Clula madre Este artculo o seccin necesita referencias que aparezcan en una publicacin acreditada, como revistas especializadas,

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Clulas madre embrionarias de ratn teidas con un marcador fluorescente verde. NSF. Las clulas madre son clulas que se encuentran en todos los organismos multicelulares1 y que tienen la capacidad de dividirse (a travs de la mitosis) y diferenciarse en diversos tipos de clulas especializadas y de autorrenovarsepara producir ms clulas madre. En los mamferos, existen diversos tipos de clulas madre que se pueden clasificar teniendo en cuenta su potencia2 , es decir, el nmero de diferentes tipos celulares en los que puede diferenciarse.3En los organismos adultos, las clulas madre y las clulas progenitoras actan en la regeneracin o reparacin de los tejidos del organismo.4 ndice [ocultar]

1 Generalidades 2 Tipos de clulas madre 3 Mtodos de obtencin de clulas madre 4 Reprogramacin de clulas somticas 5 Clulas madre del cordn umbilical 6 Clulas madre del lquido amnitico 7 Tratamientos con clulas madre
o

7.1 Tratamientos del cncer

7.2 Inmunohematologa

8 Clonacin 9 Controversia sobre las clulas madre 10 Puntos de vista 11 Poltica de los Estados Unidos 12 Clulas madre y clonacin en otros pases 13 Referencias 14 Bibliografa adicional 15 Vase tambin 16 Enlaces externos Generalidades[editar editar fuente] Las clulas madre, en ingls stem cells (donde stem significa tronco, traducindose a menudo como clulas troncales) tienen la capacidad de dividirse asimtricamente dando lugar a dos clulas hijas, una de las cuales tiene las mismas propiedades que la clula madre original (autorenovacin) y la otra adquiere la capacidad de poder diferenciarse si las condiciones ambientales son adecuadas.5La mayora de los tejidos de un organismo adulto poseen una poblacin residente de clulas madre que permiten su renovacin peridica o su regeneracin cuando se produce algn dao tisular.6 Algunas clulas madre adultas son capaces de diferenciarse en ms de un tipo celular como las clulas madre mesenquimales y las clulas madre hematopoyticas, mientras que otras son precursoras directas de las clulas del tejido en el que se encuentran, como por ejemplo las clulas madre de la piel, msculo o las clulas madre gonadales (clulas madre germinales). Las clulas madre embrionarias son aquellas que forman parte de la masa celular interna de un embrin de 4-5 das de edad. stas son pluripotentes lo cual significa que pueden dar origen a las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. Una caracterstica fundamental de las clulas madre embrionarias es que pueden mantenerse (en el embrin o en determinadas condiciones de cultivo) de forma indefinida, formando al dividirse una clula idntica a ellas mismas, y manteniendo una poblacin estable de clulas madre. Existen tcnicas experimentales donde se pueden obtener clulas madre embrionarias sin que esto implique la destruccin del embrin. Tipos de clulas madre[editar editar fuente]

Las clulas madre embrionarias pluripotentes se encuentran en la masa celular interna (ICM) del blastocisto. Estas clulas madre pueden convertirse en cualquier tejido del organismo, con exclusin de la placenta. Slo las clulas de una etapa anterior del embrin, la mrula, son totipotentes, capaces de convertirse en todos los tejidos del cuerpo y la placenta. Teniendo en cuenta su potencia,2 las clulas madre pueden dividirse en cuatro tipos3 :

Las clulas madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darn lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares.7 8 La clula madre totipotente por excelencia es el cigoto, formado cuando un vulo es fecundado por un espermatozoide.

Las clulas madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero s cualquier otro tipo de clula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y mesodermo), as como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes celulares. Se encuentran en distintas etapas deldesarrollo embrionario. Las clulas madre pluripotentes ms estudiadas son las clulas madre embrionarias(en ingls "Embryonic stem cells" o "ES cells") que se pueden aislar de la masa celular interna del blastocisto. El blastocisto est formado por una capa externa denominada trofoblasto, formada por unas 70 clulas, y una masa celular interna constituida por unas 30 clulas que son las clulas madre embrionarias que tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares que aparecen en el organismo adulto, dando lugar a los tejidos y rganos. En la actualidad se utilizan como modelo para estudiar el desarrollo embrionario y para entender cules son los

mecanismos y las seales que permiten a una clula pluripotente llegar a formar cualquier clula plenamente diferenciada del organismo. Asimismo, estn comenzando a ser utilizadas con xito en terapias biomdicas.7 8 Las clulas madre germinales son clulas madre embrionarias pluripotentes que se derivan de los esbozos gonadales del embrin. Estos esbozos gonadales se encuentran en una zona especfica del embrin denominada cresta gonadal, que dar lugar a los vulos y espermatozoides. Tienen una capacidad de diferenciacin similar a las de las clulas madre embrionarias, pero su aislamiento resulta ms difcil.9

Las clulas madre multipotentes son aquellas que slo pueden generar clulas de su misma capa o linaje de origen embrionario (por ejemplo: una clula madre mesenquimal de mdula sea, al tener naturaleza mesodrmica, dar origen a clulas de esa capa como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras). Otro ejemplo son las clulas madre hematopoyticas - clulas madre de la sangre que puede diferenciarse en los mltiples tipos celulares de la sangre.

Las clulas madre unipotentes, tambin llamadas clulas progenitoras son clulas madre que tiene la capacidad de diferenciarse en slo un tipo de clulas.10 Por ejemplo las clulas madre musculares, tambin denominadas clulas satlite slo pueden diferenciarse en clulas musculares.

Adems de por el criterio de potencia, las clulas madre tambin pueden clasificarse en cuanto a si se encuentran en el embrin o en tejidos adultos. Las clulas madre adultas se encuentran en tejidos y rganos adultos y que poseen la capacidad de diferenciarse para dar lugar a clulas adultas del tejido en el que se encuentran. En humanos, se conocen hasta ahora alrededor de 20 tipos distintos de clulas madre adultas, que son las encargadas de regenerar los tejidos en continuo desgaste (como la piel o la sangre) o tejidos que han sufrido un dao (como por ejemplo el hgado). En esta clasificacin se incluyen clulas madre multipotentes, como las clulas madre hematopoyticas de la mdula sea (encargadas de la formacin de la sangre). En la misma mdula sea, aunque tambin en sangre del cordn umbilical, en sangre perifrica y en la grasa corporal se ha encontrado otro tipo de clulas madre adultas, denominadas mesenquimales que puede diferenciarse en numerosos tipos de clulas de los tres derivados embrionarios (musculares, vasculares, nerviosas, hematopoyticas, seas, etc.). Aunque an no se ha podido determinar su relevancia fisiolgica se estn realizando abundantes ensayos clnicos para sustituir tejidos daados (corazn) por derivados de estas clulas. Mtodos de obtencin de clulas madre[editar editar fuente] Existen diferentes tcnicas para la obtencin de clulas madre. Las clulas madre embrionarias y algunas clulas madre adultas pueden aislarse desde su localizacin original en embriones o tejidos y mantenerse en condiciones especiales de cultivo de manera ms o menos indefinida. Las fuentes que se utilizan de manera rutinaria o que han empezado a postularse son:

Embriones crioconservados: La criopreservacin o crioconservacin es un mtodo que utiliza nitrgeno lquido (196 C) para detener todas las funciones celulares y as poderlas conservar durante aos. Estos embriones son procedentes de los tratamientos de reproduccin humana asistida, que cuando se fecundan ms de los necesarios pueden ser donados por los pacientes que se someten a este tratamiento.11 Estos embriones criopreservados en fase de blastocisto pueden conservarse durante cinco aos, segn lo reglamenta el R.D. 413/1996 [1].12

Blastmeros individuales: Con esta tcnica, probada primero en ratones y despus en humanos, se consigue no destruir el embrin. Se utilizaron vulos fecundados de ratn que se dejaron crecer hasta que tuviesen de 8 a 10 clulas. una de estas clulas se extrae y se cultiva. Con esta tcnica se ha logrado obtener dos lneas celulares estables que mostraban un cariotipo normal y presentaban marcadores caractersticos de pluripotencialidad. El embrin del que se obtiene esta clula es completamente viable por lo que se puede implantar en un tero y seguir un desarrollo normal.

