemas bsicos: tac promoter, reconhecido pela RNA polimerase de E. coli T7 promoter de bacteriofago, reconhecido pela T7 RNA polimerase (este tem a vantagem de propiciar uma expresso muito baixa na ausncia de induo).

Inicialmente, o vetor com o cDNA a ser expresso propagado numa bactria que no tem o
gene da T7 RNA polimerase. O plasmdeo recombinante em seguida purificado e sequenciado.

Em seguida, o plasmdeo j estabelecido transferido para uma linhagem bacteriana que

expresse o gene da T7 RNA polimerase.

Os sistemas indutveis so os mais adequados para expresso em E. coli porque altos nveis de protena heterloga podem ser letais para a bactria.

Os vetores ideais para expresso em E. coli devem ter: - Um promotor indutvel - O sinal de trmino de transcrio - Um enhancer opcional - Um stop codon - Gene de resistncia a antibitico

- Origem de replicao que determina o nmero de cpias do plasmdeo

na clula.

Sistema de induo em E. coli: Lac repressor / Anlogo da lactose (IPTG)

Protenas expressas em E. coli frequentemente formam agregados proticos, denominados corpos de incluso.

Isso no costuma ser problema se o objetivo final produzir protenas para

produo de anticorpos. No entanto, problema se o que se deseja uma anlise

funcional da protena.

Uma possvel soluo expressar a protena como protena de fuso. Protenas de

fuso costumam ser mais estveis que as protenas nativas em E. coli. Alm disso,
mais fcil purificar uma protena de fuso.

As fuses mais comuns so com: - GST (glutationa S transferase) e - segmento polihistidnico (tag de histidina)

Vetores para expresso de protenas de fuso

Fuso com Glutationa S-transferase GST
26kd

GST

sua protena

Clivagem com trombina ou fator Xa

Controle do Ptac

A protena de fuso purificada em coluna contendo glutationa.

A protena de fuso, sua protena de

interesse + GST, pode ser facilmente purificada em coluna contendo glutationa, o substrato da enzima GST.

GST pode ser separada de sua protena de interesse por digesto enzimtica. Na regio entre uma protena e outra h stio de clivagem para a trombina ou outra protease.

O sistema muito til para isolar protenas da clula que interagem com

sua protena de interesse.

Expresso da protena nativa em eucariotos:

Para expresso de protenas em eucariotos, necessrio adicionar imediatamente antes da regio codificante da protenas:

Seqncia Kozac (-- GCCACC ATG G -), para expresso em eucariota

Alm disso, deve ser adicionado: ATG inicial STOP codon

Seqncia de Kozac: a introduo da sequncia de Kozac facilita a

identificao do ATG inicial pelos ribossomas em eucariotas

Expresso em eucariotas

Os vetores para expresso em eucariotos, possuem uma origem de replicao bacteriana e um gene de resistncia a antibitico para propagao inicial em

bactrias.

Para propagao em eucarioto, carregam um promotor e um enhancer localizados 5 da regio codificante do gene a ser clonado e um stio de

poliadenilao 3 do gene. Alguns tambm incluem um intron, antes ou depois

da regio codificante.

Os primeiros vetores para expresso em eucarioto tinham um promotor e um

enhancer do virus SV40

Muitos vetores tm um promotor do CMV.

Um plasmdeo para expresso de protena recombinante em eucarioto:

PCMV: enhancer-promoter do Cytomegalovirus, que induz uma transcrio constitutiva e abundante do gene clonado sob seu controle em eucariotos. BGH pA: Sinal de poliadenilao do gene Bovine Growth Hormone (BGH) f1 ori: Origem de replicao para obter fitas nicas, sense.

SV40 ori: Origem para replicao epissomal em clula eucariota.

pUC ori: Origem para replicao em bactria Resistncia a Neomycin ou Zeocin: para seleo de clulas eucariotas. Resistncia a Ampicilina: para seleo de bactrias (E. coli)

Transfeco de clulas eucariotas

Mtodos de Transfeco:

Transfeco por mtodos bioqumicos Precipitao de fosfato de clcio Lipdeos catinicos

Transfeco por mtodos fsicos

Microinjeo com partculas de ouro ou tungstnio Eletroporao

Transfeco mediada por infeco viral

Eletroporao

Lipofeco

Microinjeo

Indicado para clulas vegetais

Transfeco transiente e estvel:

Transiente:
O DNA recombinante introduzido na linhagem celular receptora com o objetivo de obter uma expresso temporria porm elevada do gene de interesse. A protena codificada pelo cDNA transfectado detectada na clula aps algumas horas. Neste estgio, a maioria dos plasmdeos recombinantes extracromossomal, mas aps vrios dias algumas molculas do vetor se integram no genoma da clula.

Estvel: Usada para estabelecer linhagens celulares nas quais o gene transfectado est inserido no DNA cromossomal, onde ele comanda a sntese de quantidades moderadas da protena alvo.

O isolamento dos raros transformantes estveis de um background de clulas no

infectadas facilitado pelo uso de marcadores genticos para seleo. (Resistncia a Neomycin, Zeocin, Hygromycin)

Retrovirus: o genoma um RNA fita nica.

convertido em DNA dupla fita dentro da clula infectada. O DNA dupla fita se integra no cromossomo da clula hospedeira como genoma proviral. O provirus continua a transcrever seu genoma inteiro, o qual codifica todas as protenas

necessrias para fazer novos virions.

LTR
gag

genes virais
pol env

LTR

LTR tandem long terminal repeats, importantes para mediar a integrao do provirus e para regular a transcrio.

O retrovirus para expresso de protenas clonadas no tem seus prprios genes preservados

Clulas de empacotamento produzem partculas virais com RNA viral contendo o gene de interesse

As clulas infectadas no produzem partculas virais

Tcnica de clonagem para estudo de promotores

Vrios segmentos do promotor so inseridos em vetor com gene reprter

+1

A transcrio do gene reprter ser comandada pelos diferentes segmentos do promotor em anlise

A protena produzida a partir do mRNA quantificada: quanto mais eficiente for o segmento do promotor, maior a quantidade de protena produzida

So removidos promotor/enhancer que controlam a transcrio do gene da Luciferase. Obtem-se o vetor abaixo para estudo de

promotores:

No stio de clonagem introduzido o fragmento de DNA correspondente ao promotor do gene que se quer estudar.

O vetor recombinante transfectado para clulas

eucariotas que normalmente expressam a protena

de interesse. Gene que codifica Luciferase, que a protena reprter

Medida da atividade de luciferase

Tcnica de clonagem para identificao de protenas que interagem umas com as outras no interior da clula:

Two-hybrid system

Estes experimentos so realizados em leveduras. A linhagem de levedura transformada com o plasmdeo recombinante que produz a protenaisca fusionada com o mdulo protico que interage com o DNA na regio do promotor.
construda uma biblioteca do tecido no qual se quer procurar protenas (presa) que interagem com a protena-isca .

Esta biblioteca construda de modo que todos os genes so expressos na forma de protena de fuso com o mdulo de transativao do fator de transcrio, cujo mdulo de interao com o DNA est ligado protena isca.

Quando isca e presa interagem o gene reprter ativado.

Um grande nmero de ORFs (open reading frames) tm sido interrompidas com a finalidade de obter informaes sobre a funo das protenas que codificam.

Knockout de genes de levedura

Knockout

Camundongo knockout

ZFN mRNA targeted

Deteco das clulas mutadas

Camundongo transgnico