pneumoslide

La solucin de IFI para el diagnstico serolgico de neumona

Deteccin simultanea, usando un solo portaobjetos, de las bacterias y virus ms frecuentemente asociados a las infecciones respiratorias en humanos.

Pneumoslide IgM
Dossier informativo de producto

ndice
Introduccin - Neumona Adquirida en la Comunidad (NAC) 2

Principales variables a considerar en el diagnstico de NAC

Principales caractersticas de Pneumoslide IgM

Posicionamiento de Pneumoslide IgM

Uso ptimo del producto

Procedimiento de ensayo de Pneumoslide IgM

Galera de imgenes Pneumoslide IgM Galera de imgenes Resolucin de problemas

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Preguntas ms frecuentes

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Gua de resolucin de problemas

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Bibliografa

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Introduccin Neumona Adquirida en la Comunidad (NAC)

La Neumona Adquirida en la Comunidad (NAC) es una de las enfermedades clnicas ms importantes en adultos, resultando afectados entre 5 y 20 adultos de cada 1.000 cada ao. De stos, entre un 20-40% requerirn hospitalizacin para el tratamiento de la neumona. Segn Bartlett, J. y otros (Practice Guidelines for the management of Community-Acquired Pneumonia in adults), la neumona es la sexta causa de muerte ms comn en Estados Unidos. Entre 1979 y 1994, las tasas de mortalidad debidas a neumona e influenza aumentaron en un 59% (segn los cdigos CIE-9 de certificados de defuncin) en Estados Unidos. Este incremento fue provocado en gran parte por la mayor proporcin de personas 65 aos; sin embargo, las tasas ajustadas por edad tambin crecieron en un 22%, lo que sugiere que otros factores pudieron contribuir tambin hacia una cambiante epidemiologa de neumona, incluyendo una mayor proporcin de la poblacin con condiciones mdicas subyacentes con riesgo de sufrir infecciones respiratorias. Cada ao, entre 2 y 3 millones de casos de NAC resultan en ~10 millones de visitas mdicas, 500.000 hospitalizaciones y 45.000 muertes en Estados Unidos. Se estima que la incidencia de NAC que finalmente requiere hospitalizacin es de 258 personas por cada 100.000 habitantes, y 962 por cada 100.000 personas 65 aos. Aunque la tasa de mortalidad en pacientes hospitalizados se sita entre un 2% y un 30% en numerosos estudios, la media es de ~14%. Para pacientes no hospitalizados se estima que es menor a un 1%. La incidencia de NAC es mucho mayor durante los meses de invierno.

Moreno, R. et al. Etiologa de la neumona adquirida en la comunidad en el adulto inmunocompetente. 2005. Rev Chil Infect 22 (supl 1): S18-S25.

El diagnstico de enfermedades infecciosas se lleva a cabo evaluando siempre una serie de parmetros. Otra opcin para el diagnstico es el uso de test de laboratorio, aunque no es la nica. Para obtener un diagnstico es importante que el mdico estudie y tenga en cuenta los datos clnicos del paciente: sintomatologa, historial clnico, tests radiolgicos, anlisis generales, etc. junto con los datos obtenidos del laboratorio de microbiologa. Dependiendo de la edad del paciente, del tiempo que tarde la enfermedad en desarrollarse, del ratio de excrecin del microorganismo, de los medios disponibles en el laboratorio, de las habilidades y experiencia de los tcnicos, etc. Pneumoslide IgM puede ser un mtodo de diagnstico ms til para algunos pacientes que para otros. A la hora de elegir el mtodo ms adecuado para el diagnstico de infecciones respiratorias, se deben tener en cuenta los siguientes factores:

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Dependiendo de la zona geogrfica en la que se va a realizar el ensayo, unas enfermedades pueden tener mayor incidencia que otras, por lo que el diagnstico de aqullas que tengan una mayor prevalencia ser de mayor valor. Es importante, por lo tanto, conocer la epidemiologa de la zona para poder definir con precisin los microorganismos objeto de investigacin. Adems, en aquellas zonas geogrficas con importante estacionalidad es necesario conocer tambin la prevalencia de los distintos microorganismos causantes de infecciones respiratorias en relacin con los diferentes cambios estacionales. En aquellas zonas donde no haya importantes cambios estacionales, la prevalencia de los distintos microorganismos se mantiene estable a lo largo del tiempo.

