UNIVERSIDADE REGIONAL INTEGRADA DO ALTO URUGUAI E DAS MISSES URI CAMPUS SANTO NGELO

DEPARTAMENTO DE CINCIAS EXATAS E DA TERRA CURSO DE QUMICA INDUSTRIAL MICROBIOLOGIA E CONTROLE DE QUALIDADE

AULA PRTICA: COLORAO DE GRAM RELATRIO II

Acadmicos: Daniele Perin Ariane Lara

Professora: Claudia

Santo ngelo, agosto de 2012.

Introduo

A tcnica de colorao de Gram uma tcnica de colorao diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactrias por microscopia ptica. Foi descoberta pelo fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve com a colorao realizada uma melhor visualizao das bactrias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactrias coravam com este mtodo o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importncia ao seu mtodo de colorao. Atualmente, esta tcnica fundamental para a taxonomia e identificao das bactrias, sendo utilizada como tcnica de rotina em laboratrios de bacteriologia. O mtodo consiste em tratar sucessivamente um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. As bactricas que adquirem a colorao azul violeta so chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a colorao vermelho so chamadas de Gram-negativas. O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem.

As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e predominantemente constituda por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel que se forma por ao do mordente, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (azul violeta).

As bactrias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm peptidoglicano e que mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolvel, que se forma por ao do mordente, removido (camada de peptidoglicano mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as clulas ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.

Microorganismo utilizado Salmonella um gram-negativas, em forma de bastonete bacilos que podem causar doena diarrica em humanos. Simplificando A salmonela uma bactria em forma de haste com uma parede celular composta de peptidoglicano. Corantes 1) Cristal violeta: 1g de cristal violeta; 2g de cido fnico; 10 mL de lcool absoluto; 100mL de gua destilada. Diluir o cristal violeta no lcool e juntar aos pouco o cido fnico,misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homogenia. Juntar a gua, pouco a pouco, misturando bem. Filtrar em papel de filtro aps 24h de repouso. 2) Lugol: 1g de iodo; 2 g de iodeto de potssio; 300 mL de gua destilada. Diluir o iodo com o iodeto de potssio em gua e misturar bem. Preparar a soluo em quantidade que seja usada antes de 30 dias. 3) lcool acetona: 800 mL de lcool; 200 mL de acetona. Misturar as duas solues. ter acetona: 500 mL de ter e 500 mL de acetona. Misturar as duas solues. Guardar em um recipiente com vedao j que as duas substncias so volteis. 4) Fucsina: 2,5g de fucsina; 100mL de lcool etlico; 90 mL de gua destilada. A soluo estoque (fucsina e lcool etlico) deve ser preparada unindo-se os dois componentes. Para usar diluir em 10% com gua destilada.

Descrio da atividade Materiais: - Ala de latina ou nquel - Estante para tubo

- Bico de bunsen - Laminas de vidro - Prendedor de madeira - Microscpio Reagentes: - Soluo de Cristal violeta - lcool-cetona - Fucsina - Lugol - Desinfetante (a base de cloro) - leo de imerso Culturas: - Salmonella - Outra

Preparo da Lamina Selecionou-se um microorganismo (cultura) para cada componente do grupo e seguiu-se os seguintes passos: Ligou-se o bico de bunsen Pegou-se uma lamina esterilizada Colocou-se 1 gota de gua esterilizada na lamina Flambou-se a ala e deixou-se esfriar um pouco. necessrio que a ala seja completamente aquecida a ponto de avermelhar a superfcie. Coletou-se um pouco de amostra do esfregao Espalhar na placa reservando uma lateral Deixou-se secar Passou-se 3 vezes na chama do bico de bunsen para fixar o esfregao. Encaminhou-se a lamina para a colorao.

Preparo da colorao Cobrir a lamina com soluo de Cristal violeta

Aguardar 1 minuto Lavar com gua corrente Cobrir a lamina com Lugol Aguardar 1 minuto Lavar com gua Acetona Lavar com gua corrente Cobrir a lamina com soluo Fucsiona Aguardar 1 minuto Lavar com gua corrente Secar prximo chama do bico de bunsen Examinar no microscpio

Concluso Conclumos na anlise microscpica que o microorganismo Salmonella, utilizado na tcnica gram negativo, portanto foram coradas com corante vermelho. A visualizao do formato da Salmonella ficou bastante comprometida, pois a placa ficou com muito acumulo de cultura e tambm na visualizao o aumento de 100 vezes no deixou muito ntida a imagem.