Criopreservacin de semen de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) en el programa de mejoramiento gentico de truchas en Ecuador

Mara Vsconez (1), Juan Ortiz (2), Juan Giacometti (2)

(1)

Departamento de Ciencias de la Vida, Ingeniera en Biotecnologa, Escuela Politcnica del Ejrcito, Sangolqu, Ecuador.
(2)

Laboratorio de Acuicultura y Recursos Bioacuticos, Escuela Politcnica del Ejrcito, Sangolqu, Ecuador.

RESUMEN
Se evaluaron cinco medios para crioconservar semen para trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y semen de truchas reversadas, con el objetivo de alcanzar el mayor porcentaje de fertilizacin. Las tcnicas utilizadas permitirn el ahorro de espacio (infraestructura) para el mantenimiento de reproductores machos, as como la facilidad de manipulacin y transferencia de genotipos especficos. Adems se analiz la eficacia de la reversin sexual de la hormona 17 metiltestosterona suministrada en el alimento a los alevines para obtener truchas reversadas. Para el anlisis de los porcentajes de fertilizacin, el mejor medio de crioconservacin fue el tratamiento B, que contena glucosa y metanol al 10% como crioprotector. El porcentaje de fertilizacin obtenido con dicho medio fue del 69.25%. La congelacin del semen se realiz manteniendo las pajuelas 10 cm por encima del nivel del nitrgeno lquido durante 10 minutos, y descongeladas a 37C por 60 segundos. De 225 ejemplares que se sacrificaron y que fueron alimentados con hormona para reversin sexual, 9 peces no formaron conducto gonadal, concluyendo que stos son neomachos formados. Con la baja cantidad de peces reversados, es necesaria la complementacin de la tcnica con la inmersin de los alevines en la hormona. La temperatura durante los procesos organognicos fue un factor importante, ya que a 11C en 22 das los vulos pasaron a estado de neurula, mientras que a 15C en 23 das pasaron a fase de embrin. Cabe destacar que el tratamiento A, que contena cloruro de sodio, cloruro de potasio, glucosa, bicarbonato de calcio y metanol al 10%, tuvo un menor ndice de mortalidad, siendo ste un factor vital para obtener altos porcentajes de fertilidad. Palabras calves: criopreservacin, reversin sexual, neomachos.

ABSTRACT
Five extenders to cryopreservate semen of trout (Oncorhynchus mykiss) and semen of neomacho were evaluated with the aim to achieve the best percentage of fertilization. The techniques used will save space (infrastructure) for the maintenance of breeding males, ease of handling and transfer of specific genotypes. Also, we examined the efficacy of the 17 -methyltestosterone hormone sexual reversion supplied in the food to the fishes in order to raise neomachos. For the analysis of fertilization rates, the best extender of cryopreservation was treatment B, which contained glucose

and methanol 10% as cryoprotectant. The fertilization rate obtained with this extender was 69.25%. The freezing of the semen was performed by keeping the straws 10 cm above the liquid nitrogen for 10 minutes, and thawed at 37C for 60 seconds. From 225 specimens which were sacrificed and feeded with the hormone for sex reversal, only 9 of them did not formed gonadal ducte. Concluding that these were the neomachos formed. With this low quantity of reversed fish, it becomes necessary to supplement the reversion with the immersion of the fishes in the hormone. The temperature during the organogenics process was an important factor, because at 11 C after 22 days the eggs changed to stage of neurula, whereas at 15 C after 23 days they changed to embryo stage. Moreover, the extender A, containing sodium chloride and potassium chloride, glucose, calcium bicarbonate and methanol 10%, was suitable for the parameter of mortality, being, as well, a vital factor for getting high fertility rates. Keys words: cryopreservation, sexual reversion, new male.