Principales variables a considerar en el diagnstico de NAC

Respuesta serolgica en funcin de la ubicuidad de la infeccin En las primoinfecciones aparecen respuestas de tipo IgM e IgG. En caso de reinfeccin, en muchas ocasiones no hay respuesta IgM y, en otras, es de baja intensidad aunque se produzca seroconversin IgG. Si la infeccin es muy comn (frecuente en infecciones de transmisin area), la primoinfeccin aparece durante la infancia. En aquellas infecciones en las que la incidencia es ms baja, la primoinfeccin puede tener lugar a lo largo de toda la vida. Edad de la poblacin a analizar Es importante conocer si la poblacin a diagnosticar es infantil o adulta. En general, las poblaciones infantiles excretan una mayor cantidad de microorganismos cuando se infectan por virus causantes de una infeccin respiratoria y desarrollan anticuerpos IgM frente a los agentes responsables de dicha infeccin. En poblaciones adultas, la tasa de excrecin es normalmente inferior y, en muchas ocasiones, no desarrollan anticuerpos IgM debido a que el adulto ya ha estado en contacto en varias ocasiones con el microorganismo. Cualificacin del laboratorio El mtodo de diagnstico a usar depender de la dotacin del laboratorio que lleve a cabo dicho diagnstico, as como de los conocimientos y entrenamiento de su personal. Evolucin clnica del paciente La tcnica ms aconsejable a usar depender realmente del momento en el que el paciente acuda al mdico. En los estados iniciales de la enfermedad se puede optar por tcnicas de cultivo del microorganismo, tcnicas de biologa molecular o tcnicas de deteccin antgena. En etapas ms avanzadas de la enfermedad donde las tasas de excrecin del microorganismo son mnimas, es aconsejable optar por mtodos serolgicos. Tipo de muestra Dependiendo del tipo de paciente, de la habilidad del personal que recoja la muestra y de los medios disponibles para el envo de la muestra al laboratorio donde se vaya a realizar el anlisis, se optar por una tcnica de diagnstico u otra. En algunos pacientes, debido a su edad, sintomatologa u otras circunstancias especiales, quizs sea imposible tomar una muestra respiratoria y haya que optar por muestras sanguneas para un anlisis serolgico. La mayora del personal sanitario suele estar bien entrenado para la toma de muestras sanguneas aunque no todos estn lo suficientemente formados para la recogida de muestras respiratorias de calidad. En aquellos casos en los que no se pueda garantizar un envo de muestras respiratorias rpido y seguro, ser aconsejable la obtencin de muestras sanguneas.

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Principales caractersticas de Pneumoslide IgM

Pneumoslide IgM permite el diagnstico presuntivo mediante la medicin de respuestas IgM. Permite desarrollar 10 tests. Cada kit contiene 10 portaobjetos de 10 pocillos cada uno.

Este test est especialmente diseado para el estudio de aquellos microorganismos que pueden provocar infecciones respiratorias y que se pueden diagnosticar mediante mtodos serolgicos. Existen otros microorganismos responsables de infecciones respiratorias que no se pueden diagnosticar a travs de mtodos serolgicos. En comparacin con otras marcas comerciales del mercado, el test de Vircell se desarrolla de forma ms sencilla. Adems, permite una clara visualizacin en el microscopio de fluorescencia (menos parmetros y ms fciles de localizar que los biochips). El test de Vircell tiene un pocillo que contiene clulas Hep-2, las cuales permiten la identificacin de aquellos sueros con anticuerpos anticelulares o antinucleares capaces de provocar reacciones no especficas y de invalidar el test. La presencia de Pneumoslide IgM en el mundo se muestra en el siguiente grfico:
Contribucin de ventas por regin (NSLIDEM)

Australia Asia 0% 6%

frica Rusia 1% 6%

Oriente Medio 6%

EU 62%

LATAM 19%

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Posicionamiento de Pneumoslide IgM

Resumiendo, es necesario evaluar de forma detenida una serie de factores a la hora de decidir qu tcnicas de diagnstico son las ms apropiadas para conseguir unos mejores resultados, teniendo en cuenta las circunstancias y medios disponibles.

Uso ptimo del producto

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Procedimiento de ensayo de Pneumoslide IgM

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Galera de imgenes Pneumoslide IgM

Resultados de lectura visual al microscopio Legionella pneumophila serogrupo 1 (positivo y positivo dbil)

Mycoplasma pneumoniae (positivo y positivo dbil)

Coxiella burnetii (positivo y positivo dbil)

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Chlamydophila pneumoniae (positivo y positivo dbil)

Adenovirus (positivo y positivo dbil)

Virus sincitial respiratorio (positivo y positivo dbil)

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Influenza A (positivo y positivo dbil)

Influenza B (positivo y positivo dbil)

Parainfluenza 1, 2 y 3 (positivo y positivo dbil)

