Lisozima como bactericida

Universidad Autnoma de Guadalajara Autores: Montoya Hernandez Monica Virginia Muoz Leyva Ricardo Lpez Orozco Rosa Isela

Antecedentes

La lisozima es la nica enzima que cataliza la hidrlisis del enlace -glucosdico entre el N-acetil murmico y la N-acetil glucosamina los cuales forman la pared celular de algunas bacterias. Por tal propiedad la lisozima ha sido utilizada como un agente bactericida en el proceso y preservacin de alimentos (vinos, carnes y quesos). En la industria farmacutica se emplea en el tratamiento de enfermedades bronco pulmonares, pastas dentales para prevencin de caries y en cremas de aplicacin tpica.

Justificacin

Entre las protenas de la clara de huevo la lisozima es la nica que presenta un punto isoelctrico > pH 9.5 por esta razn es fcilmente separable del resto, a un pH entre 9.5 y 10 es la nica que posee una carga neta positiva, por lo tanto los intercambiadores aninicos dejaran libre esta enzima. Adems es el componente de algunos fluidos corporales como las lgrimas y la saliva que actan como una barrera frente a las infecciones, pero es en la clara de huevo donde se encuentra en mayor concentracin y de donde se extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lcticas en los vinos Si es usado por nuestro cuerpo para no dejar entrar a las bacterias, por qu no usarlo para desinfectar otras cosas?

Hiptesis

Sus propiedades anti bactericidas hacen que la lisozima se utilice en diversos procesos industriales. Se puede aadir al mosto de uva, al mosto parcialmente fermentado y al vino con objeto de controlar el crecimiento y la actividad de las bacterias responsables de la fermentacin mala lctica en esos productos. Tambin se utiliza en la fabricacin de quesos, donde ha sido utilizada como bio-preservante en el proceso de guarda para combatir el clostridium tyrobutyricum, responsable de las hinchazones tardas en los quesos. Adems provoca la lisis de bacterias Gram-positivas, por lo cual se puede utilizar contra los siguientes microorganismos patgenos: Clostridium botulinum. Clostridium perfringens. Bacillus cereus. Staphylococcus aureo. Listeria monocytogenes.

Objetivos

Realizar diversos mtodos de extraccin de lisozima de la clara de huevo para obtener el mejor rendimiento y altas purezas. Precipitacin Ultrafiltracin Cromatografa de intercambio inico Medir la actividad enzimtica utilizando una suspensin de agregados de pared celular del microorganismo Micrococcus Lysodeikticus (la ms abundante) Utilizar la tcnica de la electroforesis en gel para analizar la purificacin de la enzima lisozima

Materiales y mtodos
o Cromatografa de intercambio inico

Huevos de gallina para la obtencin de la enzima. Tampn A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10. Tampn B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl. Carboximetil-Celulosa. Tampn fosfato sdico 100 mM, pH 6.2 Suspensin de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del tampn fosfato. Procedimiento I. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampn A. II. A los 9 ml restantes, aadir 4 ml de CM-celulosa activada y agitar suavemente durante 15 min. III. Al finalizar la incubacin, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. IV. Aadir a la resina 10 ml de tampn. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. V. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante. VI. Elucin. Resuspender la CM-celulosa con 3 ml de tampn B e incubar, agitando suavemente, durante 10 minutos. Centrifugar y recoger el eluido Medida de la actividad enzimtica. La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensin de agregados de pared celular del microorganismo Micrococcus Lysodeikticus en concentracin suficientemente elevada para atenuar, la transmisin de luz monocromtica a travs de la cubeta de un espectrofotmetro. La actividad enzimtica es proporcional a la disminucin de la absorbancia a 450 nm. Por definicin, en condiciones estndar (25C, pH 6,2 y 0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimtica de lisozima produce una disminucin en la absorbancia de 0,001 en 1 minuto. o I. Precipitacin

1. 2. 3. 4. 5. 6.

II.

Para la precipitacin se utiliz clara concentrada diluida a pH de 9.5 (cercano al pI de la lisozima) con 5% (p/v) de NaCl como agente precipitante y un inoculo de lisozima pura para iniciar la agregacin de cristales. Los tratamientos se incubaron a 10C durante 48 horas.

o I.

Ultrafiltracin

II.

Para el mtodo de ultrafiltracin se probaron diferentes disoluciones de clara (1:16, 1:8, 1:4 y 1:1) en solucin de NaCl a una concentracin final de 0.1 M todas las muestras se pasaron a travs de dispositivos Amicon Ultra-4 con una membrana de 30 kDa. Los filtrados obtenidos con dicha membrana se filtraron nuevamente pero con membrana de 10 kDa para concentrar la enzima.

Resultados

En los tratamientos de clara diluida con inoculo de cristales de lisozima se obtuvieron las mejores eficiencias de extraccin hasta un 88.6%. El mayor rendimiento de purificacin por ultrafiltracin fue con clara diluida 1:16. Se obtuvo lisozima ms pura cuando los filtrados se pasaron por una membrana de 10 kDa pero hubo disminucin en el rendimiento. Eficiencia de extraccin de lisozima por el mtodo de precipitacin Muestra Rendimiento (%) Clara + lisozima 70.3 Clara lisozima 59.3 Clara diluida + lisozima 88.6 Clara diluida - lisozima 73.9 Membrana usada muestra 1:16 1:8 1:4 1:1 30 kDa 10 kDa Rendimiento (%) 69.2 92.3 57.7 46.1 28.8 23.1 11.5 7.2 Es conveniente trabajar con clara a pH cercanos al pI de la lisozima ya que se disminuyen las interacciones electrostticas con otras protenas de huevo.

La dilucin de la clara favorece la extraccin de lisozima por el mtodo de precipitacin y ultrafiltracin. El pH es un parmetro importante para la precipitacin sin embargo la pureza de la enzima obtenida no fue aceptable. Aunque por ultrafiltracin se obtuvo una alta pureza, el mtodo no es rentable.

Bibliografa

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