INTRODUCCIN
La produccin de trucha arco iris en Ecuador se ha desarrollado en los ltimos diez aos en la regin interandina con una produccin estimada de 1200 t. anuales. Cabe recalcar, que el Ecuador tiene 209 criaderos, de los cuales el 92 % se encuentra operando activamente. Los 12 criaderos ms grandes rinden entre 80 y 150 t. ao, el resto tienen un promedio de 30 t. y los artesanales < a 5 t. Las producciones estimadas al 2010, contribuyen al mejoramiento de vida de los habitantes de estas regiones por la calidad de protena suministrada (Idrovo, 2008; Ortiz, 2008). Para obtener una buena produccin y disminuir los ciclos de cultivo, la especie a cultivarse debe poseer caractersticas productivas importantes como: tasas de crecimiento competitivas, tolerancia a altas densidades de carga animal, resistencia a enfermedades y mercado estable. En varios estudios demuestran que truchas hembras y estriles son ideales para el cultivo. De esta manera, criar hembras en altos porcentajes es el objetivo en un plantel de reproductores, sin embargo es vital mantener machos como material gentico para la reproduccin (Blanco, 1995). En Ecuador no existen planteles de reproduccin que oferten pies de cra con caracteres especiales (hembras o poliploides) y por ende se importa aproximadamente 8 millones de ovas anualmente. La industria acucola Chilena , que es la ms poderosa de la regin, demuestra desde el 2007, que por ingreso de ovas infectadas por ISA e IPN de salmn rosa, ha provocado prdidas por cientos de millones de dlares, as como la inestabilidad laboral para miles de personas. De esta manera, es importante crear la oportunidad de desarrollar estas tecnologas a nivel local, y evitar riesgos en la seguridad sanitaria para la piscicultura continental ecuatoriana. Mediante tcnicas de feminizacin con el uso de hormonas esteroidales, y manipulacin cromosmica se pueden obtener individuos hembras en altos porcentajes y poliploides de caractersticas ideales para crianza. La masculinizacin de hembras permite obtener machos homogamticos (XX), los cuales se comportan fenotpicamente como machos y genotpicamente siguen siendo hembras. El semen de estos machos funcionales es utilizado para fertilizar ovas normales, permitiendo que la descendencia sea 100% hembras, los cuales pueden consumirse sin restricciones y ser utilizados en programas de reproduccin (Bastardo et al., 2003).

Bajo este criterio el desarrollo de grupos de peces mejorados, marcan diferencias productivas, las mismas que con tecnologas acopladas como la crioconservacin de gametos sexuales, permiten el desarrollo de pequeos proyectos en regiones distantes. La crioconservacin de semen en peces, constituye una alternativa biotecnolgica til para el almacenamiento de gametos por tiempo indefinido, facilitando el cruce entre peces mejorados, as como para programas de conservacin de especies en peligro de extincin evitando cualquier deterioro gentico en los gametos manipulados (Medina et al., 2005). En las ltimas dcadas se reportan investigaciones donde se analizan distintos procedimientos para la crioconservacin de espermatozoides con varias especies, tomando en consideracin puntos crticos relacionados a los porcentajes de fertilidad, manejos de temperaturas de congelacin y descongelacin (Guarnizo et al., 2007). La crioconservacin de semen de machos normales y neomachos, incidir significativamente en los costos operativos, ahorro de alimento balanceado, liberacin de infraestructura y cruzamiento planificado entre grupos de reproductores (Ortiz, 2008). Bajo estas consideraciones, el presente estudio pretende realizar un anlisis bibliogrfico y prctico de los tratamientos viables para la reversin sexual de hembra normales, as como los procesos de crioconservacin, en truchas reversadas (neomachos) y truchas normales.

MATERIALES Y MTODOS
Descripcin de la zona de estudio El trabajo de investigacin se realiz en el laboratorio de Acuacultura y en las instalaciones de Acuacultura (Pailones) de la Carrera de Ciencias Agropecuarias, IASA, Hacienda el Prado. Su ubicacin geogrfica est en la Provincia de Pichincha, cantn Rumiahui, parroquia San Fernando, a 78 24 44 (Oeste) y 0 23 20 (Sur) a una altitud de 2748 msnm. Trabajos complementarios como recoleccin de vulos maduros de hembras reproductoras de trucha arco iris se desarrollaron en Tru-unin ubicado en el cantn Cayambe, a 2827 msnm 0 00 41 (Norte) y 78 08 25 (Oeste) (Figura 1).

Figura 1. Proyecto de crianza de trucha arco iris ESPE Pailones.

Reversin Sexual Para la reversin sexual de los alevines de trucha se utiliz 60 mg de la hormona 17 -metil testosterona (SBS M7252 solid photosensitive) diluida en 700 ml de alcohol al 96 % por cada kilogramo de alimento balanceado. Se utiliz 5 kg de alimento Biomix para la alimentacin de 475 alevines durante 3 meses. Adems se trabaj con 475 peces previamente tratados con la hormona de transformacin en el mes de octubre del 2008.

Figura 2. Diagrama de flujo de los procedimientos de crioconservacin de semen de trucha macho y neomacho.

Extraccin del semen de machos normales Se utilizaron reproductores del Proyecto Pisccola Pailones. Para tranquilizarlos y manipularlos fueron sumergidos en una solucin de 100 ppm de aceite de clavo durante 3 a 5 minutos, se hicieron masajes abdominales para recolectar muestras de semen en envases plsticos estriles. Finalmente se guardaron las muestras dentro de un contenedor trmico con hielo a -4C para transportarlos al Laboratorio de Acuicultura del IASA. Extraccin del semen de neomachos o hembras masculinizadas Los ejemplares de trucha reversada fueron sacrificados. Las vsceras y gnadas se pesaron. Los testculos fueron almacenados en cajas estriles, a -4C y llevados al laboratorio. Para el macerado de los testculos se prepar una solucin salina, con 132g de glucosa, 20 g de KCl en 2L de agua destilada. Los testculos fueron sumergidos en la solucin anterior durante 1 hora y se utiliz el sobrenadante. Preparacin de medios de conservacin y congelamiento Los medios utilizados fueron correctamente esterilizados en el autoclave (Harvey Sterile Max). El semen de los machos normales y de los neomachos fue diluido en una relacin 1:3 (semen: medio). En la tabla 1, se muestra la composicin de cada medio y sus caractersticas.

Tabla 1. Descripcin de los medios de crioconservacin empleados para el semen normal y de neomacho. Medio NaCl A A2 B C D mg 622.5 NaHCO3 mg 166 146 KCl mg 31.5 575.2 780 Descripcin Glucosa mg 83 73 5600 4870 5200 Agua Destilada 100 100 100 100 100 pH 8.5 8 7 7 8 Metanol 10% 10% 10% 10% 10%

El semen fue llenado en pajuelas (Minitub) de 0.5mL, absorbiendo la dilucin preparada con el extremo sellado de la pajuela. Luego se sellaron las mismas con una pinza caliente. Antes de colocar las pajuelas en el tanque del nitrgeno (Accelerated Genetics), se estabiliz la temperatura durante 5 minutos a -4C, figura 9. Para finalizar se colocaron las pajuelas dentro del termo de nitrgeno, diez centmetros arriba del nivel de nitrgeno lquido durante diez minutos y posteriormente se introdujeron lentamente las pajuelas dentro del termo. Todo este proceso fue realizado dentro de la cmara de flujo laminar (ESCO) para evitar la contaminacin de las muestras de semen y de los medios de crioconservacin. Grado de movilidad global La movilidad fue divida en tres grupos, mviles, semi-mviles e inmviles. Fue estimada en porcentaje, 10 espermatozoides y fueron clasificados segn el grado de movilidad y contados dentro un campo de 40X, del microscopio ptico binocular (Olympus). Tiempo de Activacin Para la determinacin del tiempo de activacin se cronometr el tiempo transcurrido desde el momento en que se activaron los espermatozoides, con solucin salina de cloruro de sodio al 0.8%, hasta la inmovilidad del 90% de los espermatozoides; observando en el lente de 40X. Concentracin Espermtica Se realiz una dilucin 1:2000 de la muestra de semen con agua destilada. Luego se coloc una gota de la dilucin en la cmara de Neubauer. La cual se mantuvo durante 10 minutos para permitir que los espermatozoides se ubiquen por decantacin en un mismo plano focal y se observ al microscopio con un aumento de 40X. Se contabilizaron los espermatozoides que permanecieron en los cinco cuadrantes de la cmara de Neubauer.

Viabilidad El porcentaje de clulas espermticas muertas fueron determinadas por medio de la tincin con eosina 1% - nigrosina 10%, y se observ en un microscopio ptico a un aumento de 100X, para evaluar dentro de un campo 10 espermatozoides. Se tom en consideracin que los espermatozoides vivos conservan su forma, mientras que los muertos tomaron la coloracin de la eosina debido a que su membrana se vuelve permeable, absorben el colorante y aumentan de tamao (Guarnizo, 2007). Comprobacin de reversin de sexo Para comprobar si los animales se reversaron genticamente, se realiz un masaje abdominal-caudal antes de decapitarlos y los animales que expulsaban semen, fueron considerados como machos normales. Luego cuando se procedi a decapitarlos y extraer las vsceras, se analiz los animales que no tenan gonoducto y stos fueron considerados como neomachos. Para los neomachos que no presentaron gonoducto y que no presentaron semen en sus testculos, se procedi a cortar un pedazo pequeo de tejido testicular sobre un portaobjeto, se colocaron dos gotas de colorante Wright y luego se aplast suavemente con el cubreobjetos. Se observaron los tejidos en el lente de 100x. Descongelacin Se sacaron las pajuelas del tanque de nitrgeno y previa descongelacin de las mismas, se mantuvieron en un tanque trmico durante 5 minutos a -4C. Luego fueron sumergidas en agua temperada a 37C durante 60 segundos. Fertilizacin Las fertilizaciones artificiales se realizaron en las instalaciones de Tru Unin en Cayambe y en Pailones - IASA. Se seleccionaron las hembras con vulos maduros, luego se procedi a realizar masajes abdominales para obtener los huevos. Se colocaron 12 gramos de vulos en una solucin de sal al 0.8% e instantneamente se adicion el contenido de 6 pajuelas, previamente descongeladas, de 0.5 ml de semen con los 5 diferentes medios de congelacin (Figura 3). Luego se hicieron dos lavados con agua, se colocaron los huevos en las canastillas y todo esto, dentro de las piscinas de incubacin. Finalmente se coloc un plstico negro encima de las piscinas para evitar la luz.

Figura 3. Fertilizacin de ovas de trucha arco iris

RESULTADOS
Durante el ao 2009 se trabaj con 100 reproductores distribuidos 50% hembras y 50% machos. La evaluacin de los gametos sexuales, tanto vulos como espermatozoides se los realiz acorde a los protocolos determinados por Blanco (1995), obteniendo los siguientes resultados (Tabla 2 y 3):
Tabla 2. Caractersticas de los gametos en hembras de trucha arco iris, Pailones 2009. Edad (aos) 2 3 4 5 6 Peso (g) 450 1.050 1.400 1.800 2.400 Longitud (cm) 32 42 47 52 58 Condicin corporal 1,4 1,43 1,32 1,23 1,18 media mxima Por cada Kg Dimetro (mm) 3,7 4,59 4,85 4,97 5,54 Peso (mg) 23,5 44,7 50,8 52,5 70,2

Productividad de vulos por kg de peso 1.600 2.700 3.500 4.000 5.600 3.300 4.300 5.500 5.700 7.100 3.600 2.500 2.500 2.200 2.100

Tabla 3. Caractersticas de los gametos en machos de trucha arco iris, Pailones 2009 Condicin corporal Movilidad espermatozoides Concentracin espermatozoides Millones unidades mm-3 9,50 6,40 7,10 5,40 4,70

Edad

Peso

Longitud

Fertilidad

(aos) 2 3 4 5 6

(g) 373 760 1.215 1.500 1.900

(cm) 30,2 40,2 46,4 50,5 55,3 1,31 1,33 1,23 1,19 1,12

(s) 31,30 34,80 37,10 33,30 31,90

(%) 69,00 87,00 92,70 90,00 80,70

Los resultados que se muestran a continuacin, son los anlisis de varianza de los parmetros macroscpicos y microscpicos, que se obtuvieron al analizar el semen de macho y neomacho en el laboratorio, antes de la crioconservacin (Tabla 4).

Tabla 4. Anlisis de varianza de los parmetros macroscpicos y microscpicos del semen de machos normales y neomachos antes de la congelacin con nitrgeno lquido. Semen machos normales Semen neomachos p valor Volumen (ml) Tiempo activacin (s) Mvil Semimvil Inmvil Vivos Muertos #esp.mL
-1

18.04 1.85 b 30.96 0.53 a 82.61 4.59 a 13.13 3.45 a 4.26 1.34 a 91.39 0.74 a 8.61 0.74 a 18.13e6 2.08 a

0.50 0.00 a 34.00 1.00 b 97.00 2.00 a 3.00 2.00 a 0.00 0.00 a 90.40 2.94 a 9.60 2.94 a 6.40e6 0.24 a