Control celular

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Galera de imgenes Resolucin de problemas

Muestra contaminada

Lavado inapropiado

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Bordes de Legionella y Coxiella

Plastas

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Preguntas frecuentes
1. Qu metodologa es la ms utilizada para el estudio de patgenos del aparato respiratorio a nivel internacional? Teniendo en cuenta las consideraciones generales comentadas anteriormente, los principales agentes etiolgicos causantes de infecciones respiratorias pueden ser detectados a travs de diferentes mtodos, dependiendo del tipo de hospital.
UTILIDAD DE LA TCNICA HOSPITAL GRANDE ANTIGENO LEGIONELLA PNEUMOPHILA MYCOPLASMA PNEUMONIAE COXIELLA BURNETII CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE ADENOVIRUS VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO INFLUENZA PARAINFLUENZA OK OK OK OK OK OK OK OK OK OK OK OK FD CULTIVO OK SEROLOGA IgM OK OK OK OK OK OK OK OK HOSPITAL PEQUEO ANTGENO LEGIONELLA PNEUMOPHILA MYCOPLASMA PNEUMONIAE COXIELLA BURNETII CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE ADENOVIRUS VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO INFLUENZA PARAINFLUENZA OK OK OK OK OK OK OK FD CULTIVO SEROLOGA IgM OK OK OK OK OK OK OK OK SEROLOGA IgG OK OK OK OK OK OK OK OK MOLECULAR SEROLOGA IgG OK OK OK OK OK OK OK OK OK OK MOLECULAR OK OK

La sensibilidad del test tambin variar dependiendo de la tecnologa usada.

SENSIBILIDAD DEL TEST ANTGENO LEGIONELLA PNEUMOPHILA MYCOPLASMA PNEUMONIAE COXIELLA BURNETII CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE ADENOVIRUS VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO INFLUENZA PARAINFLUENZA ALTA BAJA BAJA ALTA MODERADA BAJA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA FD CULTIVO BAJA SEROLOGA IgM ALTA ALTA ALTA ALTA MODERADA MODERADA MODERADA MODERADA SEROLOGA IgG ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA ALTA MOLECULAR ALTA ALTA

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El momento del diagnstico tambin determinar la tcnica ms apropiada a utilizar.

MOMENTO DEL DIAGNSTICO ANTIGENO LEGIONELLA PNEUMOPHILA MYCOPLASMA PNEUMONIAE COXIELLA BURNETII CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE ADENOVIRUS VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO INFLUENZA PARAINFLUENZA TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO TEMPRANO FD CULTIVO TEMPRANO SEROLOGA IgM INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO INTERMEDIO SEROLOGA IgG TARDE TARDE TARDE TARDE TARDE TARDE TARDE TARDE TEMPRANO TEMPRANO MOLECULAR TEMPRANO TEMPRANO

2. Cules son las condiciones necesarias para una correcta aplicacin clnica de Pneumoslide IgM? Es necesario disponer de un microscopio de fluorescencia en el laboratorio. En caso contrario habra que proporcionrselo. El laboratorio debe contar con personal especializado en la visualizacin de tcnicas de inmunofluorescencia. En caso contrario, ser necesario entrenarlos para ello. Puede ocurrir que el paciente vaya al mdico en un estado todava muy inicial de la enfermedad, en cuyo caso no habra desarrollado todava anticuerpos. Si esto es as, el mdico deber pedir una nueva toma de sangre 7-15 das despus de la primera visita.

3. Qu tipos de suero son necesarios para el test Pneumoslide IgM? Cul es la incidencia en los resultados del test si se trata de un suero hiperlipmico, contaminado, hemolizado o hiperbilirrubinmico? Como se especifica en las instrucciones de uso, Recogida y Manejo de la muestra: La sangre debe extraerse en condiciones aspticas mediante tcnicas de venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de tcnicas estriles o aspticas para evitar la contaminacin de la muestra. Los sueros deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8C si se van a procesar dentro de los 7 das siguientes a la toma. Si el procesamiento se va a prolongar deben congelarse a -20C, evitando las congelaciones y descongelaciones innecesarias ya que estas podran provocar una disminucin del ttulo de las inmunoglobulinas, especialmente de IgM. No utilizar sueros hiperlipmicos o contaminados. Los sueros que presenten partculas pueden ser clarificados por centrifugacin.

4. Cul es el mtodo estndar autorizado a nivel mundial en los siguientes parmetros?

Mtodos serolgicos Legionella Mycoplasma IFA ELISA, Fijacin de complemento, Microaglutinacin IFI MIF IFI

Mtodos para la deteccin de organismos Deteccin de antgeno en orina PCR

Coxiella Chlamydia Adenovirus

Ninguno PCR PCR

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RSV

IFI

Deteccin de antgeno (solo nios)- PCR/Cultivo celular (adultos) PCR/Cultivo celular PCR/Cultivo celular

Influenza Parainfluenza

Fijacin de complemento IFI

5. Cul es la incidencia de los nueve patgenos en la poblacin clnica? Por favor, especifique la prevalencia de cada uno de los patgenos. Las infecciones mltiples no son muy comunes. En algunos casos es posible que, debido a una infeccin aguda causada por un microorganismo, se produzca una reactivacin policlonal que d lugar a la aparicin de anticuerpos de tipo IgM frente a otras enfermedades infecciosas que el enfermo haya sufrido a lo largo de su vida. ste sera un caso extrao y, si se encontraran dos o tres pocillos positivos, el mdico tendra que evaluar la prevalencia del microorganismo encontrado segn la zona geogrfica y la estacin del ao en la que se encuentre. El mdico deber pedir tambin una nueva muestra de suero a los 15-21 das para un anlisis ms completo. En trminos generales, los principales causantes de neumona que requieren de hospitalizacin son Mycoplasma, Legionella y Chlamydia.

Datos obtenidos de un estudio de vigilancia activa desarrollado en Ohio en 1991, que muestra el ndice de edad de la comunidad infectada por neumona como consecuencia de los principales patgenos bacterianos. Las infecciones por Mycoplasma pneumoniae fueron diagnosticadas por seroconversin, hacienda uso de tests CF. Estos datos demuestran que Mycoplasma pneumoniae causa una gran cantidad de neumonas de suficiente severidad como para merecer la hospitalizacin de aquellas personas menores de 50 aos, aunque tambin es una importante causa de neumona en los grupos de mayor edad. Sp, S. pneumoniae; Mp, M. pneumoniae; Lp, L. pneumophila; Cp, C. pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae es el causante de hasta un 40% de los casos de NAC y hasta un 18% de los casos requieren la hospitalizacin en nios (la mxima incidencia se da entre los 5 y 15 aos de edad). El sndrome ms tpico en nios es la traqueobronquitis. En la mayora de los casos, las infecciones por Mycoplasma pneumoniae presentan una sintomatologa moderada, siendo muchos de los casos en adultos asintomticos. Entre el 3 y 10 por ciento de las personas infectadas acaban desarrollando neumona. Ocurre de forma endmica y epidmica (de 3 a 5 aos) tanto en nios como en adultos a nivel mundial. No se considera que el clima y la zona geogrfica tengan una gran incidencia. Brotes de Mycoplasma pneumoniae suelen aparecer en verano o a comienzos de otoo. El largo periodo de incubacin y el bajo porcentaje de transmisin son dos factores que influyen en la prolongacin de las infecciones epidmicas de Mycoplasma pneumoniae. La distribucin de organismos vara de un ao a otro, encontrndose Mycoplasma pneumoniae en segundo lugar despus del virus influenza A, que fue el patgeno ms frecuente durante el periodo de vigilancia. Puede permanecer varios periodos en al aparato respiratorio y resultar en infecciones que necesitan ser tratadas clnicamente. Muchos brotes de Mycoplasma pneumoniae han sido documentados en la comunidad y en recintos cerrados o semicerrados como bases militares, hospitales, comunidades religiosas e instituciones para discapacitados.

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Legionella pneumophila es la causa ms frecuente de la enfermedad del legionario o legionelosis, una enfermedad severa que cursa neumona y Fiebre de Pontiac (enfermedad ms leve, con una condicin parecida a la influenza). La legionelosis es una enfermedad que surgi en la segunda mitad del siglo XX como consecuencia de una alteracin del medio ambiente provocada por el hombre. La legionela tiene como principal reservorio el agua, por lo que esta bacteria se encuentra ampliamente distribuida en los ecosistemas acuticos de todo el mundo.

La infeccin por Coxiella burnetii (fiebre Q) puede ser asintomtica en un 60% de los casos. En fases agudas de la enfermedad produce fiebre, neumona atpica o hepatitis granulomatosa. En estados avanzados causa endocarditis. La historia de la fiebre Q en China comenz con el reconocimiento de algunos casos de neumona atpica primaria en 1951. La distribucin de la fiebre Q en China se da a nivel nacional.

FIEBRE Q: The Biology of Coxiella burnetii. Ed. CRC Press- October 1991. Chapter 12: COXIELLA BURNETII IN CHINA. Yu Shurong- Department of Microbiology Third Military Medical Collage. Chongqing, Sichun. Peoples Republic of China.