Partenognesis: Este proceso reproductivo no se da en mamferos. Sin embargo, la partenognesis puede ser inducida en mamferos mediante mtodos qumicos o fsicos in vitro. Como resultado de esta activacin, se obtiene una masa celular denominada partenote de las que se pueden aislar clulas madre pluripotentes. Esta tcnica slo es aplicable en mujeres.13

Obtencin a base de donantes cadavricos: Recientes investigaciones han descrito que las [clulas madre musculares] sobreviven y mantienen sus propiedades tras un proceso de congelacin post-morten.14 15

Reprogramacin de clulas somticas[editar editar fuente] Adems de la expansin de clulas madre obtenidas del organismo, se han desarrollado tcnicas para reprogramar clulas somticas y convertirlas en clulas madre pluripotentes.16

Reprogramacin de clulas somticas por transferencia o trasplante nuclear . Consiste en extraer un ncleo de un vulo no fertilizado y sustituirlos por el ncleo de una clula somtica adulta. Al encontrarse en un ambiente propicio, el citoplasma del vulo, este ncleo es capaz de reprogramarse. Una ventaja de esta tcnica (en sus aplicaciones biomdicas) es obtener clulas madre que contengan la misma dotacin gentica que el paciente y evitar as problemas de rechazo. Esta tcnica se ha realizado con xito en mltiples especies animales, no en humanos.16 Este mtodo se ha utilizado con xito para lo que se conoce comoclonacin teraputica.

Fusin de clulas somticas y clulas madre embrionarias. Los hbridos entre diversas clulas somticas y clulas madre embrionarias comparten muchas caractersticas con las clulas madre, lo que indica que el fenotipo pluripotente es dominante en los productos resultantes de la fusin. Este tipo de clulas hbridas, tambin llamadas heterocariontes son valiosas para el estudio de los mecanismos genticos y bioqumicos implicados en la pluripotencia.16

Reprogramacin por factores de transcripcin definidos o Clulas madre pluripotentes inducidas. En el ao 2006 el grupo del doctor Shin'ya Yamanaka, de la Universidad de Kyoto, demostr que es posible reprogramar clulas somticas adultas hasta clulas madre mediante la expresin ectpica de factores de transcripcin, generando las denominadas clulas madre pluripotentes inducidas o clulas iPS ( de induced pluripotent stem cells en ingls). En el protocolo original, se reprogramaron con xito fibroblastos embrionarios de ratn (MEFs) y fibroblastos adultos tras infeccin con retrovirus que codificaban para los factores de transcripcin Oct4, Sox2, cmyc y Klf4.16 17

Clulas madre del cordn umbilical[editar editar fuente] Del cordn umbilical se puede aislar una poblacin de clulas madre multipotentes que poseen caractersticas embrionarias (expresan los factores de transcripcin OCT-4 y Nanog) y hematopoyticas (expresan el marcador de leucocitos CD45)18 . Estas clulas madre adultas pueden diferenciarse en clulas de la sangre y del sistema inmunolgico. Las clulas madre del cordn umbilical son relativamente fciles de obtener y presentan una baja inmunogenicidad, debido a la baja expresin del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), por lo que se han comenzado a utilizar en terapias para curar diversas enfermedades:

Enfermedades autoinmunes como el lupus19 . Enfermedades hematolgicas como la anemia falciforme20 . Diabetes21 .

Clulas madre del lquido amnitico[editar editar fuente] Gracias a los ltimos avances cientficos se demostr que el lquido amnitico contiene clulas de tejidos embrionarios y extraembrionarios diferenciadas y no diferenciadas derivadas del ectodermo, del mesodermo y del endodermo [2]. La tipologa y las caractersticas de las clulas del lquido amnitico varan segn el momento de la gestacin y en funcin de la existencia de posibles patologas fetales. Recientemente, se ha tenido constancia de experimentos que demuestran la presencia de clulas madre fetalesmesenquimales con potencial diferenciador hacia elementos celulares derivados de tres hojas embrionarias, por ejemplo. Las clulas madre de lquido amnitico se expanden fcilmente en cultivo, mantienen la estabilidad gentica y se pueden inducir a la diferenciacin (estudios de Paolo De Coppi, Antony Atala, Giuseppe Simoni, etc.) tambin en clulas hematopoyticas[3]. Por eso representan una nueva fuente de clulas que podra tener mltiples aplicaciones en ingeniera de los tejidos y en la terapia celular, sobre todo para el tratamiento de anomalas congnitas en el periodo perinatal. Las clulas madre de lquido amnitico no presentan controversia tica [4] y pueden conservarse para uso propio. Tratamientos con clulas madre[editar editar fuente]

El cientfico japons Shinya Yamanaka, galardonado con el Premio Nobel de Medicina de 2012, advirti en declaraciones a los periodistas de los "enormes" riesgos de ciertas "terapias con clulas madre" que no han sido ensayadas y que estn siendo ofrecidas en las clnicas y hospitales de un nmero creciente de pases.22 Las clulas madre podran tener multitud de usos clnicos y podran ser empleadas en medicina regenerativa, inmunoterapia y terapia gnica. De hecho en animales se han obtenido grandes xitos con el empleo de clulas madre para tratar enfermedades hematolgicas, diabetes de tipo 1, prkinson, destruccin neuronal e infartos. Pero an en el 2012 no existan estudios concluyentes en humanos y la Agencia Espaola del Medicamento, dependiente del Ministerio de Sanidad, adverti en octubre de 2012 sobre el riesgo de su uso indiscriminado.23 24 Algunos descubrimientos mdicos permiten creer que los tratamientos con clulas madre pueden curar enfermedades y aliviar el dolor. Existen algunos tratamientos con clulas madre, pero la mayora todava se encuentran en una etapa experimental. Investigaciones mdicas anticipan que un da con el uso de la tecnologa, derivada de investigaciones para las clulas madre adultas y embrionarias, se podr tratar el cncer, diabetes, lesiones de la espina dorsal y daos en los msculos, entre otras enfermedades. Muchos tratamientos prometedores para enfermedades graves han sido aplicados usando clulas madre adultas. La ventaja de las clulas madre adultas sobre las embrionarias es que no hay problema en que sean rechazadas, porque normalmente las clulas madre son extradas del paciente. Todava existe un gran problema tanto cientfico como tico sobre esto. En los ltimos aos se est investigando en la proliferacin in vitro de las clulas madre de cordn umbilical para aumentar el nmero de clulas madre y cubrir la necesidad para un trasplante. Estos estudios son muy prometedores y pueden permitir en un futuro utilizar clulas madre de cordn umbilical en terapia gnica: podemos as tratar enfermedades causadas por la deficiencia o defecto de un determinado gen. Introduciendo un determinado gen en la proliferacin de las clulas madre in vitro y trasplantar tales clulas en el paciente receptor. El uso de otros tipos de clulas como portadores de genes buenos en pacientes con enfermedades causadas por deficiencias o dficits genticos, se est experimentando clnicamente. Tratamientos del cncer[editar editar fuente] Recientemente han sido utilizadas las clulas madre encontradas en la sangre del cordn umbilical para tratar pacientes con cncer. Durante la quimioterapia, la mayora de las clulas en crecimiento mueren por los agentes cito txicos. El efecto secundario de laquimioterapia es lo que los trasplantes de clulas madre tratan de revertir; la sustancia que se encuentra sana dentro del hueso del paciente, el tutano, es remplazada por aquellas perdidas en el tratamiento. En la mayora de los tratamientos actuales que usan clulas madre, es preferible obtenerlas de un donante con el mismo tipo de sangre a usar las del paciente mismo. Solo si es necesario usar las propias clulas madre (siempre como ltimo recurso y si no se encontr un donante con el mismo tipo de sangre) y si el paciente no tiene guardada su propia coleccin de clulas madre (sangre del cordn umbilical), entonces la sustancia contenedora en los huesos ser removida antes de la quimioterapia, y reinyectada despus. Inmunohematologa[editar editar fuente]

El trasplante de clulas madre hematopoyticas se ha usado desde hace 50 aos con xito para tratar mltiples enfermedades: talasemias, anemia falciforme, anemia de Fanconi, errores congnitos del metabolismo, anemia aplsica grave, inmunodeficiencias combinadas graves (SCID)... Tambin han sido empleadas para el tratamiento de tumores: leucemias agudas mieloides y linfoides, leucemias crnicas mieloides, mielodisplasias, linfomas, mielomas, tumores slidos de rios, mama, ovario y neuroblastoma, etc. Esto se consigue mediante el trasplante de mdula sea. La mdula sea contiene las clulas madre precursoras de las clulas sanguneas y linfticas. Se sola sacar del hueso de la cadera, pero actualmente se est sacando de la sangre perifrica tras tratamiento con factores estimulantes del crecimiento. El xito del trasplante de mdula, al igual que en cualquier otro trasplante, depende de la compatibilidad HLA. Pero adems de poder producirse rechazo del individuo al tejido trasplantado, el trasplante de mdula sea presenta la particularidad de que tambin puede darse en sentido inverso, rechazo del tejido trasplantado al individuo (GVHD: graft versus host disease). Sin embargo el rechazo GVHD puede presentar una ventaja y ser de inters como inmunoterapia, ya que puede reconocer a las clulas malignas con las que compite como extraas y permitir una remisin ms rpida de la leucemia. Tras destruir la mdula por radiacin o quimioterapia se realiza el trasplante. A las dos semanas aparecen nuevas clulas sanguneas y tras varios meses (autlogos) o ms de un ao (alotrasplantes) se restituye la funcin inmune. Tambin es posible el empleo de clulas madre de cordn con la misma finalidad. Clonacin[editar editar fuente] Artculo principal: Clonacin. La clonacin es el hecho de transferir un ncleo de una clula somtica de un paciente a la clula sin ncleo de un donador de vulos. sta transferencia actuar como un vulo fecundado y comenzar con el proceso de divisin de la clula. Esto obviamente traer problemas en la sociedad puesto a que muchos ciudadanos piensan que no se debera "jugar a ser Dios" y crear un individuo exactamente igual a otro. Esto a su vez puede traer consigo problemas genticos puesto a que en las mitocondrias se encuentra el ADN de otro individuo. Se han hecho muchas investigaciones con la clonacin. Sin embargo existen discrepancias en cuanto a tica y moral entre investigadores. La doctora Hwang fue una de ellas, ella don sus vulos para su investigacin adems de pedir a sus compaeras dentro de la investigacin que tambin donaran. Esto trajo un problema tico, puesto que los investigadores no pueden recibir remuneracin monetaria como ella as lo hizo, adems un investigador no debe tener ningn xito personal sino para toda la comunidad.25 Controversia sobre las clulas madre[editar editar fuente] El hecho de que estas clulas actualmente implican el uso de embriones humanos y de tejido cadavrico fetal conlleva un cuidadoso examen de las cuestiones ticas relacionados con el progreso de la investigacin biomdica.26 Contrariamente, las investigaciones mdicas opinan que es necesario proceder con las investigaciones de las clulas madre embrionarias porque las tecnologas resultantes podran tener un gran potencial mdico, y que el

exceso embrionario creado por la fertilizacin in vitro puede ser donado para las investigaciones. Esto en cambio, produjo conflictos con el movimiento Pro-Life (Pro-Vida), quienes adjudican la proteccin de embriones humanos. El constante debate ha hecho que autoridades de todo el mundo busquen regularidad en los trabajos y marquen el hecho de que las investigaciones de las clulas madre embrionarias representan un desafo tico y social. De acuerdo con muchas religiones y sistemas ticos, la vida humana comienza en la fecundacin. Segn sus argumentos, cualquier medida intencional para detener el desarrollo despus de la concepcin se considera como la destruccin de una vida humana. Otros crticos no tienen un problema moral con la investigacin con clulas madre humanas, pero tienen miedo de un precedente para la experimentacin humana. Algunos crticos apoyan la idea de la investigacin, pero quieren que se impongan estrictas normas legales que impidan la experimentacin gentica con humanos, como la clonacin y que garanticen que los embriones humanos slo se obtengan a travs de fuentes apropiadas. Prevenir que la investigacin con clulas madre humanas se convierta en una pendiente resbaladiza hacia experimentos genticos humanos es considerado por la mayora de la sociedad un punto importante en la controversia de las clulas madre humanas. Dentro de la comunidad mdica, existen diferentes posturas, entre ellas que los blastocitos o embriones son organismos vivos que dentro de 9 meses sern seres humanos con derechos, por esto, no es tico el destruir el blastocito o embrin para obtener las clulas madre,27 mientras que otros consideran que en la edad temprana de un embrin lo que se tiene es un brote de clulas con su masa interna. Adems de los problemas ticos que conlleva la destruccin del blastocito, tambin se encuentra anti-tico el hecho de que se necesiten una cantidad alta de vulos para la creacin de embriones, que sern destruidos luego, y cmo se obtienen esos vulos. La donante de vulos es tratada primero con algunas drogas y hormonas para que sta cree muchos vulos que sern donados. Estas drogas pueden traer problemas de salud lo cual es anti-tico hacer dao a un paciente con conocimiento. La finalidad natural, primaria y principal de la medicina y del progreso tcnico-cientfico es la defensa y la proteccin de la vida humana. La ciencia tiene sentido en la medida que se ajusta a la tica natural salvaguardando la vida. Una ciencia sin la gua de los criterios ticos acaba revertindose en contra del ser humano, para cuyo servicio naci.28 Puntos de vista[editar editar fuente] Los debates han motivado al movimiento Pro-Life,[cita requerida] el cual se preocupa por los derechos y el estado de un embrin como un humano de temprana edad. Este movimiento cree que las investigaciones relacionadas con las clulas madre, instrumentaliza y viola lo que llaman la santidad de la vida y deberan ser consideradas como un asesinato. Las ideas fundamentales de aquellos que se oponen a estas investigaciones son la defensa de lo que llaman inviolabilidad de la vida humana y que la vida humana empezara cuando un espermatozoide fertiliza un vulo para formar una sola clula.

