QU ES LA CITOMETRIA DE FLUJO?

Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de luz de clulas o partculas microscpicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles de clulas/segundo) frente a un haz de luz lser de longitud de onda adecuada. Esta tcnica permite obtener mltiples caractersticas fsicas de cada sola clula en forma simultnea. Estas caractersticas de las clulas son evaluadas debido a que las clulas pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 clulas por segundo. Parmetros La citometra de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos de la biologa. Una de sus principales ventajas es la posibilidad de realizar anlisis multiparamtricos los cuales permiten determinar la presencia de varios marcadores simultneamente, tanto en la membrana como en el citoplasma o ncleo de las clulas, sean stas de origen animal o vegetal. La identificacin de marcadores celulares permite evaluar al interior de una muestra heterognea la proporcin relativa de una poblacin. Cmo funciona esta tcnica? La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas de sangre perifrica. Actualmente ,el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio, en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular ,este aparato lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y ,con placas deflectoras, se realiza su separacin. Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio, como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. La seal, producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo

monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot), o en una dimensin (Histograma), en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA? -Su tamao relativo. (Forward scatter-FSC) - Su granularidad o su complejidad citoplasmtica. (Side scatter-SSC) -Su intensidad de fluorescencia relativa.(FL1, FL2, FL3 o FL4) COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA? El citmetro de flujo detecta la interaccin entre una clula y un rayo lser. La forma que la clula: -Desva la luz incidente. -Emite fluorescencia.

El como la clula desva los rayo de luz nos da informacin acerca del tamao y la granularidad de cada clula.

 Los citmetros de flujo estn constituidos fundamentalmente por tres sistemas: sistema de fluidos sistema ptico de iluminacin y deteccin el sistema electrnico SISTEMA FLUDRICO: Este sistema consta de dos fludos, uno que contiene en suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad (sheath fluid). Las clulas deben pasar una a una por delante del haz del lser. Ambos fludos (Solucin fisiolgica, PBS, aire) no se mezclan porque circulan a diferente presin.

SISTEMA PTICO: Este sistema se compone de dos tipos de pticas: La ptica de excitacin, compuesta de el lser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz; y La ptica de lectura, compuesta por las lentes de recoleccin de luz emitida luego de la interaccin entre el haz del lser y las partculas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda especficas hacia los detectores correspondientes. FILTROS OPTICOS: Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser: DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas); DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De stos hay tres tipos: Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 640 nm) Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm) Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm)

SISTEMA ELECTRICO: El sistema electrnico convierte todo en seales digitales para almacenar en la computadora.

reactivos Las molculas asociadas a las clulas pueden ser reconocidas por anticuerpos u otras protenas, como son lectinas, hormonas, avidina o estreptoavidina, entre otras. Tambin el DNA o RNA son susceptibles de ser visualizados con reactivos fluorescentes. Esto es la base de la versatilidad de la citometra de flujo. As, aunque las mediciones de FSC y SSC permiten identificar tipos celulares dentro de una poblacin heterognea, son realmente las sondas fluorescentes las que nos permiten clasificarlas con certeza en subtipos, determinar el contenido de DNA y analizar las propiedades fisiolgicas de las clulas. Las seales fluorescentes de cada clula son detectadas slo unos pocos milisegundos despus de ser excitadas con la luz. El fluorocromo ms utilizado en microscopa y citometra de flujo es isotiocianato de fluorescena (FITC). Las ventajas que FITC ofrece por sobre otros fluorocromos son: su alto coeficiente de extincin, su eficiencia cuntica y sus caractersticas de absorcin y emisin mxima, Sin embargo, tambin presenta algunos inconvenientes tales como la transferencia de energa entre molculas de FITC situadas muy prximas lo que hace disminuir la intensidad global de fluorescencia obtenida (quenching de fluorescencia). De este modo, en el caso de utilizar anticuerpos marcados con FITC, el resultado final en trminos de intensidad de fluorescencia no depende slo del nmero de partculas fluorescentes unidos a la clula, sino tambin de otras caractersticas como la proximidad espacial entre ellos. Si se requiere un segundo o tercer anticuerpo para marcajes simultneos, se utilizan fluorocromos que se exciten a la misma longitud de onda que la fluorescena, como R-ficoeritrina (PE) por ejemplo cuyos rangos de emisin son distinguibles del verde de la fluorescena y por tratarse de un fluorocromo muy sensible que no

presenta fenmenos de quenching es el elegido en el caso de buscar antgenos presentes en alta densidad. La mayora de los restantes fluorocromos empleados, ms que fluorocromos individuales, son grupos de dos fluorocromos unidos entre ellos de forma natural (por ejemplo, la protena peridilclorofila o PerCP) o artificialmente (por ejemplo la ficoeritrina-cianina 5, PE/Ci5, conocida tambien como Tricolor).

CON 1 SOLO FLUOROCROMO Se quiere saber cuantas clulas CD3+ hay en sangre perifrica. Anticuerpo anti- CD3 marcado con fluorescena FITC CON 2 FLUOROCROMOS Se quiere saber cuantas clulas CD3+ y CD19+ hay hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti- CD3 marcado con fluorescena FITC Anticuerpo anti- CD19 marcado con ficoeritrina PE CON 3 FLUOROCROMOS Se quiere saber cuantas clulas T CD3+/ CD4+/ CD8+ hay en sangre de un individuo. Anticuerpo anti- CD3 marcado con fluorescena FITC Anticuerpo anti- CD4 marcado con ficoeritrina PE Anticuerpo anti- CD8 marcado con Peridinina clorofila PerCP

El SIDA se desarrolla cuando el nivel de Linfocitos T CD4 desciende por debajo de 200 clulas por mililitro de sangre. La citometra de flujo ayuda a la determinacin del nivel de linfocitos T CD4.

El anlisis de las subpoblaciones de linfocitos en sangre perifrica se puede aplicar para evaluar el estado inmunolgico e incluso proporciona informacin importante para la identificacin de diferentes padecimientos. En el SIDA se ha comprobado que el monitoreo de las subpoblaciones linfoides, especficamente el conteo absoluto de linfocitos CD4, tiene tanto valor pronstico como teraputico.

La caracterizacin de subpoblaciones linfocitarias es una herramienta de gran utilidad en el seguimiento de la progresin de cuadros de inmunodeficiencia. Esto permite detectar con alta sensibilidad subpoblaciones poco representadas dentro de la poblacin total, como son los linfocitos T CD4+ en el SIDA (Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida).