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 Segunda Edicin Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cpac Yupanqui 1400. Jess Mara Telf.471-3254 I Fax: 471-7443 Lima, Per, 1997 Diseo e impresin: Art. Lautrec S.R.LIda.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE PESTE

COMITE RESPONSABLE BIg. Sara Morales de Santa Gadea Blg. Martha Glenny Araujo Blg. Carmen Flores Mendoza COMIT EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martllez- Vargas Dr. Csar Cabezas Snchez Dr. Carlos Carrillo Parodio Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD . ALTA DIRECCIN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodio Jefe. CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD Dr. Csar Cabezas Snchez

Director Genera

PERFIL DE AUTORES
8lgo. Sara Morales de Santa Gadea Biloga Jefe del Laboratorio de Bacteriologa Especial, Divisin de Bacteriologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. 8lgo. Martha Glenny Araujo Biloga Jefe del Laboratorio de Bacterias de Transmisin Sexual y Leptospiras, Divisin de Bacteriologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Dr. Carlos Carrillo Parodl Mdico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. . PERFIL DE WS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martnez- Vargas Mdico Cirujano, Doctor en Farmacologa Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Profesor Principal, Seccin Farmacologa, Departamento Acadmico de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Miembro, Instituto de Medicina Tropical 'Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Csar Cabezas Snchez Mdico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud, M/NSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodl Mdico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Mdico Cirujano, Master of Science in Community Health in Deueloping Countries Director Ejecutivo de Certificacin y Garanta de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA, Investigador, Instituto de Medicina Tropical 'f\lexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Agradecimientos: El Comite Editor expresa su agradecimiento a los seores Doctores Csar Naquira Velarde, Humberto Guerra Allison, Isabel Montoya Piedra, por las valiosas sugerencias y correcciones efectuadas al manuscrito. La edicin de este Manual se efectu en el marco del Convenio de Cooperacin suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

INDICE

Presentacin ........................................................................................... ............................................7 Resolucin Jefatural .............................................................................. ............................................8 CAPITULO I Introduccin........................................................................................... .............................................9 CAPITULO II Obtencin y envo de la Muestra ....................................................................................................10 CAPITULO III Pruebas de laboratorio para diagnstico de Peste .......................... ............................................19 CAPITULO IV Inmunofluorescencia Directa (IFA) .................................................... ............................................22 CAPITULO V Prueba de Aglutinacin en Ltex ........................................................ ............................................25 CAPITULO VI Aislamiento por Cultivo de Yersinia pestis ...................................................................................28 CAPITULO VII Tcnicas de ELISA...........................................................................................................................36 CAPITULO VIII Inoculacin en ratn............................................................................ ............................................43 CAPITULO IX Normas de Bioseguridad .................................................................................................................45 CAPITULO X Referencias Bibliogrficas ................................................................. ............................................46 CAPITULO XI Anexos ...............................................................................................................................................47 Anexo 1: Definiciones de casos de Peste segn el laboratorio ..................................................................48 Anexo 2: Ficha de laboratorio para diagnstico de Peste ...........................................................................49 Anexo 3:.. Sobre de envo de tiras de Nobuto (animales) ..............................................................................50 Anexo 4: Ficha para el diagnstico de Peste en animales...........................................................................51 Anexo 5: Preparacin de Medios de Cultivo y Reactivos ............................................................................52

PRESENTACION

La Yersinia pestis es un microorganismo virulento, gramnegativo, mvil cuando se le aisla del medio ambiente, pero que se torna inmvil en los tejidos del husped. Tres especies de Yersinia pueden ocasionar enfermedades en el hombre: Yersinia enterocoltica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis. Las dos primeras, se adquieren por ingestin de alimentos contaminados, mientras que la ltima requiere la picadura de un insecto, siendo la especie ms invasiva. Son portadores de la enfermedad: las ardillas, ratas del campo, marmotas, cerdos salvajes, osos y ocasionalmente conejos. Los gatos domsticos pueden ser infectados de peste cuando cazan roedores enfermos y transmitirla a los humanos. Esta caracterstica ha permitido que no existan problemas al escoger animales modelo para estudiar la fisiopatogenia de la enfermedad. Desarrolla bien en cultivos celulares (HeLa, Hep-2, Hence), poseyendo plasmidos de virulencia (adhesinas, invasinas y regulatorias). Una historia clnica que refiera picaduras de pulgas y/o campamentos o permanencia en reas endmicas son importantes para el diagnstico primario. El reconocimiento precoz de esta enfermedad es crtico para el tratamiento apropiado, tanto de los pacientes como el de los contactos y para el inicio de medidas de control que prevengan la rpida diseminacin de la enfermedad potencialmente fatal. Los sntomas incluyen el sndrome parecido al resfro viral (influenza): fiebre alta, escalofros, malestar, dolor de cabeza, y generalmente, pero no siempre, aumento del tamao de los ndulos linfticos con dolor, cerca a las reas de la inoculacin primaria (reas inguinales o axilares). El tratamiento antibitico es esencial en peste y cuanto ms precoz, mejor ser la evolucin de la enfermedad. Disminuir la poblacin de roedores mediante eliminacin de la basura y programas de erradicacin de roedores, es una accin esencial en el control de esta enfermedad. Este manual constituye parte de la serie de Normas Tcnicas que el Instituto Nacional de Salud, como Organo Normativo Referencial est publicando, para su uso en la Red Nacional de Laboratorios de Salud y por la comunidad tcnico cientfica, en concordancia con los lineamientos de politica institucional y sectorial.

Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe

CAPITULO I INTRODUCCION

La Peste, es una infeccin bacteriana de animales y humanos causada por Yersinia pestis. El bacilo de la Peste fue descubierto por el bacterilogo francs Alexander Yersin, en 1894, en Hong Kong. Se le llam Pasteurella pestis hasta 1970. Yersinia pestis, pertenece la Familia Enterobacteriaceae, y es un bacilo Gramnegativo aerobio oxidasa negativa, que cuenta con gran nmero de antgenos y toxinas que desempean papeles importantes en la virulencia y patogenicidad de la enfermedad. La forma clnica ms frecuente, es la linfadenitis regional aguda, llamada Peste Bubnica. Algunas formas menos comunes son la Septicmica y la Neumnica. La mortalidad es alta en los casos no tratados, pero el tratamiento antibitico que se emprenda en fase temprana del curso de la enfermedad reduce notablemente la letalidad. La Peste, es de distribucin mundial, con focos importantes en Amrica, Africa y Asia. Los reservorios naturales de Yersinia pestis, son sobre todo roedores urbanos y silvestres; y se transmite entre animales y en ocasiones al hombre por la picadura de pulgas infectadas. Yersinia pestis, ha causado pandemias devastadoras con altos ndices de mortalidad durante toda la historia. La primera conocida, se origin en Egipto en el ao 542 D.C. y se extendi a Turqua ya Europa. La ms reciente, comenz, aproximadamente en 1860, en la provincia china de Yunnan, se extendi hacia la costa sur de China, llegando a Hong Kong en 1894. Luego, la Peste fue llevada por barco a la India y otros pases de Asia, Brasil y Estados Unidos (California). Se calcula que ocurrieron 10 millones de muertes por esta enfermedad en la India durante el siglo actual. La Peste ingres al Per por los puertos de Pisco y Callao en 1903, afectando reas urbanas hasta 1910. En los ltimos 35 aos, slo se han presentado casos de Peste Silvestre, localizndose en los Departamentos de la Costa y Sierra Norte del pas. En el laboratorio. Y. pestis crece lentamente. y es bioqumicamente inactivo en contraste con otras Enterobacterias. En caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI). Y. pestis, tiene un crecimiento caracterstico formando estalactitas en lugar de una turbidez homognea. Las coloraciones de Gram y Wayson no son especficos. Los criterios para la definicin del caso presuntivo y confirmado de Peste, segn la OMS, se muestran en el Anexo l. El diagnstico de laboratorio, es fundamental, para la confirmacin de los casos humanos y de las epizootias, as como para la vigilancia epidemiolgica de la Peste.

CAPITULO II OBTENCION Y ENVIO DE LA MUESTRA

2.1. OBTENCION DE LA MUESTRA

El xito de los procedimientos de laboratorio depende de una buena obtencin de la muestra y de la rapidez con que las mismas lleguen al laboratorio. Se debe obtener la muestra antes de la administracin de antibiticos. Si se han administrado, informar de ello, al laboratorio. El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deber manejarse con gran cuidado usando mandil, guantes y mascarilla por el riesgo de infeccin. El personal de laboratorio puede infectarse por diversas vas: lesin en piel, mucosas y tracto respiratorio en accidentes de laboratorio. Deber adoptarse toda clase de precauciones para no contaminar el material biolgico y, para evitar que se dispersen en el aire gotas minsculas que puedan causar la infeccin de otras personas y la propagacin de la Peste Neumnica.

2.2. OBTENCION DE MUESTRAS DE CASOS HUMANOS

2.2.1. Aspirado de Bubn: Deber ubicarse los bubones; y seleccionar el que aproximadamente mida 3 cm o ms de dimetro. (Ver Foto 1) Desinfecte dos veces la piel del bubn con alcohol yodado, descartando el algodn cada vez, y una tercera vez con alcohol de 70. Antes de la puncin debe haberse evaporado. Aspire con la aguja N 20 y una jeringa de 10 cc., 0.5 mL de solucin salina estril. Sosteniendo la jeringa entre el ndice y el pulgar de la mano derecha introduzca la aguja en el bubn. Con la mano izquierda, tire lentamente del mbolo de la jeringa. Deber entrar en sta, un lquido que puede ser sanguinolento. En el caso de que no entre lquido alguno en la jeringa, inyecte la solucin salina en el bubn, empuje suavemente el mbolo con el pulgar. Imprmase a la aguja introducida en el bubn un movimiento circular; a continuacin, tire lentamente del mbolo, para as obtener el lquido seroso. Retire la jeringa y limpie con alcohol de 70 el sitio de la puncin. Sostenga la jeringa en posicin vertical, con la aguja hacia abajo e inocule parte del aspirado del bubn en el medio de transporte CaryBlair. El resto del aspirado se usar para el frots, para la prueba de Inmunofluorescencia

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Directa. Dejar caer una gota de la muestra contenida en la jeringa y extindala con la misma aguja sobre una lmina porta-objeto limpia y desengrasada formando una capa bastante delgada. Dejar secar el frots a temperatura ambiente. - Para descartar el material contaminado, sumerja la jeringa y la aguja en fenol al 5%, extrayendo suavemente el mbolo. Se obtendr, adems, muestras de sangre para hemocultivo y serologa. 2.2.2. Sangre: La muestra se obtendr de pacientes febriles que se encuentran en la fase septicmica de la enfermedad. A fin de obtener una mayor posibilidad de aislar el agente etiolgico, se obtendr cuatro muestras seriadas de sangre en un lapso de 90 minutos para cultivo. La primera muestra de sangre deber ser aproximadamente de 10 mL (5 mL para serologa y 5 mL para cultivo); las tres muestras restantes de 5 mL cada una para cultivo. Antes de proceder a la extraccin de la sangre, limpiar con algodn embebido con alcohol yodado la tapa del frasco de cultivo; descartar el algodn y colocar nuevamente otro algodn embebido en alcohol de 70, el que permanecer hasta la obtencin de la sangre. Localizar la vena y desinfectar la piel por dos veces con alcohol yodado y una tercera vez, con alcohol de 70, realizando movimientos centrpetos y descartando cada vez el algodn. Extraiga 10 mL de sangre en caso de adultos y 5 mL en caso de nios. Retire el algodn del frasco de cultivo e inocule a travs del tapn de jebe 5 mI. de sangre en caso de adultos y 2.5 mI en nios. (Ver Foto 2).

Foto 1: Bubn en paciente con Peste Bubnica, del cual se obtendr la

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muestra de aspirado

Foto 2: Inoculacin de muestra de sangre en frasco de cultivo (medio bifsico).

Foto 3: Inoculacin de muestra de esputo en Medio de Transporte Cary-Blair

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o de la sangre se transfiere a un tubo de ensayo de 13 x 100 mm sin anticoagulante para separar el suero, vertiendo suavemente la sangre por la pared del tubo para evitar la rotura de los glbulos rojos; dejar reposar a temperatura ambiente y una vez retrado el cogulo. separar el suero. El suero obtenido se trasvasa a un vial de crioconservacin (NUNC) y servir para la realizacin de la prueba serolgica de aglutinacin en ltex. 2.2.3. Esputo: a) Este tipo de muestra se obtiene solamente en caso de sospecha de Peste Neumnica. Asimismo, se obtendr de estos pacientes muestras de sangre en paralelo para pruebas serolgicas y cultivo. El paciente deber expectorar dentro de un recipiente estril con tapa rosca y de boca ancha, adoptando las debidas medidas de Bioseguridad.(*)

b) Preparacin del frots de esputo: Colocar sobre la mesa de trabajo, idealmente, una hoja de papel absorbente plastificado. Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo, previamente rotulados, sobre la mesa de trabajo. De la misma forma, colocar las lminas porta-objetos en orden correlativo, en las cuales, se preparar el frots para realizar la prueba de Inmunofluorescencia Directa:

* Flamear el asa de siembra, dejar enfriar. * Destapar cuidadosamente el envase de la muestra, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido. Coger con el asa de siembra una pequea porcin de la muestra y extenderla sobre la lmina porta-objetos, haciendo movimientos de vaivn, hasta lograr que el extendido sea homogneo (ni muy fino ni muy grueso); que no llegue a los bordes de la lmina, para evitar que el operador se contamine al manipularla. * Dejar secar a temperatura ambiente para luego fijar el extendido al calor. Terminado el frotis, pasar el asa de siembra por el frasco con arena y fenol al 5%; luego dejar el asa en la caja de metal para ser enviado a autoclavar.

c) Inoculacin de la muestra en Medio de Transporte: Con ayuda del asa de siembra. extraer. parte de la muestra del recipiente e inoculada en el medio de transporte Cary-Blair. (Ver Foto 3).

En cada una de las muestras y lminas con frots. se debe poner el nombre del paciente o cdigo que identifique la muestra y debe ir acompaada de una ficha clnico-epidemiolgica (Anexo N 2) con los datos del paciente. Se debe escribir el mismo cdigo tanto en el tubo de medio de transporte, hemocultivo, tubo con sangre, lmina, as como en la ficha que lo acompaa.

___________________________________________ :*) Nota del Editor: Vase Captulo IX de este manual.

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2.2.4. Organos de pacientes fallecidos Caso sospechoso de Peste Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: a. Cuerpo no refrigerado (24 - 48 horas), realizar autopsia inmediatamente; obtener muestras de hgado, bazo y bubn. Si no se puede procesar inmediatamente, se puede guardar las muestras hasta por 06 meses en medio de transporte Cary-Blair o Thioglicolato a 4C. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 100% por cultivo el agente etiolgico, as como realizar Inmunofluorescencia Directa. b. Cuerpo no refrigerado (despus de 48 horas), obtener muestras de hgado, bazo y bubn y procesar inmediatamente. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 20% por cultivo el agente etiolgico as como realizar Inmunofluorescencia Directa y PCR. c. Muerto por largo tiempo (06 meses - muchos aos), obtener muestra de mdula sea de fmur. Se realiza diagnstico por PCR. d. No es recomendable realizar la digitoma, slo se llevar a cabo si no es posible ejecutar lo anteriormente mencionado. La digitoma tiene un porcentaje muy bajo de obtencin de un resultado positivo.

2.3. OBTENCION DE MUESTRAS DE ESPECIMENES ANIMALES

2.3.1. Roedores muertos: Deben ser recolectados, individualmente, en bolsas de polietileno conteniendo insecticida, el mismo que deber ir acompaado de su respectiva ficha. 2.3.2. Roedores vivos: 2.3.2.1. Anestesia del roedor - El animal capturado vivo, ser introducido en un saco de tela conteniendo algodn empapado con ter. Todo en su conjunto, debe ser introducido en una bolsa de polietileno de 35 x 45 cm. - Una vez adormecido el animal y sus ectoparsitos, se pasa a una bolsa de polietileno. Se espolvorea al animal con insecticida. Se da ligeros golpes al animal dentro de la bolsa para eliminar el insecticida y ectoparsitos adheridos al mismo. 2.3.2.2. Despulgue - Se procede al cepillado del animal sobre un lavatorio conteniendo agua. - Las pulgas colectadas se colocarn en frascos con capacidad de 2 mL. conteniendo solucin salina estril al 2.5% ms Tween 20. Las pulgas, as conservadas, se enviarn al Instituto Nacional de Salud para el aislamiento de Yersinia pestis mediante cultivo. 2.3.2.3. Biometrfa - Al animal anestesiado se le coloca sobre la mesa de autopsia. - Se procede a realizar mediciones, observacin del color del pelamen, sexo, peso y anotar algunas alteraciones morfolgicas (presencia de bubones ).

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2.3.2.4. Obtencin de sangre - Al animal anestesiado se le desinfecta la cola/oreja. - Obtener sangre en papel filtro (tiras de Nobuto). - En la parte ancha de ,la tira, escribir con lpiz el cdigo del animal. (Ver Foto 4) - Las tiras de Nobuto se dejan secar a temperatura ambiente. - Introducir las tiras de Nobuto secas al sobre, en el que se registrar toda la _nformacin referente al animal (Ver Anexo N 3). 2.3.2.5. Diseccin - La diseccin se realiza junto al mechero y con materiales de diseccin estriles. - Se procede a desnucar al animal. - El animal, es puesto en una bandeja de tecnopor descartable de 40 cm2. Colocar el roedor en posicin de cbito dorsal y prender con alfiler las patas. - Desinfectar la parte abdominal con alcohol corriente, pasar el algodn embebido de alcohol por tres veces. - Levantar la piel con una pinza, a dos dedos del escroto o vagina y realizar un piquete. - Separar la piel del cuerpo. - Realizar el corte ventral!", edio has'a la altura del corazn. (Ver Foto 5) 2.3.2.6. Obtencin de muestra de Organos - Con una tijera y con ayuda de la pinza, cortar desde la base del hgado y del bazo. - Obtener muestras de bazo e hgado y colocarlos, separadamente, en una placa petri estril. - Cortar pequeas muestras de bazo y/o hgado para inocular en medio de transporte Cary Blair y realizar impronta, las cuales, sern remitidas al Laboratorio Regional de Referencia correspondiente. La impronta servir para realizar la prueba de Inmunofluorescencia Directa, las que resulten positivas se sembrarn en placas de Agar sangre de carnero al 6% y BHI. (Ver Foto 6). Las muestras de rganos, sangre y lmina con frots correspondientes al mismo animal, debern tener el mismo cdigo y estar acompaadas de la ficha correspondiente (Ver Anexo N 4). 2.3.3. Animales Centinelas (perros) Extraer con una jeringa descartable de Tuberculina, 1 mL de sangre de la vena Safena de la pata posterior del animal. Depositar la sangre en dos tiras de Nobuto, de tal manera, que quede embebida la parte angosta de la tira. En la parte ancha de la tira, escribir con lpiz, el cdigo del animal. Dejar secar a temperatura ambiente. Introducir las tiras de Nobuto secas en el sobre, en el que se registrar toda la informacin referente al animal.