El incremento del nmero de casos reconocidos de fiebre Q, especialmente casos de enfermedades crnicas, ha generado una gran preocupacin en China. El diagnstico y tratamiento del paciente a tiempo puede ser determinante para prevenir la reaparicin de la fiebre Q o enfermedad crnica.

La infeccin respiratoria aguda por Chlamydophila pneumoniae es asintomtica en el 90% de los casos. Neumona, asma y enfermedad de la arteria coronaria son sus principales manifestaciones. Si se asume que en adultos, la incidencia anual de NAC es de 0.1% y que, dentro de este porcentaje, Chlamydophila pneumoniae es la responsable del 10% de los casos y el porcentaje anual de seroconversin es de 1,5%, tan solo 1 de cada 150 infecciones de Chlamydophila pneumoniae acabarn en neumona.

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Adenovirus es responsable del 7% de todas las enfermedades respiratorias en nios, del 20% de conjuntivitis agudas en nios, entre el 3 y 10% de los casos de gastroenteritis en nios y de miocarditis, pericarditis e infecciones en pacientes inmunocomprometidos (es una de las principales enfermedades mortales en los trasplantes de mdula espinal). El aumento de la hiperlipidemia anamnsica que pueda tener lugar en infecciones tempranas podra ocultar un cudruple aumento de la concentracin de anticuerpos del serotipo infectado si los especmenes de la fase aguda no han sido recogidos en los primeros das. La deteccin de los IgM es uno de los primeros indicadores del laboratorio.

El problema de salud pblica causado por el virus sincitial respiratorio se justifica por el hecho de que aproximadamente dos tercios de los nios estn infectados por VSR durante el primer ao de vida; un tercio de los infectados desarrollan una leve enfermedad en el aparato respiratorio, el 2.5% son hospitalizados (ms de 90.00 nios en Estados Unidos cada ao) y un 0.1% muere. Representa aproximadamente el 50% de todas las neumonas y hasta un 90% de los casos registrados de bronquitis infantil. Los brotes del virus sincitial respiratorio son repentinos al principio y pueden durar hasta 5 meses. Estas epidemias se producen anualmente en intervalos regulares y predecibles.

La gripe o influenza es una enfermedad viral aguda y autolimitada que afecta a las vas respiratorias altas. La influenza tiene un gran impacto sobre la salud pblica a nivel mundial cada invierno debido a su destreza para expandirse rpidamente a lo largo de la poblacin mediante la tos y estornudos de los infectados. Durante las epidemias estacionales de influenza, el 5-15% de la poblacin es contagiada por infecciones respiratorias altas. Estas epidemias estacionales ocasionan un importante aumento de los costes y demanda en recursos sanitarios debido al aumento de las prcticas de consulta generales, de las complicaciones clnicas, hospitalizaciones, tratamientos mdicos y ausencia en el trabajo por parte de los infectados. A pesar de la dificultad a la hora de evaluarlo, se estima que entre 250.00 y 500.00 personas en todo el mundo mueren a causa de una grave enfermedad provocada por una infeccin del virus influenza cada ao. La influenza es un virus RNA cubierto cuya matriz de protenas y nucleoproteinas permite la diferenciacin entre A, B y C. La influenza A tiene subtipos segn la hemaglutinina y neuraminidasa: H1N1, H3N1, H3N2 y H5N1. El virus influenza provoca vmitos y diarrea en nios, bronquitis, otitis, crup y neumona. En abril de 2009, un nuevo H1N1 (nH1N1) reagrupado que provoc infecciones humanas en Mxico y Estados Unidos fue identificado por el CDC. La continua identificacin de nuevos casos indica que existe una constante transmisin de este nuevo virus gripal A entre humanos. La mayora de los casos han sido identificados como autolimitados, enfermedades respiratorias febriles sin complicaciones y sntomas similares a los de la gripe estacional. No obstante, vmitos y diarrea eran comunes. Algunos pacientes requieren de hospitalizacin debido a un nivel ms severo de la enfermedad. Este nuevo virus H1N1 puede ser detectado a travs de muestras directas o mediante cultivos de inmunoensayos directos dirigidos a eptopes comunes del virus gripe A. Aun as, estos ensayos no pueden distinguir al nuevo virus de entre los dems virus estacionales. Solo se puede conseguir esta diferenciacin a travs de la secuenciacin (solo disponible en un nmero limitado de laboratorios) o a travs de RT-PCR dirigidos a secuencias especficas del nuevo virus. Existen ms de 5 x 10 infecciones respiratorias bajas (LRI) cada ao dentro de los Estados Unidos en nios menores de 5 aos. El virus Parainfluenza (HPIV-1 y HPIV-3) ha sido encontrado en un tercio de estas infecciones. Adems, el virus Parainfluenza es tambin la causa de importantes infecciones respiratorias altas (URI) en nios y adultos y, en menor grado, de infecciones respiratorias bajas (LRI) en el inmunocomprometido, en aqullos con enfermedades crnicas y en los de mayor edad.
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EDAD PAR-1 PAR-2 PAR-3 7-36 meses 12-24 meses <6 meses