Una parte de las investigaciones usa embriones que fueron creados pero no usados en la fertilizacin in vitro para derivar una nueva lnea de clulas madre. La mayora de estos embriones tiende a ser destruida, o guardada por largos perodos, pasando su tiempo de vida. Solamente en Estados Unidos, se han estimado alrededor de 400.000 embriones en este estado. Las investigaciones mdicas sealan que las clulas madre tienen el potencial para alterar dramticamente el acercamiento a la comprensin y tratamiento de enfermedades, y para aliviar sufrimiento. En el futuro, la mayora de las investigaciones mdicas anticipan el uso de tecnologas derivadas de las investigaciones de clulas madre para tratar varias. Heridas en la espina dorsal y el prkinson son dos ejemplos que han sido reconocidos por personas famosas (por ahora, Christopher Reeve y Michael J. Fox). En agosto de 2000, el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos dijo: "[...] Investigaciones sobre clulas madre pluripotentes [...] prometen nuevos tratamientos y posibles curas para muchas enfermedades y lesiones, como prkinson, diabetes, problemas del corazn, esclerosis mltiple, quemaduras y lesiones de la espina dorsal. La NIH cree que el potencial mdico de las clulas madre pluripotentes beneficiarn las tecnologas mdicas y sern compatibles con la tica. Recientemente, investigaciones de Advanced Cell Technology (Tecnologa Celular Avanzada) en Woecester lograron obtener clulas madre de un ratn sin matar a los embriones. Si esta tcnica se mejora ser posible eliminar algunos de los problemas ticos relacionados con las investigaciones embrionarias de clulas madre. En 2007 se descubri otra tcnica gracias a los equipos de investigaciones de Estados Unidos y Japn. Se reprogramaron las clulas de la piel humana para funcionar ms como clulas embrionarias cuando se les introduce un virus. Extraer y clonar clulas madre es caro y complejo, pero el nuevo mtodo de reprogramacin es mucho ms barato. Sin embargo, la tcnica puede alterar el ADN de las nuevas clulas madre, causando cncer de piel. En 2007 se empez a trabajar con clulas madre pluripotentes inducidas ("CPMI") mediante la manipulacin de slo cuatro genes; ms tarde, se ha conseguido reducir el nmero a slo dos de esos cuatro genes; e incluso, con slo introducir en la clula las cuatro protenas codificadas por los cuatro genes. El proceso consiste en extraer una clula del paciente a tratar, manipular dichos 4 o 2 genes o introducirle las cuatro protenas codificadas por esos cuatro genes, cultivarlas e introducirlas en el paciente o provocar su diferenciacin hacia el tipo celular que se necesite (uno o varios, ya que las clulas madre as creadas se comportan como clulas embrionarias). An no hay experiencia en seres humanos y est por resolver el pequeo pero cierto riesgo de tumores. Poltica de los Estados Unidos[editar editar fuente] A partir del 1 de agosto del 2001 no se utilizar fondos gubernamentales para las investigaciones de las clulas madre embrionarias; adems que a partir de ese momento solo se utilizar las lneas celulares preexistentes antes del 1 de agosto de 2001, dijo Bush en una conferencia de prensa. A pesar de que Bush adopt esta postura, no se opuso a que instituciones privadas experimentaran con clulas madre embrionarias. Es por esto que surgi la proposicin 71 en

noviembre de 2004 en California, que autoriza a crear el Institute for Regenerative Medicine en California por un periodo de diez aos.29 Clulas madre y clonacin en otros pases[editar editar fuente] La clonacin teraputica / embrionaria va muy de la mano con este tema. Sin embargo existen pases que se oponen a ambas clonaciones o solo una o ninguna. Tambin se oponen a la experimentacin con clulas madre. Por ejemplo:

Unin Europea: s lneas celulares embrionarias, no clonacin teraputica. Estados Unidos: es legal la creacin de lneas celulares pero sin fondos pblicos. La legalidad de la clonacin teraputica depende del estado en que se encuentre.

Reino Unido: S lneas celulares embrionarias. S a la clonacin teraputica. Suecia: S lneas celulares embrionarias. La clonacin teraputica es legal. Israel: legal lneas celulares embrionarias y la clonacin teraputica. China: legal lneas celulares embrionarias y la clonacin teraputica. Brasil: lneas celulares embrionarias legales de embriones creados por fertilizacin in-vitro con 3 aos de edad/ No legal la clonacin teraputica .

Corea del Sur: S lneas celulares embrionarias. Permitido con autorizacin del Ministro de salud del pas. Singapur: lneas celulares embrionarias legal si el blastocito es destruido 14 das despus de la fecundacin. Es legal la clonacin teraputica.

Australia: S lneas celulares embrionarias, no es legal la clonacin teraputica.

Qu son y para qu sirven las CLULAS MADRE?

Las Clulas Madre son las encargadas de producir todos los tipos de clulas en el cuerpo y se han utilizado para sanar diversos canceres, trastornos de la sangre y genticos, entre otros.

Recientes y esperanzadoras investigaciones nos han demostrado que las Clulas Madre tambin tienen la potencialidad de reproducir clulas de rganos vitales como neuronas, clulas cardiacas, hepticas, pancreticas, etc.

Las Clulas Madres le ofrecen a su bebe y a toda su familia una segunda oportunidad de vida combatiendo con xito diferentes patologas que pueda padecer una persona a lo largo de su vida.

Por qu las clulas madre de su beb son nicas?

Las Clulas Madre (CM) de cordn umbilical de su beb son nicas porque son un regalo de la naturaleza. Solo ellas nos permiten nacer con una segunda oportunidad. Las clulas adultas normales del hombre no tienen la capacidad de multiplicarse indefinidamente y, por lo tanto, tienen una muerte celular programada.

Las clulas madre, por su parte, son clulas maestras que tienen caractersticas biolgicas nicas: son inmaduras e indiferenciadas, con capacidad indefinida de divisin, guardando la posibilidad de generar diferentes tejidos. Es decir, son parte vital del ciclo celular que lleva a la reparacin corporal.

En otras palabras, las clulas madre son un tipo especial de clula que tiene la capacidad de dividirse indefinidamente y convertirse en clula especializada de diferentes tejidos. Se dividen indefinidamente porque al hacerlo no pierden los telmeros que son las terminaciones de la cadena de ADN que permite la divisin celular. Por esta razn, su funcin en el organismo es mantener, regenerar y muchas veces reconstruir tejidos. Son la lnea divisoria entre salud y enfermedad, as como entre juventud y vejez.