2.4. ENVIO DE MUESTRAS Y CULTIVOS 2.4.1 Envo al Laboratorio Regional de Referencia Tanto las muestras de casos humanos como la de especmenes animales, debern ser remitidas al Laboratorio Regional de Referencia (Piura, Chiclayo y Cajamarca) segn corresponda para la realizacin de las pruebas de Identificacin Presuntiva de Yersinia pestis (Aglutinacin en Ltex, Inmunofluorescencia Directa y Aislamiento primario).

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Foto 5: Diseccin de espcimen animal (ratn) para extraccin de rganos Yersinia pestis (Prueba de Tamizaje). Ola placa es dividida en dos secciones, cada una de ellas tiene control negativo (-) y control (+), mas 10 muestras de sueros problemas a procesarse en cada seccin.

FOTO 6: Siembra de muestra de rgano en placas de Agar Samgre

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Foto 7: Yersinia pestis en una muestra por la Prueba de Inmunofluorescencia Directa a una magnificacin de 1,000X

Foto 8: Prueba de Aglutinacin para diagnstico de Yesenia pestis (Prueba de Tamizaje). La polaca es dividida en dos secciones, cada una de ellas tiene control negativo (-) y control positivo (+), ms 10 muestras de sueros problemas a procesarse en cada seccin.

2.4.2 Remisin de Cultivos al Laboratorio Nacional de Referencia

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Los Laboratorios de Referencia Regional debern remitir al Instituto Nacional de Salud: Cultivos con pruebas presuntivas para identificacin confirmatoria de Y. pestis, en tubos o frascos pequeos con tapa rosca o de jebe conteniendo Agar Tripticasa de Soya (TSA). Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificacin, acompaado de su respectiva ficha. Dos muestras de sueros de un mismo paciente, obtenidas con un intervalo de tiempo para Confirmacin Serolgica de caso de Peste, con los resultados obtenidos en el Laboratorio de Referencia Regional. La remisin debe ser en tubos o frascos pequeos con tapa rosca o de jebe, crioviales de conservacin; nunca debe remitirse la muestra en jeringa. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificacin, acompaado de su respectiva ficha. El 100% de las pulgas para confirmacin de especie y determinacin de la presencia de Y. pestis. La remisin debe hacerse en frascos con capacidad de 2 mL conteniendo solucin salina ms Tween 20. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificacin, acompaado de su respectiva ficha. El 10% de crneos de animales capturados de la misma especie y procedentes de una misma zona, para verificacin de especie. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la identificacin, acompaado de su respectiva ficha. EI 10% de los animales taxidermizados que tengan la misma morfologa y procedan de la misma zona. Debe rotularse debidamente el espcimen, de tal manera, que no se borre o pierda la identificacin, acompaado de su respectiva ficha. Todas las muestras deben transportarse dentro de un recipiente seguroseguro para evitar accidentes el mismo que est correctamente identificado por fuera, indicando la direccin a donde va a ser enviado y sealando que contiene material biolgico, como se indica a continuacin:

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE

Cpac Yupanqui 1400 - Jess Mara, Lima II Telfonos 471-2529, 471-9920 FAX (01)471-7443 - (01) 471-2529 CONTIENE MATERIAL BIOLOGlCO REFRIGERAR

Se deber comunicar al Instituto Nacional de Salud, va telefnica o va fax, la remisin de muestras. ________________________________________________________________________________________

TODO MATERIAL CBIOLOGICO REMITIDO PARA IDENTIFICACIN Y/O CONFIRMACION DEBERA ESTAR ACOMPAADO DE SU RESPECTIVA FICHA CLINICO-EPIDEMOLOGICA Y/O ENTOMOLOGICA, EN CASO CONTRARIO, NOSE REALIZARA NINGUN ESTUDIO.
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CAPITULO IV INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFA)

Prueba que es usada como Diagnstico Presuntivo de Peste, basada en una reaccin antgeno anticuerpo especfica contra el antgeno capsular F1 de Yersinia pestis conjugado con Isotiocianato de Fluorescena (FITC). Asimismo, esta prueba es usada para realizar la vigilancia de roedores silvestres y epizootias.

4.1. MUESTRAS APROPIADAS Aspirado de bubn Esputo Cultivo Organos: Hgado, bazo, tejido de ndulo linftico

4.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA Conjugado de anticuerpo fluorescente (suero de conejo con Anti Fl conjugado con lsotiocianato de Fluorescena). Buffer Fosfato Salino (PBS), pH 7.2 0.2 Lminas porta-ebjetos (lmm de grosor) Laminillas cubre-objetos Lquido de montaje (90% Glicerol en PBS) Jarras de coloracin (Koplin) Lpiz de cera o plumn de tinta indeleble Cmara hmeda Micropipeta graduable de 5 a 50 uL de un canal

Tips de 1

- 100 uL

Controles: Positivo y Negativo Microscopio de fluorescencia Suero fisiolgico

4.3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA 4.3.1. Preparacin de Frotis o Impronta: Preparar 2 lminas por cada muestra. A. Organo: Coger con una pinza estril un pedacito de bazo o hgado y colocarlo sobre una lmina porta-objetos limpia y desengrasada. Presionar suavemente a manera de un sello. Dejar secar a temperatura ambiente.

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B. Cultivo: Flamear el asa de siembra en el mechero, dejar enfriar. Colocar una gota de suero fisiolgico estril sobre una lmina portaobjetos. Coger con el asa de siembra 1 2 colonias de la placa de Agar sangre y colocarla sobre la gota de suero fisiolgico. Homogenizar y extender la gota formando una capa bastante delgada; dejar secar a temperatura ambiente.

C. Aspirado de Bubn: Colocar la jeringa en posicin vertical con la aguja hacia abajo. Dejar caer una gota de la muestra extendindola sobre una lmina porta-objetos limpia y desengrasada formando una capa bastante delgada. En caso de que la muestra se encontrara en medio de transporte (tubo y/o frasco): * Flamear el asa de siembra, dejar enfriar. * Coger con el asa de siembra una pequea porcin de la muestra y extenderla en una lmina portaobjetos formando una capa bastante delgada. En ambos casos, dejar secar a temperatura ambiente.

D. Esputo: Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Coger con el asa de siembra una pequea porcin de la muestra y extenderla en una lmina porta-objetos formando una capa bastante delgada, dejar secar a temperatura ambiente.

E. Hemocultivo: De las colonias presentes en la fase slida del frasco de hemocultivo se prepara un frots empleando el siguiente procedimiento: Usar una lmina portas-objeto limpia. Pasarla por alcohol y secarla. Colocar sobre la lmina con una pipeta Pasteur y/o asa de siembra, una gota de suero fisiolgico estril. Con sta, coger 2 3 colonias, y realizar una emulsin de las mismas con el suero fisiolgico. Dejar secar a temperatura ambiente; y finalmente, fijarla al calor para realizar la prueba.

4.3.2. Coloracin de las lminas Cada prueba debe correrse paralelamente con controles preparados de una muestra que se conoce que es positiva y una muestra negativa. Calentar la lmina en el mechero para fijar las muestras, dejar enfriar y con el lpiz de cera, hacer un crculo en cada muestra. Agregar 25 uL del conjugado para cubrir cada muestra e incubar a temperatura ambiente (23-29C) durante 30 minutos en cmara hmeda. Lavar las muestras con buffer fosfato salino (PBS) por dos veces, sumergindolas durante 10 minutos cada vez en las jarras de coloracin. Dejar secar las muestras a temperatura ambiente.

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4.3.3. Lectura La lmina puede observarse, directamente, en el microscopio de fluorescencia, agregando una gota de aceite de inmersin dentro del crculo que contiene la muestra. Alternativamente, algunos microscopios requieren de un montaje especial, en tal caso, agregar una gota del lquido del montaje y cubrir con una laminilla cubre-objeto. Examinar la muestra. La presencia de organismos fluorescentes verdes ovoides pequeos o partculas pequeas se considera como una prueba positiva. Cuando los pacientes sospechosos de Peste han recibido tratamiento antibitico previo a la obtencin de muestra no se observa la morfologa celular caracterstica, pero, partculas pequeas de material celular disperso pueden estar presentes debido a la lisis de las bacterias, por lo que, es importante, que en la Ficha ClnicoEpidemiolgica se seale el esquema de tratamiento recibido por el paciente a fin de poder interpretar el resultado de la prueba. (Ver Foto 7) 4.4. FACTORES DE ERROR La variacin en el pH del buffer fosfato salino. La congelacin y descongelacin continua del conjugado disminuye el ttulo del mismo. Fallas en el procedimiento de fijacin de la muestra.

4.5. CONTROL DE CALIDAD Cuando es recibido el reactivo (Conjugado para Inmunofluorescencia), pequeas alcuotas (100 uL) deben ser preparadas y conservadas a una temperatura de -20C. Una vez que se usa una de las alcuotas, sta debe ser conservada a 4C en la oscuridad. El reactivo debe ser evaluado anualmente, para asegurar la reactividad del mismo. Cuando se preparan los frotices de las muestras a procesarse, tambin debe prepararse una batera de controles: positivo y negativo. Los microscopios de fluorescencia deben ser revisados y realineados una vez al ao.