0.0002 0.0207 0.1629 0.1913 0.1552 0.6327 0.6327 0.0545

Una vez realizado y optimizado los procesos de congelacin y descongelacin, se realizaron las correspondientes pruebas de fertilizacin en vulos maduros normales obteniendo los correspondientes resultados:

Tabla 5. Pruebas de varianza de los parmetros microscpicos y porcentaje de fertilizacin para los medios de crioconservacin, con semen normal. Medio A tiempo activacin Mvil Semimvil Inmvil Vivos Muertos #esp/mm3 %fertilizacin
22.63 2.40 a 0.00 0.00 7.25 2.51 ab 92.75 2.51 ab 55.13 10.71 a 44.88 10.71 a 28.75E5 8.64 a 67.75 2.80 b

A2
22.00 2.20 a 0.00 0.00 7.63 2.50 ab 92.38 2.50 ab 52.50 9.47 a 47.50 9.47 a 25.00E5 7.13 a 67.13 3.62 b

B
21.25 2.45 a 0.00 0.00 5.00 1.55 a 95.00 1.55 b 48.25 9.10 a 51.75 9.10 a 29.75E5 9.02 a 69.25 3.49 b

C
22.50 2.83 a 0.00 0.00 10.25 2.45 b 89.75 2.45 a 48.75 8.31 a 51.25 8.31 a

D
22.50 2.83 a 0.00 0.00 7.00 2.04 ab 93.00 2.04 ab 53.13 10.75 a 46.88 10.75 a

27.63E5 8.49 a 21.00E5 6.24 a 55.75 1.57 a 64.13 3.01 ab

Para el semen normal y optimizando las tcnicas de crio preservacin se obtuvieron % de fertilizacin del 55,75 al 67, 75 % de fertilidad.

Tabla 6. Pruebas de varianza de los parmetros macroscpicos y porcentaje de fertilizacin del semen de machos normales y neomachos comparados con los medios de criopreservacin luego del descongelamiento. Tiempo A normal 28.75 1.25 b A 16.50 neomacho 0.50 a A2 normal 27.50 1.44 b A2 16.50 neomacho 0.50 a B normal 27.50 1.44 b B 15.00 neomacho 0.00 a C normal 30.00 0.00 b C 15.00 neomacho 0.00 a D normal 30.00 0.00 b D 15.00 neomacho 0.00 a semimvil 12.50 3.23 cd 2.00 0.71 a 13.25 2.69 cd 2.00 0.91 a 7.25 2.63 abc 2.75 0.95 a 15.75 2.17 d 4.75 1.75 ab 10.00 3.54 bcd 4.00 1.00 ab Inmovil 87.50 3.23 ab 98.00 0.71 d 86.75 2.69 ab 98.00 0.91 d 92.75 2.63 bcd 97.25 0.95 d 84.25 2.17 a 95.25 1.75 cd 90.00 3.54 abc 96.00 1.00 cd Vivos 83.25 2.06 c 27.00 2.04 a 76.50 5.69 bc 28.50 1.32 a 69.75 8.66 bc 26.75 1.75 a 68.25 8.31 b 29.25 0.25 a 81.25 3.50 bc 25.00 0.00 a Muertos 16.75 2.06 a 73.00 2.04 c 23.50 5.69 ab 71.50 1.32 c 30.25 8.66 ab 73.25 1.75 c 31.75 8.31 b 70.75 0.25 c 18.75 3.50 ab 75.00 0.00 c #esp/mm3 50.00E5 6.72 c 7.50E5 1.44 a 42.00E5 6.26 bc 8.00E5 2.38 a 53.00E5 4.26 c 6.50E5 0.87 a 48.50E5 6.74 bc 6.75E5 0.63 a 36.50E5 4.66 b 5.50E5 0.29 a %fert. 67.00 5.43 a 68.50 2.60 a 68.25 7.53 a 66.00 1.91 a 68.75 7.47 a 69.75 1.03 a 56.50 2.63 a 55.00 2.04 a 63.75 5.66 a 64.50 3.20 a

Es importante recalcar que los parmetros de fertilizacin obtenidos, es comparativo con otros trabajos y varan del 48 hasta el 68 %.

Figura 1. Proceso de fertilizacin de ovas de trucha arco iris. Pailones, 2009.