EPIDEMIOLOGA otoo/bienal otoo/bienal verano/anual

URI crup 50% crup 10% crup 10%

LRI bronquiolitis 10%

OBSERVACIONES

bronquiolitis 10%, neumona, enfermedad ms severa traqueobronquitis

6. Qu factores pueden provocar falsos resultados positivos en el test Pneumoslide IgM?

Presencia de anticuerpos anticelulares o antinucleares. Estos anticuerpos pueden aparecer en varias enfermedades autoinmunes. En estos casos, el pocillo nmero 10 de Pneumoslide puede presentar tincin fluorescente y todos los pocillos que contengan clulas (pocillos 2, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) presentarn fluorescencia. En estos casos, la inmunofluorescencia no debe ser usada por lo que se debe acudir a otras tcnicas de diagnstico.

Lavado inapropiado: 1. Las instrucciones de uso deben ser estrictamente seguidas. En caso contrario, pueden ocurrir falsos resultados positivos. 2. Una solucin de lavado no preparada o almacenada segn se establece en las instrucciones de uso puede conducir a falsos resultados positivos.

Incubacin inapropiada: 1. Incubaciones ms prolongadas que las definidas en las instrucciones de uso pueden producir background o fondo. 2. El background puede aparecer como consecuencia de pocillos que se secan durante la incubacin. Es importante el uso de una cmara hmeda durante el proceso de incubacin, tal y como se menciona en las instrucciones de uso. 3. Incubaciones a temperaturas superiores a 40C.

Tratamiento con sorbente: Pneumoslide IgM incluye un paso para el tratamiento del suero con sorbente y una posterior centrifugacin para retirar el precipitado. Si este paso no se realiza y si, a la hora de recoger el suero centrifugado se resuspenden los precipitados, puede aparecer background.

7. Qu factores pueden provocar falsos resultados negativos en el test Pneumoslide IgM? Si se obtiene la muestra en una fase temprana de la enfermedad, cuando los anticuerpos de tipo IgM todava no han aparecido. En el caso de reinfecciones de un virus causante de enfermedades respiratorias en poblaciones adultas, los anticuerpos de tipo IgM no siempre aparecen. Por lo tanto, Pneumoslide puede producir resultados negativos aunque la enfermedad exista. Los siguientes factores debern ser tenidos en cuenta para evitar falsos resultados negativos: o Comprobar el microscopio y foco UV

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o o o o o o o

Comprobar la ausencia de contaminacin del conjugado fluorescente Comprobar que el medio de montaje cubre la totalidad del pocillo Comprobar que los componentes del kit correcto han sido usados Comprobar que la tcnica se ha desarrollado siguiendo las instrucciones de uso Hacer la prueba a una temperatura no inferior a 30C No utilizar ningn producto que no sea el PBS incluido en el kit como amortiguador de lavado. Evitar un lavado excesivamente prolongado o demasiado enrgico.

8. La empresa EUROIMMUN tambin ofrece equipos de IFI y su tiempo de reaccin es de 30+30 minutos, mientras que los de Vircell tienen un tiempo de reaccin de 90+30 minutos. Se puede acortar el tiempo de reaccin? Las inmunoglobulinas IgM son de mayor tamao que las IgG, y el tiempo de reaccin con eptopes antignicos es mayor que el necesario para las inmunoglobulinas IgG. Es un consenso cientfico a nivel mundial el mantener tiempos de incubacin de mayor duracin, normalmente de 90 minutos. Incubaciones de menor duracin podran reducir la sensibilidad de la tcnica.

9. Durante el proceso del ensayo, podemos incubar directamente en agua hirviendo en vez de usar una cmara hmeda? No tenemos experiencia al respecto. En cualquier caso, preparar una cmara hmeda es muy sencillo: slo necesita un recipiente con una tapa (placa Petri, una caja) que cierre bien (no es necesaria una cerradura hermtica). En el fondo de dicha caja o placa se coloca un papel de filtro o algodn humedecido en agua.