De qu manera las clulas madre regeneran tejidos y en donde se forman?

Las Clulas Madre o clulas maestras son las encargadas de producir todos los tipos de clulas en el cuerpo. Estas CM circulan por el organismo permanentemente y se especializan en el momento en el que una clula adulta o diferenciada as lo requiere. Para esto, la clula madre se une a la clula adulta y copia sus caractersticas diferencindose y convirtindose en una clula adulta del mismo tejido de la clula a la cual se adhiri.

LAS FUENTES DE CLULAS MADRE SON:

Las clulas madre de cordn umbilical son diferentes a otras clulas madre?

Las clulas madre de cordn umbilical tienen cualidades biolgicas nicas. Estas contienen 10 veces ms clulas productoras de sangre que las que se obtienen de mdula sea, son inmunolgicamente inmaduras y tienen mayor probabilidad de ser compatibles entre miembros de una familia. Adems, las clulas madre de sangre de cordn umbilical congeladas desde el nacimiento, no experimentan el mismo proceso de envejecimiento, ni la misma exposicin a virus y agentes infecciosos externos que las clulas madre provenientes de donantes adultos.

Para qu sirven las Clulas Madre?

La tecnologa y la investigacin mdica han dado pasos agigantados en los ltimos aos. Uno de estos avances es el concerniente a las CM. Este avance puede constituir una alternativa muy importante para el tratamiento de algunas enfermedades. De hecho, los tratamientos realizados con clulas madre en la actualidad han salvado ms de 25.000 vidas y se han convertido en una alternativa superior a los transplantes de mdula sea.

Porqu las CM son un regalo de la naturaleza?

El primer transplante de clulas madre de cordn umbilical se realiz hace aproximadamente 22 aos en Pars, con una nia que presentaba un tipo de anemia. Hoy en da, el 66% de clulas madre de cordn umbilical son utilizadas en poblacin infantil. As, desde 1.989 se ha demostrado la utilidad de este tipo de clulas como parte de tratamiento de diversas enfermedades hematolgicas. Hoy existe evidencia de la utilizacin de este recurso en el tratamiento de ms de 70 enfermedades malignas y no malignas. Entre otras:

ENFERMEDADES MALIGNAS:

ENFERMEDADES NO MALIGNAS:

En los ltimos 22 aos, se ha usado exitosamente las CM de cordn umbilical y mdula sea en toda clase de pacientes (de ambos sexos, de todas las etnias y cualquier edad). Este procedimiento, cuenta con la aprobacin de instituciones cientficas, de profesionales mdicos y de los organismos de control alrededor del mundo.

Porqu congelarlas en un banco de clulas madre privado?

Un banco privado de CM permite a los padres recolectar y almacenar las CM de cordn umbilical de su beb para su posible uso en el futuro.

En Bolivia el ndice es de 2 donantes de rganos por cada milln de habitantes, cifra que habla de la gran dificultad en encontrar donantes y receptores de rganos que sean compatibles. De ah la importancia de guardar las CM de cordn umbilical del beb en un banco privado, en donde la donacin es autloga (de l para l). As no slo se soluciona este problema para l beb, sino que se aumentan las posibilidades de compatibilidad entre miembros de la familia, dependiendo si hay o no una compatibilidad "Human Linfocist Antigen" adecuada.

Las CM de cordn umbilical, al ser inmunolgicamente inmaduras y menos desarrolladas, tienen una mayor compatibilidad con personas del ncleo familiar. Estas son 100% compatibles con el dueo, ms o menos 70% con sus hermanos y en menor porcentaje con padres y abuelos a medida que el grado de consanguinidad se aleja.

Tambin se ha encontrado que la enfermedad de injerto contra husped es menor cuando se transplantan clulas madre de cordn umbilical.

Si mi hijo desarrollara una determinada enfermedad,no tendra su sangre de cordn esta misma enfermedad?

Cada ao se realizan miles de transplantes autlogos de CM para enfermedades como leucemia, linfoma, mieloma mltiple y en general enfermedades del sistema sanguneo y las defensas.

Recientemente un beb en Canad recibi un transplante de sus propias CM de cordn umbilical para tratar un retinoblastoma (cncer en el ojo) que se haba expandido hasta su mdula espinal. La intuicin de sus padres de guardar sus CM de sangre de cordn umbilical, le dio la mejor opcin para sobrevivir. Un ao despus del transplante, el progreso del nio era muy favorable.

Cules son las probabilidades de que mi familia necesitara utilizar las clulas madre de cordn umbilical?

Considerando que la causa de la mayora de los cnceres es desconocida y que la tecnologa relacionada con CM avanza rpidamente, resulta imposible calcular la probabilidad real de utilizar las CM de cordn umbilical dentro de la familia. Segn el estudio de expertos, la probabilidad de que una persona requiera de sus propias CM antes de cumplir los 21 aos es de aproximadamente 1 en 2.700, mientras que la probabilidad de que un miembro de la familia sea quien las necesite es de aproximadamente 1 entre 1.400.

Sin embargo, estos estimados no consideran la posibilidad de uso adulto (despus de los 21 aos de edad) o de aplicar las CM para otros usos potenciales, como en el tratamiento de enfermedades auto inmunes como la esclerosis mltiple, lupus, artritis reumatoide, entre otros.

Si alguien de mi familia necesita un transplante, podramos obtener una muestra de un banco pblico?

Con suerte, s. Los ms grandes bancos pblicos del mundo se encuentran en pases de origen anglo sajn, motivo por el cual encontrar un donante para un enfermo de origen latino es casi un milagro.

En la actualidad las personas que requieren un donante de clulas madre fallecen en las listas de espera y no en los transplantes; mas an el ltimo reporte de la FDA (Federal Drug Administration en EUA) inform que desde 1997 al 2005 en los EUA, un milln de personas enfermas que requirieron un trasplante de mdula sea pero solo 100 mil lograron encontrar un donante, por lo tanto 900 mil personas murieron por no tener suerte.

En Bolivia no existe un reporte estadstico del tal tipo, pero cada ao mueren muchas personas de canceres de mdula sea que probablemente se hubieran beneficiado de un transplante. Realmente sta es la razn por la cual es un deber congelar clulas madre de cordn umbilical en el momento del parto. Las CM de un pariente (de preferencia hermano) generalmente son la mejor opcin de tratamiento. De hecho, un estudio ha demostrado que la probabilidad de sobrevivir un ao para pacientes tratados con sangre de cordn umbilical de un hermano es aproximadamente 63%. Si se trata de un donante no familiar, esta sobre vida disminuye a solo un 29%..

Por cuanto tiempo se pueden almacenar las clulas madre?

Los lineamientos sobre CM de sangre de cordn umbilical del departamento estatal de salud del estado de Nueva York indican que no existe actualmente evidencia de que las clulas almacenadas a 196C que no han sido perturbadas, pierdan, ya sea su viabilidad determinada in-Vitro, o su actividad biolgica. Por lo tanto, en este momento no existe una fecha de caducidad que pueda asignarse a la cro preservacin de CM de sangre de cordn umbilical que han sido guardadas en nitrgeno lquido.