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CAPITULO V PRUEBA DE AGLUTINACION EN LATEX

Prueba de diagnstico presuntivo que permite detectar la presencia de anticuerpos contra Yersinia pestis, es una reaccin antgeno anticuerpo especfica para el antgeno capsular F1 de Yersinia pestis, adherido a una partcula coloreada (ltex). Asimismo, es usada para realizar la vigilancia serolgica, de animales centinelas y roedores silvestre 5.1. MUESTRAS APROPIADAS Caso humano: Suero, de preferencia no hemolizado Espcimen animal: Sangre en papel filtro (tiras de NOBUTO)

5.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA Placas de microtitulacin de 96 pocillos, sin carga inica de polipropileno y de fondo en U Micropipeta Multicanal de 12 canales de 5-50 uL de capacidad Micropipeta de un canal, de 5-50 uL de capacidad Tips para micropipetas (0.1 - 100 uL) Diluyente : Buffer Fosfato Gelatina pH 6.8 Partculas de Ltex sensibilizadas con Fraccin Antignica F1 Buffer de Inhibicin de la Aglutinacin (Buffer Fosfato Gelatina con Fraccin Antignica F1) Buffer Borato pH 8. Tubos de prueba 10x75 mm Sueros Control: Positivo y Negativo Bafio Mara

Centrfuga

5.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.3.1. Preparacin de sueros de casos humanos Obtener muestra de sangre en tubo sin anticoagulante. Separar el suero por centrifugacin (2,500-3,000 rpm) durante 10 minutos. Observar que el suero no est contaminado. Inactivar el suero a 56C durante 30 minutos.

5.3.2. Preparacin de muestras de sangre de especimenes animales (Tiras de NOBUTO) Obtener muestra de sangre en tiras de NOBUTO. Separar la parte ancha de la tira de NOBUTO. Cortar en 2 fragmentos la seccin de la tira de NOBUTO, donde se encuentra la muestra, e introducirlos en el tubo de 10x75 mm que contiene 0.4 mL de buffer Borato. Dejar en refrigeracin (4C) durante toda la noche. Presionar con aplicadores (vidrio o plstico) las tiras de NOBUTO

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contra la pared del tubo de 10x75 mm Separar el suero por centrifugacin (5,000 rpm) durante 10 minutos. Inactivar el suero a 56C durante 30 minutos.

5.3.3. Procedimiento A. Prueba de Tamizaje La realizacin de esta prueba se efecta usando 4 pocillos por cada muestra. - Dividir horizontalmente la microplaca en dos secciones: 4 columnas hacia arriba y 4 columnas hacia abajo. Se pueden trabajar 10 muestras en cada seccin, sumando adems un control positivo y un control negativo en cada seccin. - Utilizando la micropipeta multicanal, colocar 25 uL de buffer diluyente a cada uno de los pocillos de la microplaca. Utilizando la micropipeta de un canal, adicionar 25 uL de cada uno de los sueros problema y controles a cada pocillo de la primera fila de cada seccin. - Realizar las diluciones, utilizando la micropipeta multicanal, mezclando por tres veces la muestra de suero en el primer pocillo de cada fila y luego transferir 25 uL de ste al segundo pocillo y as sucesivamente hasta el cuarto pocillo, descartando los ltimos 25 uL. - Girar la placa, de tal manera, que se empiece por la ltima dilucin al agregar con la micropipeta multicanal, los 25 uL del ltex a cada pocillo. - Cubrir la microplaca y dejar en reposo durante 6 horas a temperatura ambiente (2225C), en un lugar donde no haya vibraciones. Leer con una buena fuente de luz y fondo blanco. - El ttulo de la prueba de tamizaje, estar dado por la ltima dilucin en la cual se observe aglutinacin. (Ver Foto 8) B. Prueba Estndar Seleccionar las muestras en las cuales se observe aglutinacin con ttulos > 1: 1 O en casos de humanos y 1: 128 para especmenes animales para correr, simultneamente, la titulacin final de las muestras y la Prueba de Inhibicin de la Aglutinacin para determinar la especificidad de la reaccin. Se realiza usando 8 pocillos para la prueba de aglutinacin y 4 pocillos para la prueba de inhibicin de la aglutinacin. Dividir verticalmente la microplaca en dos secciones: una seccin con 8 columnas y la otra con 4 columnas. Se pueden trabajar 6 muestras de suero sumando adems un control positivo y un control negativo. Colocar 25 uL del buffer fosfato gelatina en los primeros 8 pocillos y 25 uL del buffer de inhibicin a los 4 pocillos restantes. Agregar, 25 uL de las muestras de suero a cada primer pocillo de aglutinacin y a cada primer pocillo de inhibicin de la aglutinacin. Diluir en forma seriada las muestras de suero, empezando por el primer pocillo y descargando los ltimos 25 uL. Los mismos tips pueden usarse para realizar la dilucin de los pocillos de inhibicin. Agregar a todos los pocillos, 25 uL del ltex. Cubrir la microplaca e incubar a temperatura ambiente durante 6 horas.

C. Lectura Examinar los pocillos despus de 6 horas de incubacin de la prueba. Buscar una aglutinacin clara en forma de red con bordes regulares como resultado Positivo.

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Los pocillos negativos tendrn un botn muy bien delimitado en los bordes o un crculo bien definido. Determinar los ttulos de acuerdo a la Tabla de Ttulo Final (Tabla 1). Los resultados de Inhibicin son interpretados como reaccin especfica. Si el ttulo de la muestra de suero es muy alto, la inhibicin de la aglutinacin es reducida.

Se considera, Positiva la prueba, cuando el ttulo es > 1: 1 O en caso de humanos y 1: 128 en caso de especmenes animales. 5.4 FACTORES DE ERROR La formacin de burbujas en el momento de realizar las diluciones dificulta la interaccin antgeno-anticuerpo. Temperaturas mayores de 28C favorecen la desecacin de las muestras.

5.5 CONTROL DE CALIDAD Cada lote de ltex y buffer, deben ser evaluados con un panel de sueros de ttulos conocidos y as asegurar que los reactivos estn funcionando en ptimas condiciones.

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CAPITULO VI AISLAMIENTO POR CULTIVO DE Yersinia pestis

6.1 AISLAMIENTO POR CULTIVO E IDENTlFICACION DE Yers;nia pestis (EN EL MEDIO AGAR SANGRE) La confirmacin absoluta de un brote de Peste, requiere del aislamiento e identificacin del agente etiolgico. En la fase aguda de la enfermedad, hay una intermitente bacteremia, por lo que se requiere la obtencin de 4 muestras de sangre para tener mayor probabilidad de cultivo positivo. Los ndulos linfticos tambin contienen abundantes organismos. Yersinia pestis puede ser identificada, presuntivamente, por la prueba de Inmunofluorescencia Directa. La confirmacin se basa en pruebas adicionales que incluyen la morfologa de los colonias bacterianas en cultivos de agar sangre al 6% y caldo BHI, caracterizacin bioqumica y sensibilidad al bacterifago especifico de Yersin;a pestis a temperatura de 37C como a temperatura ambiente (22 - 25C). Si se trata de pulgas o muestras que se encuentren contaminadas, entonces, se prepara un inculo para la inoculacin en ratones. El medio de agar sangre al 6%, es el medio slido estndar que se usa para el cultivo de Yersinia pestis. La superficie del medio de cultivo a usar debe estar completamente seca y a temperatura ambiente antes de proceder a la siembra. Las muestras obtenidas de pacientes sospechosos de Peste para cultivo pueden ser sembradas directamente (aspirado de bubn, esputo, rganos), o subcultivadas (hemocultivos), en los medios de cultivo anteriormente mencionados. 6.2 METODOLOGIA: 6.2.1. SEMBRADO Y MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS DE Yersinia pestis EN CULTIVO En caso de muestras de aspirado de bubn, esputo, rganos, se siembra directamente la muestra en el medio; la muestra se estra en la superficie del agar e incuba por 24 horas a 37C. Yersinia pestis, crece como colonias translcidas blanco-grisceas. A las 24 horas se observan colonias pequeas como cabeza de alfiler. Despus de una incubacin de 48 horas, las colonias miden aproximadamente 1-2 mm de dimetro y son blanco-grisceas y ms opacas. No son hemolticas. (Ver Foto 9 y 10).

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Foto 9: Colonias de Yersinia pestis aisladas en Agar Sangre (48 horas de incubacin). Colonias traslcidas blanco-grisceas, no hemolticas.

Foto 10: Colonias de Yersinia pestis a las 72 horas de incubacin.

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Foto 11: Crecimiento de Yersenia pestis en caldo infusin cerebro-corazn (BHI): Crece como pequeos acmulos de clula, no presentando turbidez (tubo izquierdo) a diferencia de otras bacterias que s presentan turbidez (tubo derecho).

Foto 12: Pruebas de Oxidasa, el color violeta oscuro (derecha) indica la prueba positiva, la ausencia de color (izquierda) indica prueba negativa.