10. A qu detalles se les deben prestar una mayor atencin durante el uso de Pneumoslide IgM? Desde un punto de vista tcnico, siguientes: los aspectos ms importantes a considerar son los

El proceso de centrifugacin de la muestra tras el tratamiento con sorbente: es importante retirar la muestra de estudio con cuidado de no resuspender los precipitados ya que estos pueden interferir en la visualizacin de la muestra dando lugar a falsos resultados positivos o lecturas invlidas.

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No rayar los pocillos durante el proceso de colocacin de la muestra ni durante el resto de las manipulaciones, ya que esto podra provocar el desprendimiento de los antgenos y dar lugar a lecturas difciles de interpretar. Tener experiencia en la visualizacin de fluorescencia al microscopio. Tener un microscopio de fluorescencia disponible con un mantenimiento adecuado que garantice la alta calidad de las imgenes.

11. Ya que Pneumoslide IgM es una tcnica de identificacin de IgM para las primeras infecciones e infecciones reiteradas, tiene esta tcnica algn tipo de limitaciones? Qu argumentos de venta se podran usar para este producto? Las infecciones bacterianas causantes de neumona que pueden ser diagnosticadas mediante mtodos serolgicos (Legionella, Mycoplasma, Chlamydophila, Coxiella) tienen un bajo predominio y los casos de reinfecciones posteriores no son altos. Es precisamente por esto por lo que el diagnstico en poblaciones adultas se puede hacer mediante la determinacin de inmunoglobulinas IgM contra Legionella, Mycoplasma, Chlamydophila y Coxiella, lo que hace que Pneumoslide sea una tcnica de diagnstico muy til. En el caso de virus causantes de sntomas respiratorios, es posible encontrar poblaciones adultas con anticuerpos IgM. Sin embargo, en muchas reinfecciones, los anticuerpos IgM ya no aparecen ms, lo que hara que Pneumoslide no sea de utilidad. En poblaciones infantiles, donde la mayora de las infecciones respiratorias son primoinfecciones, la determinacin de IgM mediante Pneumoslide es muy til.

12. En comparacin con el mtodo de aglutinacin de partculas de gelatina, cul es la ventaja de un kit de Pneumoslide IgM? Los mtodos de aglutinacin de partculas de gelatina miden anticuerpos totales, por lo que diferenciar IgM (indicando un proceso agudo) de IgG (que puede corresponder a infecciones anteriores) no es posible.

13. En ocasiones hay una pequea cantidad de fluorescencia en el pocillo nmero 10. Significa que el test es invlido? Una leve seal de inmunofluorescencia en el pocillo nmero 10 no significa que el test sea invlido. Para considerar que es invlido por contener anticuerpos antinucleares o anticelulares es necesario que el pocillo nmero 10 presente una tincin intensa. Adems, la fluorescencia tambin aparecera in aquellos pocillos que contienen clulas, aparte del pocillo nmero 10: 2, 5, 6, 7, 8 y 9.

14. En ocasiones no se puede ver la fluorescencia en la totalidad del pocillo. Adems, algunas clulas presentan fluorescencia mientras que otras no. En este caso, cmo se deben interpretar los resultados negativos o positivos? Los controles negativos y positivos incluidos en el kit ofrecen resultados bastante claros. Hasta que no se tenga mucha experiencia con estos tests, es importante prestar una especial atencin a los controles positivos y negativos bajo la visualizacin microscpica de las muestras. Segn las instrucciones de uso, una reaccin positiva ser aquella en la que se observe fluorescencia color verde manzana en la totalidad de las bacterias en los casos de Legionella, Chlamydophila o Coxiella; fluorescencia verde manzana en la periferia celular en los sueros positivos a Mycoplasma; fluorescencia verde manzana nuclear, citoplasmtica y/o perifrica en un 1-15% de las clulas en los sueros positivos a adenovirus, influenza, VSR o parainfluenza,

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(el patrn perifrico es el ms frecuente en sueros dbiles; en parainfluenza y VSR es posible observar sincitios teidos junto al patrn anterior). Una reaccin negativa ser aquella en la que se observe ausencia de fluorescencia para Legionella, Chlamydophila y Coxiella y un patrn celular rojo para Mycoplasma, adenovirus, influenza A y B, VSR y parainfluenza.

15. En el caso de aparecer fluorescencia en la membrana celular, citoplasma o en el ncleo celular, cmo se deben interpretar los resultados positivos? Es necesario que se forme un crculo fluorescente o casi fluorescente a la hora de interpretar resultados positivos? En el caso de suero positivo dbil, un modelo perifrico en 1-15% de las clulas a adenovirus, influenza, VSR o parainfluenza es visible.