En el mundo, la experiencia ms larga en congelacin ha sido con semen. Se han congelado espermatozoides por ms de 40 aos, por lo que se piensa que las CM tambin sean efectivas en perodos de tiempo an mayores. Hoy en da existen pacientes vivos transplantados con CM de cordon que haban sido congeladas por ms de 22 aos.

El futuro

En el rea de investigacin animal se estn realizando importantes avances con la utilizacin de CM en el tratamiento de enfermedades como la diabetes, enfermedad de Parkinson, Alzheimer, esclerosis mltiple, desordenes neurolgicos (accidentes cerebro vasculares o traumas), lupus AR, enfermedades cardiovasculares como el infarto del miocardio y la arteriosclerosis, lesiones traumticas y problemas de retina, entre otras.

Actualmente se dice que el futuro de las CM de origen embrionario, as como en casos aislados en las CM de origen adulto (mdula sea, sangre de cordn umbilical, entre otras), est asociado con la capacidad que stas tienen de regenerar tejidos. Estamos en la era de la medicina regenerativa!

Cmo se recolectan las clulas madre de cordn umbilical?

La recoleccin de las clulas madre provenientes de la sangre fetal de cordn umbilical y placenta es un proceso sin riesgo, ni dolor para la madre o el beb recin nacido. Es un procedimiento que no demora ms de tres minutos, no causa ninguna molestia y su propio mdico gineco obstetra lo puede realizar.

La recoleccin se hace a travs de un estuche que se debe llevar a la sala en el momento del parto. En l est incluido todo lo necesario para la toma de la muestra y posterior envo al banco en donde sern procesadas, separadas de otros componentes de la sangre, congeladas y custodiadas. La muestra puede ser recolectada por su mdico gineco obstetra ya que el procedimiento es sencillo y no es necesario incomodarla a usted o a su mdico con una persona extraa en el momento del parto. Es en su mdico gineclogo en quin usted est confiando su vida y la de su beb y no es conveniente quitarlo de su lado slo para tomar la muestra de sangre.

El procedimiento, como se dijo anteriormente, es muy sencillo. Inmediatamente despus de que el cordn umbilical ha sido cortado y ligado (y el beb est ya con el pediatra) y antes de que la placenta se alumbre, se pincha una vena del cordn y se deja que la sangre remanente en el cordn umbilical y la placenta drene en una bolsa especial para recolectar sangre. Una vez la sangre est recolectada, hay un perodo de tiempo de mximo 48 horas para procesar la muestra y congelarla. Durante este tiempo no es necesario refrigerarla.

Cmo tomar la decisin de congelar las clulas madre e su beb?

Como usted puede darse cuenta, la decisin de congelar clulas madre de sangre fetal remanente en el cordn umbilical y la placenta de su beb es muy importante. Es usar este recurso biolgico y darle una segunda oportunidad de vida a su hijo o algn otro miembro de su familia, en lugar de tirarlo a la basura, como se haca antiguamente.

Es crucial congelarlas, an ms, si en su familia hay antecedentes o predisposicin a ciertas enfermedades, si tiene un nio con necesidad de transplante de mdula sea, si tiene un embarazo in Vitro con un donante de vulo o esperma desconocido, si ha hecho uso de la adopcin, o si simplemente quiere guardar este regalo de vida para su hijo que podra necesitarlas en el futuro.

La persona que puede beneficiarse de este adelanto tecnolgico, que a futuro es todava ms prometedor, tiene una sola oportunidad en la vida de conseguirlo el momento de su nacimiento! Y slo usted puede darle ese regalo de vida. La decisin est en sus manos. Ahora que ya sabe que son y para que sirven las CM de cordn umbilical y que no guardarlas sera un desperdicio fatal, djenos contarle porqu al tomar la decisin, su mejor opcin es hacerlo con BANCO DE VIDA, Banco Nacional de Clulas Madre. Estamos seguros de que su hijo y su familia le agradecern haberle dado la opcin de UNA SEGUNDA OPORTUNIDAD DE VIDA

BANCO DE VIDA le ofrece el respaldo, la seguridad, seriedad y confianza que usted necesita en el momento de tomar esta decisin.

Protoplastos

Carlos Lpez Encina

Qu es un protoplasto?: Un protoplasto vegetal puede definirse como: La parte de la clula vegetal que est delimitada e incluida dentro de la pared celular y que puede ser plasmolisada y aislada por eliminacin mecnica o enzimtica de la pared celular. El protoplasto es por lo tanto una clula desnuda, rodeada por su membrana plasmtica, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse (Vasil, 1976). Cul es su historia?: El pionero en el aislamiento de protoplastos fue Kiercker, que consigui en 1892 obtener los primeros protoplastos por mtodos quirrgicos, complejos y poco eficaces. Hubo que esperar 68 aos hasta que Cocking (1960) demostr la posiblidad de aislar por mtodos enzimticos grandes cantidades de protoplastos viables. Una vez establecida la eficacia del mtodo enzimtico y su enorme superioridad sobre el mtodo quirrgico, la tcnica ha sido objeto de multiples refinamientos y ajustes, siendo aplicada a multitud de especies vegetales con diverso xito. Para qu sirven?: Los protoplastos son una herramienta fundamental para la investigacin en biologa fundamental y aplicada. La ausencia de una pared celular rgida (obstculo fsico-qumico) y la completa exposicin de la membrana celular convierte a los protoplastos en un sistema ideal para la investigacin en procesos de transporte y divisin celular, morfognesis, mutagnesis, seleccin, etc. Quiz la aplicacin ms utilizada actualmente es la transformacin gentica por hibridacin o fusin somtica, por introduccin-absorcin de protenas, DNA (vegetal, vrico o bacteriano), macromolculas, etc. En fitopatologa se utiliza para estudiar la etiologa de los virus, su absorcin, procesos infectivos y replicacin; la especificidad y modo de actuacin de hongos y bacterias patgenas, la evaluacin de toxinas, y finalmente la obtencin-seleccin de clones resistentes a diversos patgenos y productos fitosanitarios para la mejora gentica. De dnde se obtienen?: De muy diversas partes de la planta, cultivadas tanto in vitro como ex vitro. As pueden obtenerse protoplastos de tejidos de callo, pices de raz, cladodios, pices de tallo, frutos, ndulos de races, coleptilos, lminas de aleurona de cereales, microsporas e incluso de tubos polnicos, pero en la actualidad la fuente de protoplastos ms habitual es el tejido de mesfilo de las hojas jovenes. Cmo actan los enzimas?: El aislamiento de protoplastos depende en gran medida del tipo y concentracin de los