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6.2.2. CRECIMIENTO EN CALDO INFUSION CEREBRO CORA ZON (BHI) El caldo de infusin cerebro corazn, es el medio estndar usado en el laboratorio para crecimiento de la bacteria. Es un caldo de aislamiento primario y de caracterizacin de Yersinia pestis. Antes de proceder a la inoculacin de las muestras de aspirado de bubn, sangre, esputo, rganos, el medio debe encontrarse a temperatura ambiente. Con el asa de siembra se realiza la inoculacin de la muestra (pequeo inculo) en un tubo tapa rosca que contenga aproximadamente 10 mL de caldo. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas. Yersinia pestis, tiene un crecimiento tpico y caracterstico en el caldo de cultivo. Los organismos crecen como pequeos acmulos de clulas dando la apariencia de estalactitas, usualmente, crece en los lados y fondo del tubo; el resto del caldo permanece claro. Despus de 24 a 48 horas de incubacin, el crecimiento caracterstico es observado si los tubos no se mueven. Si se agita, el crecimiento sedimenta en el fondo. No produce crecimiento turbio. (Ver Foto 11) 6.2.3 AISLAMIENTO A PARTIR DE HEMOCULTIVOS En caso de hemocultivos, el frasco que contiene la muestra del paciente, se deja en incubacin a 37C. Aproximadamente a las 6 horas, se inclina el frasco de tal manera, que la fase lquida bae la fase slida por unos minutos. Se vuelve el frasco a su posicin vertical y se deja incubar 24 horas. A las 24 horas, se observa si hay crecimiento en la fase slida, lquida o en ambas. Si no se observa desarrollo a las 24 horas, se inclina el frasco de tal modo que la fase lquida bae la fase slida por unos minutos; se vuelve el frasco a su posicin vertical y se deja incubando 24 horas ms a 37C. Si se observa presencia de colonias en la fase slida, se proceder a realizar un frotis para la prueba de Inmunofluorescencia Directa y subcultivarlas en placas de agar sangre al 6% y caldo BHI.

6.3. PRUEBAS DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA 6.3.1. PRUEBA DE OXIDASA Sobre un pedazo de papel filtro estril en una placa de petri, se coloca un extendido del cultivo utilizando un palillo de dientes estril y sobre el extendido se coloca 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa. La coloracin que aparece en 10 segundos, violeta oscura o rosada (dependiendo del reactivo a usarse) indicar un resultado positivo; la ausencia de coloracin indicar un resultado negativo caracterstico de Yersinia. Como control positivo de la prueba se utiliza una cepa de Pseudomonas aeruginosa y como control negativo una cepa de Escherichia coli. (Ver Foto 12) 6.3.2. PRUEBA DE CATALASA Sobre una lmina porta-objeto limpia y desengrasada en una placa de petri, se coloca una

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colonia utilizando el asa de siembra. Inmediatamente, agregar una gota de Perxido de Hidrgeno al 3%. El burbujeo inmediato indicar un resultado positivo caracterstico de Yersinia. La ausencia de burbujeo indicar un resultado negativo. Como control positivo se utiliza una cepa de Staphylococcus aureus y como control negativo una cepa de Escherichia coli. 6.3.3. MOVILIDAD EN AGAR Es una prueba de identificacin presuntiva y se usa para diferenciar la Yersinia pestis (No Mvil) de la Yersinia pseudotuberculosis (Mvil). La muestra apropiada para la realizacin de esta prueba, es solamente cultivo puro. Con el asa de puntura, coger una colonia de la placa de agar sangre e inocularla slo en el tercio superior del tubo rosca que contiene el medio de movilidad. Incubar a 37C durante 24 horas. Para la lectura utilice los siguientes criterios: a. Organismo mvil: Se observa, enturbamiento homogneo del medio y la puntura de inoculacin no es visible. b. Organismo no mvil: No se observa enturbamiento en el medio y la puntura de inoculacin es visible.

6.4. PRUEBAS DE IDENTIFICACION CONFIRMATORIA 6.4.1. CARACTERIZACION BIOQUIMICA Se realiza el perfil bioqumico de las colonias sospechosas de ser Yersinia pests aisladas de cultivo. Para el estudio bioqumico se emplean la fermentacin de azcares y decarboxilacin de los aminocidos, entre otras. Son pruebas de identificacin confirmatoria. La muestra apropiada para la realizacin de estas pruebas es solamente cultivo puro. Aunque Yersinia pests, bioqumicamente, es notablemente inactivo, se realizan estas pruebas para su diferenciacin con Yersinia enterocoltica y Y. pseudotuberculoss. Yersinia pestis es oxidasa negativa, catalasa positiva; fermenta la glucosa, xilosa, manitol y usualmente. maltosa. No fermenta lactosa ni sacarosa. Es indol negativo; reduce nitrato; lisina y omitina decarboxilasa negativa; hidroliza la esculina, no as, la rea y gelatina. (Ver Tabla 2) Se debe realizar esta prueba, utilizando simultneamente, controles: Control Positivo: Cepa avirulenta Yersinia pests A1122. Control Negativo: Yersinia pseudotuberculoss I-A.

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Fermentacin de Azcares Se preparan los azcares al 1 % en Caldo de Fermentacin con indicador de Andrade. Se siembra en cada uno de los azcares el cultivo a investigarse y se incuba a 37C durante 24 horas. La coloracin roja indica acidez en el medio (fermentacin del azcar); Yersinia pestis slo fermenta la glucosa, manitol, xilosa y usualmente mal tosa. La persistencia del color del medio (amarillo) indicar la no fermentacin del azcar; Yersinia pestis no fermenta la lactosa ni sacarosa. (Ver Foto 13).

6.4.2. LISIS POR BACTERIOFAGO Se realiza esta prueba cuando se ha obtenido cultivo puro. Las colonias sospechosas de ser Yersinia pestis deben ser procesadas en dos placas de agar sangre de camero al 6%. Es una prueba de Identificacin Confirmatoria. Las clulas de Yersinia pestis son sensibles a ser lisadas por un bacterifago especfico y esta actividad, es dependiente de la temperatura. El bacterifago de Y. pestis, especficamente, lisa su clula husped a temperatura ambiente (2225C) y a 37C. Yersinia pseudotuberculosis, es tambin lisada por el bacterifago slo a 37C. En cada una de las placas de agar sangre, se coloca la tira de papel filtro impregnada con el bacterifago de Yersinia pestis, se estra el cultivo sospechoso a cada lado de la tira, la estra debe ser delgada, aproximadamente, de 5 mm. Asimismo, se deben estriar los controles, Y. pestis A1l22 (Positivo) y Y. peudotuberculosis I-A (Negativo). Una de las placas, se incuba a 37C y la otra placa, se deja a temperatura ambiente durante 24 horas.

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Para la lectura emplee los siguientes criterios: a. Placa de agar sangre incubada a 37C: Tanto Y. pestis como Y. pseudotuberculosis son lisadas por el bacterifago a esta temperatura (hay una zona de inhibicin del crecimiento cerca a la tira del bacterifago). b. Placa de agar sangre incubada a temperatura ambiente: Slo Y. pestis es lisada por el bacterifago. (Ver Foto 14)

Foto 13: Caracterizacin bioqumica de Yersenia pestis empleando el Sistema API29E, mostrando la diferencia de Y. pestis con otros grmenes.

Foto 14: Lisis de Yersenia pestis por bacterifago.

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CAPITULO VII TECNICAS DE ELISA

La tcnica de ELISA, nos permite detectar antgeno (F 1) de Yersinia pestis, as como anticuerpos contra el mismo, en muestras de suero de casos humanos. Prueba que nos permite determinar si se trata de una infeccin reciente o pasada. 7.1. ELISA PARA DETECCION DE ANTICUERPOS CONTRA Yersinia pestis Esta tcnica deber usarse como prueba complementaria a la tcnica de Aglutinacin en Ltex. Mediante esta tcnica se puede detectar Inmunoglobulina G e Inmunoglobulina M, dependiendo de la etapa de la enfermedad. El fundamento de esta prueba se basa en una reaccin antgeno-anticuerpo, la cual, puede visualizarse por la interaccin existente entre la enzima y el substrato. 7.1.1. Materiales necesarios para esta prueba Reactivos de ELISA Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6. Buffer TRIS Salino ms Tween 20 (TBSt), 10X. Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IX TBSt. Conjugado: Inmunoglobulinas (lgG e IGM) unida a la enzima Fosfatasa Alcalina. Substrato: p-nitrofenilfosfato ms Perxido de Hidrgeno al 30%. Solucin de stop: Hidrxido de Sodio 5N. Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL Tips (50 - 200 uL) Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Suero Positivo (1) Suero Negativo (4)

7.1.2. Procedimiento Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL del stock de la fraccin antignica F 1 (4 mg/mL) diluida en 1 :20 en Buffer Carbonato, pH 9. Dejar en refrigeracin (4C) toda la noche o a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. . Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar 50 uL de los sueros problema y controles diluidos en 1 X TBST en las siguientes diluciones: 1: 1 00 Y 1: 1 000 (todas por duplicado). Incubar a 37C durante 1 hora. . Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar 50 uL del conjugado diluido 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt

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Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionar 50 uL de la solucin Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA.

7.1.3. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativo de cada una de las diluciones, con estos clculos, determinar la desviacin estndar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off, ser considerada como Positiva.