DISCUSIN
Segn Bastardo et al., (2004), el volumen que presentan a los 3 aos los machos normales de trucha es de 10-13 mL. Estos rangos son comparables con la investigacin realizada, ya que los volmenes son similares para truchas normales de 2 4 aos de edad. Sin embargo los volmenes de semen de los neomachos, se mantuvieron entre 0,5 0,6 mL. Las diferencias estadsticas son significativas entre los volmenes de machos normales y neomachos (p<0,05). Segn Guarnizo (2007), la edad es un factor determinante en los volmenes de produccin de gametos masculinos, por tanto los neomachos tratados tuvieron una edad de 10 a 12 meses aproximadamente. Para neomachos de 2 aos, el mayor volumen de semen obtenido fue de 5 mL, concentracin espermtica de 36x106 espermatozoides mm-3 y movilidad del 80% (Araujo, 2007). Los tiempos mnimos y mximos de activacin espermtica en machos normales fue de 30 a 38 segundos respectivamente, mientras que para neomachos fue de 30 a 35 segundos. El tiempo de activacin para reproductores de entre 2 y 4 aos va de 31 a 37 segundos. La movilidad no tuvo diferencias significativas entre las dos muestras de semen. Sus valores fueron positivos, ya que en ambos casos se aprecia valores altos en movilidad, indicando que tienen un buen movimiento cuando son activados. Con respecto a los parmetros post congelacin se observ significancia. El efecto de congelacin y descongelacin provoca que el espermatozoide se torne lento, sufre lesiones en la estructura celular, disminuyendo su calidad. Segn Medina et al., 2005, los protocolos de criopreservacin producen daos potenciales sobre las clulas con la formacin y disolucin de cristales en ambientes intra y extracelular, ocasionado por el choque trmico, estrs txico y estrs osmtico durante el proceso. El medio C fue el mejor para movilidad espermtica, presentando los mejores porcentajes. Los medio A, A2 y D contenan NaCl, NaHCO3 y KCl, aparte de glucosa, pero tuvieron una menor movilidad luego de la activacin. Segn Araujo (2007), el uso de soluciones salinas como NaCl, han sido usadas con xito, pero presentan un pequeo riesgo de daos hipo o hiperosmtico para los espermatozoides de salmnidos. Segn (Tekin et al., 2003), el parmetro de movilidad y fertilidad para semen de macho normal, tuvo mejor resultado cuando se utiliz el medio con glucosa, obteniendo 60% y 94,6% respectivamente. Durante los primeros experimentos para la criopreservacin de semen de truchas, se utiliz dimetilsulfxido (DMSO) al 7% como CI, pero la movilidad present bajos porcentajes. Debido a este problema, se utiliz metanol al 10%, mejorando los porcentajes de movilidad. El metanol suele ser menos txico que el DMSO y su efecto puede ser atribuido a la capacidad rpida de entrar y salir a nivel celular en los gametos tratados (Medina et al., 2005). Todos los tratamientos para reversin sexual fueron sacrificados. Los neomachos se contabilizaron por el nmero de peces que formaron gonoducto. Aquellos que no formaron gonoducto fueron considerados como neomachos. Los mejores tratamientos fueron aquellos que se les suministr una baja dosis de MT (3 mg), obtenindose un 50 % de transformacin. En otras especies como el salmn coho, el mayor porcentaje de machos se produce al aplicar una sola inmersin a los 514 grados da-1 cuando el 50 % de las ovas est eclosionando, en una solucin de 400 g de (MT) por dos horas, obteniendo un 78 % de machos (Daz et al., 2002). Cuando la hormona (MT) es administrada en dosis altas de alrededor de 25 mg kg-1 de la dieta, promueve la esterilizacin de las gnadas. Estos resultados son comparativos con los tratamientos realizados con MT a una concentracin de 60 mgH x kg de alimento balanceado. Adems segn Daz et al., (2005), en Chile obtuvieron truchas monosexo por inmersin e ingestin de 17 -metiltestosterona, alcanzando un

81% de machos. En esta investigacin se aliment con hormona de reversin durante la primera alimentacin de los alevines. La inmersin en la hormona no se realiz por lo que se hace necesario dar este tratamiento para obtener un buen porcentaje de reversin. Agradecimientos Un agradecimiento especial a la Escuela Politcnica del Ejrcito, Vicerrectorado de Investigacin, Unidad de Gestin de la Investigacin y a la empresa Tru-Union por permitirnos ejecutar este proyecto. Bibliografa
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