16. Si secamos el portaobjetos con aire caliente o en una incubadora a 37 grados, afectar a la observacin de la fluorescencia? Siguiendo las instrucciones de uso, despus del lavado se debe secar el portaobjetos al aire. Cuando se quiera acelerar el proceso de secado, se puede usar un secador ya que ste permite eliminar los restos del lavado. El portaobjetos debe estar inclinado mientras se seca. Con respecto al uso de una incubadora a 37C, nosotros no lo recomendamos. 17. Cules son los requisitos en cuanto al tiempo e intensidad de lavado? Existen diferencias segn el tipo de agitador que se utilice, la velocidad o el tiempo de agitado durante el lavado? Cul sera la influencia? Tal y como se menciona en las instrucciones de uso, despus de la incubacin, se debe enjuagar brevemente el portaobjetos con PBS (evitar verter directamente el PBS sobre los pocillos) y sumergirlo en PBS mientras se agita ligeramente con una agitadora (orbital o mareomotriz) durante 10 minutos. Baar el portaobjetos en agua destilada. Es importante hacer el lavado agitando el portaobjetos para evitar background. Si es imposible contar con una agitadora para hacer el lavado, se deber hacer este procedimiento durante 15 minutos.

18. Cul es el origen de los antgenos cubiertos en los pocillos? Los pocillos que contienen virus (5: adenovirus, 6: VSR, 7: influenza A, 8: influenza B, 9: parainfluenza 1, 2 y 3) son una mezcla de cultivo celular infectado por los virus especficos y clulas no infectadas siguiendo el siguiente esquema: Adenovirus: virus desarrollado en la lnea celular Hep-2. El pocillo contiene clulas infectadas y no infectadas. VSR: virus desarrollado en la lnea celular LLC-MK2. Los pocillos contienen clulas infectadas y no infectadas. Influenza A y B: virus desarrollados en la lnea celular LLC-MK2. Los pocillos contienen clulas infectadas y no infectadas. Parainfluenza 1, 2 y 3: virus desarrollados en la lnea celular LLC-MK2. Los pocillos contienen clulas infectadas y no infectadas.

Cada pocillo vrico contiene 1-15% de clulas infectadas inactivadas con formaldehdo. Los portaobjetos son fijados con acetona.

19. Se debe realizar en condiciones de esterilidad? No son necesarias condiciones de esterilidad.

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20. Cul es la estabilidad del kit? Como se puede ver en las instrucciones de uso: Requisitos de almacenamiento: Almacenar entre 2 y 4C. No usar los reactivos del kit ms all de la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Los kits son estables hasta el fin de mes indicado en la fecha de caducidad cuando se almacene cerrado y entre 2 y 8C. Almacenamiento de los reactivos una vez abiertos: PBS reconstituido: 4 meses entre 2 y 8C y nunca despus de la fecha de caducidad. El resto de componentes: mirar la fecha de caducidad en la etiqueta del paquete (entre 2 y 8C). Estabilidad y manipulacin de los reactivos: Manipular los reactivos en condiciones aspticas para evitar contaminaciones microbianas. Usar slo las cantidades de sorbente, PBS, suero de control y conjugado necesarias para el test. No se debe depositar el exceso de conjugado en las botellas. Despus de la reconstitucin, almacenar el PBS entre 2 y 8C y no usarlo si aparece turbidez.

Gua de localizacin y solucin de problemas

AUSENCIA DE FLUORESCENCIA EN CONTROL POSITIVO Comprobar la lmpara fluorescente Comprobar la ausencia de contaminacin en control positivo Comprobar la ausencia de contaminacin en el conjugado Comprobar que el medio de montaje cubre la totalidad del pocillo Comprobar que los componentes del kit correcto han sido usados

FLUORESCENCIA DEL BACKGROUND EN CONTROLES Comprobar el lavado Comprobar la solucin de lavado Comprobar el tiempo de incubacin (una incubacin de mayor duracin puede provocar background). Comprobar que los pocillos no se han secado durante la incubacin: se debe usar una cmara hmeda para la incubacin.

FLUORESCENCIA EN MS DEL 50% DE LAS CLULAS EN LAS MUESTRAS DE SUERO Fluorescencia inespecfica, probablemente debido a una enfermedad autoinmune.

ANTGENOS DESPEGADOS DEL POCILLO Comprobar que la solucin de lavado no contiene detergente. Comprobar que los portaobjetos no se rayan entre s durante el lavado y secado.

FOCO BORROSO Comprobar el microscopio Comprobar que la lente no est manchada con glicerol.

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Bibliografa
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