El color amarillo significa positividad de la prueba

7.2. ELISA PARA CAPTURA DE IgM ANTI Yersinia pestis Nos permite detectar la infeccin temprana de la enfermedad, mediante la captura de anticuerpo s IgM contra Yeri;nia pestis. Tcnica aplicada a muestras de suero de casos humanos. 7.2.1. Materiales necesarios para esta prueba: Reactivos de ELISA

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Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 Buffer TRIS Salino ms Tween 20 (TBSt), 10X Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IXTBSt Conjugado: Inmunoglobulina (IgM) unida a la enzima Peroxidasa Substrato ABTS: Substrato Peroxidasa y Perxido de Hidrgeno Solucin Stock de la fraccin antignica F 1, 1:200 . Anti -Inmunoglobulina humanaIgM Solucin de stop: Acido Sulfrico 2 M. Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL Tips (50 - 200 uL) Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Suero Positivo conteniendo IgM anti Fl (1) Suero Negativo que no tengan Ig M (4)

7.2.2. Procedimiento Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de anti-inmunoglobulina humana IgM diluida en 1 : 1 00 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeracin (4C) toda la noche a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37C durante l hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de los sueros problema y controles dilu dos en 1 X TBST en las siguientes diluciones: 1: 10 Y 1: 100 (todas por duplicado). Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de F1 (20 mglmL) dilido en 1 X TBSt. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL del conjugado diluido 1:4000 en TBSt. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionar 50 uL de la solucin Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA.

7.2.3. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las diluciones, con estos clculos determinar la desviacin estndar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off ser considerada como Positiva.

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El color verde indica positiva de la prueba.

7.3. ELISA PARA CAPTURA DE ANTIGENO (FI) DE Yersinia pestis

Tcnica que permite dar un diagnstico temprano de la infeccin de Peste y para la cual, se utiliza anticuerpos monoclonales que permiten la captura de la fraccin antignica (F 1) de Yersinia pestis. Igualmente, es aplicada a muestras de sueros de casos humanos.

7.3.1. Materiales necesarios para esta prueba Reactivos de ELISA Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 ms lnmunoglobulinas anti F1 Buffer TRIS Salino ms Tween 20 (TBSt), 10X Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en 1X TBSt Protena P purificada FI (Monoclonal) Conjugado: Inmunoglobulinas IgG e IgM unidas a la enzima Fosfatasa A1calina Substrato: p-nitrofenilfosfato ms Perxido de Hidrgeno al 30% Solucin Stock de la fraccin antignica FI (4mg/mL) Solucin de stop: Hidrxido de Sodio 5N. Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 Ul Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL

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Tips (50 - 200 uL) Lector de ELISA Lavador de microplacas para ELISA Computadora e impresora Controles: Control Positivo, suero negativo ms F1 Control Negativo, sueros negativo Control Inhibicin FI, suero negativo diluido 1:50 con Inmunoglobulinas Anti F1 Control Buffer de Inhibicin, 1X TBSt diluido 1:50 con Inmunoglobulinas Anti F1

(2) (4) (2)

7.3.2. Procedimiento a. Sensibilizacin de las placas Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de Inmunoglobulina de conejo anti F1 diluida en 1:2000 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeracin (4C) toda la noche. Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37C durante 1hora.

b. Preparacin de Controles - Control Positivo Fl: Un suero humano negativo conocjdo (1:10 en IX TBSt). Hacer diluciones en tubos con la solucin stock de F I en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los seis tubos 0.5 mL del suero negativo 1:10, agregar, al primer tubo 50 uL del stock de F 1 Y mezclar bien por tres veces, de ste, coger 50 uL y agregar al segundo tubo; y as sucesivamente, hasta el sexto, descartando los ltimos 50 uL. - Control Inhibicin Fl: Un suero humano negativo conocido (1:10) diluidos 1:50 con Inmuno-globulina de Conejo anti FI (Buffer de Inhibicin). Hacer diluciones en tubos con la solucin stock de FI en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los seis tubos 0.5 mL del suero negativo 1:10 con el buffer de inhibicin, agregar al primer tubo 50 uL del stock de F1 y mezclar bien por tres veces, de ste coger 50 uL y agregar al segundo tubo y as sucesivamente hasta el sexto, descartando los ltimos 50 uL. Agregar 50 uL de los sueros diluidos en cada pocillo de las secciones de la microplaca destinadas tanto al Control Positivo como Control de la Inhibicin FI. - Control Suero Positivo: Un suero humano positivo de ttulo conocido. - Control Suero Negativo: Cuatro sueros humanos negativos conocidos. c. Aplicacin de muestras e incubacin y lavado de las muestras Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con IX TBSt. Dividir la placa para cada muestra problema como para los controles negativos en dos columnas de 2 pocillos (4 pocillos por muestra). A los dos pocillos de la primera fila, agregar 50 uL de 1 X TBSt ya los dos pocillos de la segunda fila,

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agregar 50 uL del Buffer de Inhibicin FI, agregar 5 uL del suero a los 4 pocillos (1 : 10). De tal manera, que se tendr 2 pocillos para detectar la presencia del antgeno F1 y 2 pocillos para la inhibicin de FI (verifica especificidad de la prueba). Se pueden trabajar 16 muestras problema por placa.

M = Muestra de suero problema

Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar, 50 uL del monoclonal diluido en TBSt en 1 :2000. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar, 50 uL del conjugado diludo 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37C durante 1 hora. Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente duran te 30 minutos. Adicionar 50 uL de la solucin Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELlSA.

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d. Lectura Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las diluciones. Con estos clculos determinar la desviacin estndar y luego multiplicarla por 3 para determinar el cut-off. Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cutoff, ser considerada como Positiva.

El color amarillo indica positividad de la prueba.

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CAPITULO VIII INOCULACION EN RATON

La inoculacin en ratn, es una prueba que se realiza para la recuperacin de Yersinia pestis, permitiendo determinar la patogenicidad del agente etiolgico. En el laboratorio, la inoculacin en ratn, no es un procedimiento de rutina. Slo se usa cuando se tiene muestras de rganos y/o cultivos contaminados para la recuperacin d Y. pestis, as como para determinar su presencia en las pulgas. 8.1. Muestras apropiadas Organos contaminados Cultivos contaminados Pulgas

8.2. Materiales necesarios para esta prueba Yersinia pestis A 1122 (cepa avirulenta) Bioterio Jaulas para ratones Bebedores para ratones Cabina de flujo laminar tipo 2 Ratones de 45 das Jeringa de tuberculina descartable Aguja N 25 Solucin salina estril Algodn Alcohol de 700

8.3. Procedimiento 8.3.1 Suspensin de la muestra Dependiendo del tipo de muestra, se realiza una suspensin homognea en solucin salina estril. a. Organos: Homogenizar la muestra con arena estril, agregndole, suero fisiolgico estril. b. Cultivo Contaminado: Si el cultivo se encuentra en placa de agar sangre, se realiza una suspensin homognea de las colonias con 1 mL de suero fisiolgico estril. Si el cultivo se encuentra en caldo BHI, tomar 0.1 mL de ste y dilur con 0.9 mL de suero fisiolgico estril. c. Pulgas: Hacer un macerado de las pulgas con arena y suero fisiolgico estriles. 8.3.2 Inoculacin En la cabina de flujo laminar, preparar la suspensin a inocular y absorber con la jeringa de tuberculina 0.5 mL de esta suspensin. En el cuarto de inoculacin, proceder a la desinfeccin con alcohol de la parte

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abdominal de los ratones a inocular (2 ratones por muestra problema y 2 ratones para la cepa avirulenta). Inocular va sub-cutnea 0.1 - 0.2 mL de la suspensin homognea a cada ratn. De igual manera, proceder con los ratones controles.

8.3.3 Observacin, Control y Cofirmacin Observar, diariamente, el estado de los ratones inoculados. Deben controlarse durante 21 das despus de la inoculacin. Entre los primeros tres a cuatro das despus de la inoculacin, los ratones empiezan a estar moribundos, y finalmente, fallecen por diseminacin de la infeccin. En la cabina de flujo laminar, realizar biopsia de los rganos afectados, hgado y bazo para realizar las pruebas de Inmunofluorescencia Directa, cultivo y pruebas de identificacin confirmatoria de Y. pestis.

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CAPITULO IX NORMAS DE BIOSEGURlDAD

El error humano y las prcticas impropias de laboratorio pueden comprometer las mejores medidas de proteccin, por ello, es indispensable que cada laboratorio adopte un cdigo de prcticas apropiadas a su trabajo y que todo el personal lo observe estrictamente. El personal de laboratorio est expuesto a un mayor riesgo de contaminacin que otros trabajadores. La mayora de las infecciones adquiridas en el laboratorio pueden atriburse a uno o varios de los siguientes procedimientos peligrosos comunes: Procedimientos que generan riesgos de inhalacin; por ejemplo, al sembrar placas de agar, emplear pipetas, centrifugar, homogenizar, flamear asas, abrir cultivos. Procedimientos que generan riesgos de ingestin; por ejemplo, el pipetear con la boca, manipulacin de muestras, hacer frotis y cultivos. Procedimientos relacionados a la eliminacin de material infeccioso.

El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deber manejarse con gran cuidado usando mandil, guantes y mascarilla, pues gotas minsculas pueden causar infeccin por va respiratoria de otras personas y la propagacin de la Peste Neumnica. Todos los procedimientos para el diagnstico de Peste, deben ser trabajados en cabina de flujo laminar Tipo 2, lo que implica la adopcin obligatoria de las siguientes medidas: El personal de laboratorio debe tener una capacitacin en las tcnicas de laboratorio para el diagnstico de Peste. No se debe pipetear material infeccioso con la boca (suero, muestras, cultivos ). No se permitir comer, beber, fumar, almacenar alimentos ni aplicarse productos de tocador en el sector de los trabajos de laboratorio. El laboratorio siempre estar ordenado, limpio y libre de todo el material que no sea pertinente a los trabajos. Las mesas de trabajo sern descontaminadas antes y despus de haber procesado las muestras. Todas las personas debern lavarse antes y despus de manipular material infeccioso y tambin al salir del laboratorio. Todos los procedimientos se realizarn cuidadosamente a fin de reducir al mnimo la formacin de aerosoles. Para evitar la formacin de stos, se puede utilizar un frasco de boca ancha conteniendo arena estril y fenol al 5% o alcohol de 70. En todos los procedimientos que obliguen al contacto directo con el material infeccioso, el personal de laboratorio, deber llevar mandil, guantes y mascarilla. Mientras se llevan a cabo los trabajos, las puertas del laboratorio permanecern cerradas. Cualquier derrame peligroso, accidente o exposicin manifiesta o potencial a material infeccioso se notificar al jefe de laboratorio y se proceder a descontaminar el rea del accidente de inmediato. El jefe de laboratorio garantizar que solamente tengan acceso al laboratorio las personas a quienes se les han advertido los posibles riesgos y estn debidamente protegidas.

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CAPITULO X REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.

BAHMANYAR M., and CAVANAUGH D. C. (1976). Plague Manual. Organizacin Mundial de la Salud, Ginebra. 76 pp. CAMPBELL GL and HUGHES 1M. (1995). Plague in India: A new warning from an old Nemsis. Annals ofInternal medicine, 122(2): 151-153. CHU C. M. (1995). Gua para Diagnstico de Peste (en prensa). Bacterial Zoonoses Branch. Diagnostic and Reference Section. Division ofVectorBorne Infectious Diseases. Centers for Disease Control and Prevention. Fort Collins, Colorado. CLARK W.A., HOLLIS D.G., WEAVER R.E., and RILEY P. (1984). Identification ofunusual pathogenic gram-negative aerobic and facultatively anaerobic bacteria. U.S. Departament of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta. pp: 311-329. LENNETTE E., BALOWS A., and HAUSLER W. (1987). Manual de Microbiologa Clnica 4ta. Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, 1370 pp. LYAMUYA E.F., NYANDA P., MOHAMMMED A.H. and MHALU F.S. (1992). Laboratory studies on Yersinia pestis during the 1991 outbreak of Plague in Leshoto, Tanzania. loumal of Tropical Medicine and Hygiene. 95: 335-338. MARSHALL 1.D., MANGIAFICO 1.A., and CAVANAUGH D.C. (1992). Comparison ofthe reliability and sensitivity ofthree serological procedures in detecting antibody to Yersinia pestis. American Society for Microbiology. Aplied Microbiology. 24: 202-204. ORGANlZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1993). Mtodos Bsi cos de Laboratorio en Bacteriologa Clnica.OMS, Ginebra. 50 pp. Plague in India: A new warning from an old Nemesis. Annals ofInternal Medicine. 122 (2) : 151-153.

2.

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10. SONNENWIRTH A. and JARETT L. (1983). GRADWOHL Mtodos y Diagnsticos del Laboratorio Clnico. 8va. Ed. Editorial Mdica Panamericana, Mxico, pgs. 1594-1701. 11. WILLIAMS J.E., ARNTZEN L., TYNDAL G.L., and ISAACSON M. (1986). Application of enzyme immunoassays for the confirmation of clinically suspect plague in Namibia, 1982. Bulletin of the World Health Organization; 64 (5): 745-752. 12. WYNGAARDEN J.B. and SMITH Ll. H. (1987). CECIL Tratado de Medicina Interna. 17va. Ed. Nueva Editorial Interamericana, Mxico. Vol. 11, pgs. 1786-1789.

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CAPITULO XI (ANEXOS)

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ANEXO 1 DEFINICIONES DE CASOS DE PESTE SEGUN EL LABORATORIO

Para la definicin de casos, por laboratorio, en humanos y especmenes animales se deben tener en cuenta los criterios dados por la Organizacin Mundial de la Salud: Un caso es diagnosticado como PRESUNTIVO de Peste, si rene uno o ambos de las siguientes condiciones: Si las muestras dan resultado positivo a la prueba de Inmunoflurescencia Directa. Si s610 CI1 una muestra de suero, se obtiene por la prueba de Aglulinacin por Llex resultados positivos > 1: 10 para casos humanos y 1: 128 para especmenes animales (Tiras NOBUTO).

Un caso es determinado como CONFIRMADO de Peste, si cumple una de las siguientes condiciones: Si, adems de Inmunofluorescencia Directa Positiva se aisla e identifica Y pestis mediante caracterizacin bioqumica y lisis por bacterifago. Si, dos muestras de suero obtenidas en tiempos apropiados, demuestran mediante la prueba de Aglutinacin por Ltex, una diferencia de cuatro ttulos con respecto al ttulo de la primera muestra. En pacientes sin antecedentes de vacunacin ni exposicin, se obtiene, en una sola muestra de suero, por la prueba de Aglutinacin por Ltex, resultado positivo con un ttulo> 1: 128.

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CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DIRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara Lima 11 Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443

ANEXO N 2 FICHA DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE

CODIGO N .................. NOMBRE: ........................................................................................................................... EDAD:............................................................... ..............SEXO: M ( ) F ( ) PROCEDENCIA: Dpto: ..................................... ..Provincia: ........................ Distrito: .................................. ..Casero:.......... DIRECCION: ...................................................... ..Ocupacin: ...................... Estado actual: Sano ( ) Fecha de alta:... /.... /..... Fallecido ( ) Enfermo ( ) Fecha inicio snt. : ....... /..... /..... Fecha de defuncin: .... /..... /.....

Bubn: SI ( ) NO ( ) Localizacin:..................... .Tamao: ....... Neumona: ( ) Septicemia: ( ) Otro: ............................................. Recibi tratamiento: SI ( ) NO ( ) Fecha Inicio: ... /... /... Cul:.................................................................................................................................... Dosis:........................................................ ..................Tiempo: ....................................... DIAGNOSTICO CLINICO: ..............................................................................................................................................

MUESTRA:

Aspirado de bubn () Esputo () Hgado () Ganglio Linftico () Fecha de obtencin de la muestra: ...../ ...../..... Fecha de envo de la muestra: ............/ ...../..... Examen solicitado: IFA () Confinnacin ( )

Hemocultivo Suero Bazo

() () ()

Cultivo () Serologa ( )

Fecha de recepcin: ..... l ..... l.:... Nombre del remitente: .......................................................................................................... ............................................................. Firma Establecimiento de Salud: .. ................................................................... ...... ..................................................................................................................................................

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ANEXO 3 SOBRE DE ENVIO DE TIRAS DE NOBUTO (ANIMALES) Cdigo ............................................................................. Fecha de ......../......./......... Animal ....................................................... Coleccin.................................................................

Nombre: ............................................................................................................................................................ ...........................................................................................................................................................................

Sexo (M) ( F ) PROCEDENCIA Localidad.................................................. Provincia .................................................. DESCRIPCION DEL LUGAR

Edad (Joven, adulto) ...............................................

Distrito........................................................... Departamento................................................

.......................................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................................... NOMBRE DEL COLECTOR: Epizoota ( ) DIRECCION : ........................................................................................................................................................................... Ectoparsitos ( )

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CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DlRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara Lima 11 Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443

ANEXO N 4 FICHA PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE EN ANIMALES

CODIGO N .......................................................... NOMBRE DEL COLETOR :..................................FECHA: .1...l..... PROCEDENCIA: Opto:............................................................ Provincia: .......................................... Localidad..................................................... Casero:................... Nombre vulgar del animal: ............................................................................................................................. Sexo:............................................................ Peso:................................................... Aspecto del pelamen del cuerpo: Ventral: ............................................................................................. Dorsal: .............................................................................................. Aspecto del pelamen de la cola: Ventral: .............................................................................................. Dorsal: ............................................................................................... Aspecto del pelamen de la cabeza: ............................................................................................................... Biometra: L.O. ................ mm L.C.mm L.P. ................ mm L.T..mm Condicin del espcimen: Vivo ( ) Muerto ( ) Capturado en: Vegetacin primaria ( ) Vegetacin secundaria ( ) Domicilio ( ) Peridomicilio ( ) Examen clnico: Bubn SI ( ) NO ( ) Localizacin: ............................................................... MUESTRA: Aspirado de bubn ( ) Ndulo linftico ( ) Animal entero ( )

Tamao: .................................................. Sangre ( ) Hgado ( ) Bazo ( ) Crneo ( ) Cultivo ( ) Pulgas ( )

Frotis: Si ( ) No ( ) F. de envo......./...../....... Fecha de obtencin de la muestra ...... l..... 1..... Fecha de recepcin de la muestra ......1 .... 1..... Nombre del remitente: ................................................................................................................................ Firma:........................................................................................................................................................... Nombre del Establecimiento de Salud: .....................................................................................................................................................................................

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ANEXO N 5 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

5.1. MEDIOS DE CULTIVO 5.1.1 MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY-BLAIR

Ingredientes
Trioglicolato de sodio 1.5 g Fosfato disdico 1.1 g Cloruro de sodio 5.0 g Agar 5.0 g Agua destilada 991.0 mL pH 8.4. Ajustar usando solucin de NaOH ION

Preparacin
Disolver los ingredientes en agua destilada en bao Mara calentando hasta que la solucin se aclare (no se deje hervir). Una vez, enfriada la preparacin a 50C, aadir 9 mL de solucin de cloruro de calcio al 1% recin preparada y ajustar el pH a 8.4 (con hidrxido de Sodio ION). Distribuir cantidades de 5 mL en tubos limpios y esterilizados de 13x100 con tapa de rosca dejando un pequeo espacio de aire en la parte superior y con las tapas sin enroscar. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos, dejar enfriar y ajustar las tapas. De no contar con tubos se puede emplear frascos tipo penicilina con tapa de jebe. 5.1.2. MEDIO BIFASICO PARA HEMOCULTIVO CON SPS (RCS) A. Fase Slida: Agar Infusin Cerebro Corazn o Agar Tripticasa de Soya ms 1% Agar Ingredientes: Infusin de cerebro de ternera Infusin de corazn de vacuno Peptona proteosa Dextrosa Cloruro sdico Fosfato sdico dibsico Agar Agua destilada pH 7.4 0.2

200.0 g 250.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 15.0 g 1000.0 mL

Preparacin Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensin homognea. Calentar con agitacin continua hasta la ebullicin para disolver completamente. Medir pH 7.4 0.2 Repartir 25 mL del medio en frascos de 100 mL 15 mL del medio en frascos de 60 mL con tapa de algodn. Autoclavar a 121C por 15'. Al da siguiente, autoclavar nuevamente a la misma temperatura y tiempo. Inclinar los frascos sobre una de las paredes del frasco y dejar que se solidifique el medio en plano inclinado.

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B.

Fase Liquida: Caldo Infusin Cerebro Polianetolsulfonato de Sodio (SPS).

Corazn,

1%

Gelatina

0.025%

Ingredientes: Infusin de cerebro de ternera 200.0 g Infusin de corazn de vacuno Peptona proteosa 250.0 g Dextrosa 10.0 g Cloruro sdico 2.0 g Fosfato sdico dibsico 5.0 g Agua destilada 1000.0 mL pH 7.4 0.2

Preparacin - Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensin homognea. Disolver al calor a 50C. Repartir 30 mL 20 mL del medio (dependiente de la capacidad de frascos de cultivos a usarse: 100 60 mL) en tubos taparoscade20xl50. MedirpH 7.4 0.2. Autoclavar a 121C por 15 minutos. - Al da siguiente, autoclavar, nuevamente, a la misma temperarura y tiempo. C. Mezcla de la Fase Slida y Liquida Vertir, en forma estril, la fase lquida en el frasco que contiene la fase slida. Finalmente, taponar usando tapones de jebe estriles tipo penicilina. El medio bifsico preparado se controla durante una semana a una temperatura de 37C Y a temperatura ambiente hasta completar 20 das. Al trmino del control, colocar el precinto al frasco.

5.1.3. AGAR SANGRE AL 6% Ingredientes A. Medio Base: Agar Base de Sangre (BAB) Composicin: - Infusin de carne corazn - Triptosa - Cloruro de Sodio - Agar - Agua destilada pH 6.8 0.2

500.0 g 10.0 g 5.0 g 15.0 g 1000.0 mL

B. Sangre de cordero desfibrinada 60.0 mL Preparacin Suspender 40 g del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y calentar agitando, frecuentemente, hasta que hierva durante un minuto para disolver completamente el polvo. El pH final debe ser 7.3 :!: 0.2. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 45-50C, aadir en forma asptica 60 mL de sangre desfibrinada de carnero, agitar para obtener una mezcla uniforme y repartir 20 mL en placas petri estriles. Controlar su esterilidad durante 24 horas a 37C.

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5.1.4. CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON Ingredientes - Infusin de cerebro de ternera - Infusin de corazn de vacuno Peptona proteosa - Dextrosa - Cloruro sdico - Fosfato sdico dibsico - Agua destilada pH 7.4 0.2

200.0 g 250.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1000.0 mL

Preparacin Suspender 37 gramos del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para que se disuelva por completo el polvo. El pH final debe ser 7.4:f: 0.2. Distribuir 8 mL del medio en tubos tapa rosca de 16 x 125. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Controlar la esterilidad del medio durante 24 horas a 37C.

Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los ingredientes se disuelvan completamente.

B. Indicador de Andrade al 1% Ingredientes: Fucsina Acida Hidrxido de Sodio 1 N Agua destilada

5.0 g 160.0 mL 1000.0 mL

Preparacin Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada. Guardar en frasco color mbar en refrigeracin (4C) hasta el momento de ser usado. 5.1.5. MEDIO DE MOVILIDAD

Ingredientes Extracto de carne Peptona Cloruro de Sodio Agar Agua destilada pH 7.4:f: 0.2 2.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 1000.0 mL

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Preparacin Disolver los ingredientes en los 1000 mL de agua destilada, mezclar bien. Calentar y hervir por un minuto. El pH final debe ser 7.4 0.2. Repartir 3 mL del medio preparado tubos tapa rosca de 13 x 100. Esterilizar a 121C por 15 minutos.

5.1.6. MEDIO DE FERMENTACION DE AZUCARES A. Caldo Base Ingredientes: Peptona Extracto de carne Cloruro de Sodio Agua destilada

6.0 g 1.8 g 3.0 g 600.0mL

Preparacin Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los ingredientes se disuelvan completamente. B. Indicador de Andrade al 1 % Ingredientes: Fuesina Acida Hidroxido de sodio 1N Agua destilada

5.0 g 160.0 mL 1000.0 mL

Preparacin Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada. Guardar en frasco color mbar en refrigeracin (4 C) hasta el momento de ser usado.

C. Azcares al 1 % Glucosa Maltosa Sacarosa D. Preparacin Aadir, al caldo base preparado 6 mL del Indicador de Andrade. El medio debe quedar incoloro. El pH del medio debe ser 7.1 - 7.2. Dispensar 100 mL del medio preparado en cada uno de los balones o matraces y aadir l g del azcar a preparar. Disolver con calor y distribuir 2 mL en tubos de 12 x 75. Autoclavara 121C por 10 minutos. Salicina Lactosa Manitol

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5.2. REACTIVOS

5.2.1. OXIDASA

El reactivo de oxidasa es txico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del contacto directo. 5.2.1.1 Mtodo 1 Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada. Lectura Prueba Positiva: Coloracin rosada. 5.2.1.2 Mtodo 2 - Reactivo A: Disolver 0.1 g de Alfa Naftol en 10 mL de alcohol etlico 95. - Reactivo B: Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada. - Lectura Prueba Positiva: Coloracin morada. - Los reactivos deben colocarse en frascos color mbar y guardarse entre 4 y 8 C no ms de una semana; por eso, se recomienda no preparar ms de 2 mL. 5.2.2. BUFFER FOSFATO SALINO (PBS)

Ingredientes NaCI Na2HP04 KH2P04 Agua destilada 7.65 g 0.724 g 02.1 g 1000.0 mL

Preparacin Disolver en el agua destilada los ingredientes. Ajustar pH a 7.2 0.2 con NaOH 1N.

5.2.3. BUFFER FOSFATO SALINO GELATINA Ingredientes

A. Solucin A NaH2P04 0.05M Na CI 0.1% Agua destilada 1000 mL pH 6.6 0.2. Ajustar usando solucin de NaOH 10N

B. Solucin B Gelatina Agua destilada 2% 100 mL

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Preparacin Mezclar los ingredientes de la solucin A y agitar constantemente hasta obtener una solucin homognea. Mezclar los ingredientes de la solucin B, disolver con calor y hacer hervir durante un minuto para diluir bien la solucin. Mezclar las soluciones A y B, tomando 800 mL de la primera y los 100 mL de la segunda. A esta mezcla adicionar 100 mL de agua destilada. Autoc1avar a 121 DC durante 15 minutos. Repartir el buffer fosfato salino gelatina junto al mechero en frascos de 100 mL con tapa rosca.

5.2.4. BUFFER BORATO Ingredientes Soluciones Stock

Cloruro de Sodio Acido Brico Hidrxido de Sodio

C1Na H3BO3 NaOH

1.5M 0.5M 1.0M

(87.66g/L) (30.92g/L) (40.00g/L)

Preparacin Solucin A En un baln de 2000 mL, mezclar 80 mL de CINa 105M, 100 mL de H3B03 O.5M, 24 mL de NaOH 1M y 796 mL de agua destilada, haciendo un volumen de 1000 mL.

Solucin B (Buffer de ajustamiento)

En un baln de 125 mL, mezclar 5 mL de NaCI 1.5 con 70 mL de H3B03 0.5M. A la solucin A aadir 2-3 mL de la solucin B, mezclar bien. Ajustar pH. Seguir aadiendo la solucin B hasta encontrar el pH final (8.0) del buffer. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Aadir 1 g de NaN3 (Azida de Sodio). Guardar en refrigeracin a 4C. 5.2.5. FENOL ACUOSO AL 5% El cido fnico es txico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del contacto directo: Ingredientes Acido Fnico (cristales) Agua destilada Preparacin Solucin Stock

1Kg 100mL

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Al kilogramo del cido fnico, se agrega 100 mL de agua destilada y se calienta en bao Mara, obtenindose 1,100 mL de Fenol Acuoso.

Solucin de Trabajo Se toma 55 mL de la solucin stock de fenol acuoso y se completa con 945 mL de agua destilada, obtenindose 1000 mL de Fenol Acuoso al 5%. El cual, se conserva en un frasco mbar.

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ANOTACIONES

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Esta publicacin se trmino de imprimir en diciembre de 1997 en los Talleres Grficos de Art. Lautrec S.R.Llda. Av. Paseo de la Repblica 731 - Lima 13 - Tel/Fax: 4237616

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