enzimas utilizados. Los dos enzimas esenciales son la celulasa y la pectinasa, que degradan especficamente los componentes celulsico y pectnico de la pared celular. Algunos tejidos tambien requieren hemicelulasas adicionales para una correcta digestin de la pared. Otros preparados enzimticos como la driselasa desarrollan un conjunto de actividades lticas: celulasas, laminarinasas, xilanasas, pectinasas. Todos los preparados enzimticos incluyen impurezas, como nucleasas y proteasas, que pueden tener un efecto negativo sobre la viabilidad celular. Los enzimas son pH dependientes (4-6) ysu temperatura ptima de actuacin es de 40 a 60C. Debido a la fragilidad osmtica de los protoplastos, es necesario controlar perfectamente el potencial osmtico tanto de la solucin enzimtica, como de la solucin de lavado y de la solucin de recuperacin y cultivo de los protoplastos. Para ello se usan osmticos inicos o no inicos como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro clcico, etc, a distintas dosis. Cules son las fases del protocolo?: La primera fase es la obtencin, preparacin y desinfeccin del material vegetal. La segunda fase es la eliminacin de la pared celular mediante enzimas lticos, en una solucin con un alto potencial osmtico. La tercera fase es la recuperacin de los protoplastos, incluye la eliminacin de los enzimas por lavado y el paso a un medio de cultivo para la recuperacin de la pared y la promocin de las primeras divisiones celulares de las clulas individuales obtenidas de los protoplastos. As como la regeneracin de la pared no representa ninguna dificultad, ya que ocurre inmediatamente al eliminar los enzimas, la fase de divisin celular, suele ser muy problemtica y por diversas causas necesita la cuidadosa purificacin y manipulacin previa de los protoplastos as como la puesta a punto de un medio de cultivo especfico y complejo, con sales minerales, vitaminas, carbohidratos, reguladores de crecimiento y una dosis reducida paulatinamente del agente osmtico; esto se realiza incubando el material a unos 25C en condiciones de oscuridad de 5 a 7 das. En esta fase se realizan los tratamientos y la seleccin del material frente a diversos agentes. La cuarta fase es el cultivo de los microcallos obtenidos tras la divisin celular, se cambia en ella la densidad poblacional, la composicin del medio de cultivo, que se hace menos exigente y la incubacin se hace con luz. La quinta fase es la regeneracin de plntulas a partir del tejido de callo, mediante modificaciones de la composicin hormonal-mineral del medio de cultivo. La sexta fase es el transplante y aclimatacin de las plantas obtenidas en invernadero. Cmo est el tema en la actualidad?: A pesar de que los avances de los ltimos diez aos se pueden calificar de espectaculares y continuamente se pone a punto la tcnica para nuevas especies, la aplicacin de estas tcnicas se ha estabilizado o ralentizado un poco, ya que a la dificultad propia de la tcnica, que solo permite su utilizacin rutinaria en un nmero limitado de especies modelo, se une el cambio de moda u orientacin de la ingeniera gentica, que de pasar necesariamente por los protoplastos y su fusin, ha cambiado a otros mtodos de transformacin gentica, algo mas sencillos y dirigibles, aunque sin invalidar en absoluto estos mtodos basados en los protoplastos en los que se sigue trabajando activamente.

Protoplasto
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Protoplasto, del griego antiguo (primero) + (moldear), inicialmente la palabra se refiere al primer cuerpo organizado de una especie. En biologa un protoplasto es una clula de planta, bacteria u hongo que ha perdido total o parcialmente su pared celular, para lo cual se usan mecanismos enzimticos que degradan los peptidoglicanos que la componen. Cuando se elimina totalmente la pared celular se forman protoplastos; cuando la pared slo se elimina parcialmente se forman esferoplastos. 1 Los protoplastos se obtienen de bacterias Gram positiva y los esferoplastos de bacterias Gram negativa.1

Obtencin y mantenimiento de protoplastos[editar editar fuente]

Los protoplastos se obtienen del mesfilo de la hoja en plantas, y tambin a partir de suspensiones celulares.2 Son mantenidos en medio de cultivo celular que permitan nutrir adecuadamente la clula; esto contempla el suministro demacronutrientes y micronutrientes, incluyendo molculas orgnicas que sean necesarias, como vitaminas. Estas clulas, al carecer del refuerzo mecnico que otorga la pared celular, quedan ms proclives a destruirse por diferencias depresin osmtica con respecto al medio.1 En el caso de un medio hipertnico respecto al medio intracelular, se puede producir unacrenacin del protoplasto. A su vez, un medio hipotnico puede producir citlisis del protoplasto. Es por esto que el medio de mantencin debe estar ajustado de manera que no hayan diferencias osmticas significativas con las clulas mismas. As mismo, se debe controlar las temperaturas en las cuales se mentienen los protoplastos, lo cual depender del tipo que sean (fngico, bacteriano o vegetal). Adicionalmente, los protoplastos vegetales requieren un control de la luminosidad de cultivo.

Uso de protoplastos[editar editar fuente]

Se usan los protoplastos en el estudio del comportamiento de la membrana plasmtica, incluyendo el ingreso de macromolculas yvirus. Tambin se usan ampliante en la transformacon gentica de bacterias y de clulas vegetales. Al estar desprovistos de pared, es ms fcil introducir ADN exgeno en los protoplastos, que en las bacterias o clulas vegetales ntegras. De ah que los protoplastos son ampliamente usados en Ingeniera Gentica de Bacterias y en el estudio de la expresin temporal de genes en plantas. Por otro lado, a partir de un protoplasto se puede regenerar una planta completa usando micropropagacin, una tcnica moderna usada en cultivo de tejidos vegetales. Finalmente, tambin se usan protoplastos en el mejoramiento gentico vegetal. Para ello se usa una tcnica conocida como fusin de protoplastos, en la que protoplastos de diferentes plantas se fuerzan a fusionarse para generar tejidos hbridos. 2 De esta forma se puede generar:

Plantas poliploides, fusionando dos plantas de la misma especie, lo que lleva a una duplicacin del nmero de cromosomas que poseen respecto a las plantas originales.

Plantas que posean cromosomas de distintas especies o variedades en una misma planta, a partir de la fusin de dos plantas diferentes.

PLASMIDO Definicin: Los plsmidos son fragmentos extracromosmicos de cidos nuclicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao variable aunque menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plsmidos tienen una conformacin variable que puede ser lineal, circular o con estructura superenrrollada. El control de la replicacin del plsmido depende del tipo de plsmido, existiendo plsmidos cuya replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y plsmidos cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma. El tipo de genes que portan los plsmidos es variado, tratndose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibiticos, genes de produccin de sustancias txicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas tiles para degradar sustancias qumicas.

Los plsmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. Uno de estos criterios es el tipo de genes que portan. As se define el grupo de plsmidos con genes de degradacin de sustancias, el grupo de plsmidos con genes de fertilidad, el que porta genes de virulencia o el grupo que porta genes de resistencia.

Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como transformacin. El proceso de transformacin comienza con la seleccin de un plsmido adecuado, en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos especficos que usan enzimas de restriccin y DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plsmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen plsmidos con caractersticas que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plsmidos con genes de resistencia a antibiticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados.

Aunque los plsmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con dificultad de una clula a otra se ha hipotetizado que podran ser los precursores de los primeros virus.

Plsmido

Dibujo esquemtico de un plsmido en una bacteria: en rojo, el ADN del cromosoma; en azul, los plsmidos.

Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula. El trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo molecular norteamericanoJoshua Lederberg en 1952.1 Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas. En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn es el de los plsmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibitico, de manera que el plsmido nicamente supondr una ventaja en presencia de ese antibitico. Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el cromosoma y se sitan en su interior, con lo cual, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma. Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal as como tambin porque es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas. Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologa, debido a la fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los organismos modificados genticamente.
ndice
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1 Resistencia a los antibiticos 2 Epsomas

3 Tipos 4 Aplicaciones 5 Extraccin del ADN plasmdico 6 Conformaciones 7 Referencias 8 Vase tambin 9 Enlaces externos

Resistencia a los antibiticos[editar editar fuente]

Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que le confieren una ventaja selectiva lo cual les da la habilidad de hacer a la bacteria, resistente a los antibiticos. Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plsmidos de la mayora de las bacterias son circulares, pero tambin se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayora de eucariotes.

Epsomas[editar editar fuente]

Un epsoma es un plsmido que puede integrarse por s mismo al ADN cromosomal del organismo husped. Por esta razn, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada divisin celular del husped y volverse parte bsica de su mapa gentico. Este trmino no se usa ms en plsmidos, debido a que ahora est claro que una regin homologa con el cromosomaelabora un plsmido dentro de un epsoma. Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Estos son usados para transferir genes desde un organismo a otro y tpicamente contienen un marcador gentico confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayora tambin contienen un polivinculador o sitio de clonado mltiple (MCS), el cual es una pequea regin que contiene los sitios de restriccin ms comnmente usados, permitiendo una fcil insercin de fragmentos de ADN en ese lugar.

Tipos[editar editar fuente]

Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra genes, los cuales ejecutan complejos procesos de conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a otra bacter ia. Los plsmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos pueden transferirse nicamente con la asistencia de los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente. Una clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia. Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple. Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones vitales de los plsmidos. Por lo tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.

Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:

Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de conjugarse. Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.

Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.

Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales como tolueno o cido saliclico. Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales. Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido a la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas. Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija que retienen una copia del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija que falla al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula padre. Este es un ejemplo de plsmidos como el ADN replicante.

Aplicaciones[editar editar fuente]

Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de gentica e ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes particulares expresos. Muchos plsmidos estn disponibles comercialmente para dichos usos. El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin. Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado. Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas.. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos.

Extraccin del ADN plasmdico[editar editar fuente]

En el maxiprep, se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias en suspensin. Esencialmente este es un escalado de la preparacin mini-prep, el cual es seguido por una purificacin adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg) de ADN plsmido muy puro.

En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la extraccin plasmdica a varias escalas, pureza y niveles de automatizacin.

Conformaciones[editar editar fuente]

El ADN plsmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales (para un tamao dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electrofortica (velocidad para un voltaje dado), del ms lento al ms rpido:

Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario. Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este como un cordn que no se ha conectado as mismo.

circular relajado: ADN que interacta completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimticamente relajado. Usted puede modelar este dejando un cordn relajado y luego conectndolo a s mismo.

superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver ms abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparacin del plsmido.

ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma compacta.

La tasa de migracin de pequeos fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolucin del gel decrece con el incremento del voltaje. A un bajo voltaje determinado, la migracin de un pequeo fragmento lineal de ADN est en funcin de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb) migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a que las molculas reptan desde el centro de la molcula siguiendo el sentido de la matriz de gel. La digestin restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de plsmidos. Estas enzimas rompen especficamente el ADN en ciertas secuencias cortas.

vacuna
Traduccin

vacuna vacuna f. inmun. Preparacin compuesta por antgenos que introducida en el organismo es capaz de estimular el desarrollo de anticuerpos especficos y proporcionar inmunidad especfica contra una determinada enfermedad microbiana, vrica o parasitaria. Este mtodo teraputico fue desarrollado por el mdico ingls Edward Jenner a finales del siglo xviii que observ que las personas que estaban en contacto directo con las vacas y que sufran la viruela vacuna (enfermedad benigna) no contraan la viruela humana. Para demostrar su teora introdujo en un nio pequeas cantidades de linfa procedentes de pstulas de una vaca que padeca la enfermedad; pasados unos das, en el mismo nio, inocul virus de la viruela humana y pudo comprobar que no desarroll la enfermedad. En la actualidad reciben el nombre de vacunas las preparaciones elaboradas para inducir en los organismos una inmunizacin activa. Las vacunas pueden prepararse a partir de microorganismos vivos atenuados (microorganismos no virulentos pero que conservan la capacidad para producir anticuerpos); con esta tcnica se preparan las vacunas contra la rabia, viruela y poliomielitis. Tambin pueden utilizarse grmenes muertos, como en el caso de la vacuna contra la peste, clera y fiebre tifoidea o utilizar las toxinas secretadas

por los microorganismos (toxinas extradas de las bacterias a las que se les hace perder su toxicidad, pero no su poder antignico), como en el caso de la vacuna antitetnica y antidiftrica. Los dos ltimos tipos de vacunas proporcionan inmunidad temporal. Las vacunas pueden administrarse por va oral, intramuscular o introducirse en la piel a travs de ligeras escarificaciones. Cuando una vacuna es administrada puede provocar algunas reacciones adversas: dolor o inflamacin en el punto de la inoculacin y fiebre ligera. Existen algunas contraindicaciones temporales para ser vacunado, como un estado febril agudo, alteraciones hematolgicas, afecciones cutneas y afecciones renales agudas. En la mujer embarazada slo estn contraindicadas las vacunas preparadas con grmenes vivos. En todos los pases existe un calendario de vacunaciones que se aplica desde los primeros meses de vida del nio. En Espaa es obligatoria la vacunacin contra la poliomielitis, el ttanos, la difteria, la tos ferina y el sarampin. Tambin se practican la inmunizacin contra la hepatitis B, la tuberculosis, la rubola y la parotiditis. Se recomienda tambin la vacunacin anual contra la gripe, especialmente en las personas consideradas de riesgo. Una de las funciones principales de la inmunologa es la bsqueda de nuevas vacunas; en la actualidad de est trabajando en vacunas contra la malaria, el cncer y el SIDA.
Medical Dictionary. 2011.

vacuna suspensin de microorganismos atenuados o muertos administrada por va intradrmica, intramuscular, oral o subcutnea para inducir inmunidad activa frente a enfermedades infecciosas. Enfermedad infecciosa peculiar de las vacas, caracterizada por erupcin pustulosa, inoculable y transmisible al hombre y que produce en ste la inmunidad contra la viruela. Preparacin antignica especfica cuya administracin provoca en el organismo la inmunizacin activa contra una enfermedad determinada.
Diccionario ilustrado de Trminos Mdicos.. Alvaro Galiano. 2010.

vacuna 1. Suspensin de microorganismos atenuados o muertos administrada por va intradrmica,intramuscular, oral o subcutnea para inducir inmunidad activa frente a enfermedades infecciosas. 2. Enfermedad infecciosa del ganado vacuno causada por un poxvirus que puede ser transmitido a los seres humanos por contacto directo o por inoculacin deliberada como proteccin frente a laviruela. Se desarrolla una pstula en el lugar de la infeccin, habitualmente seguida de malestar general y fiebre de varios das de duracin. Al cabo de 2 semanas, la pstula se transforma en unacostra que finalmente se desprende, dejando una cicatriz.
Diccionario Mosby - Medicina, Enfermera y Ciencias de la Salud, Ediciones Hancourt, S.A. 1999.

Vacuna
La vacuna es un preparado de antgenos que una vez dentro del organismo provoca la produccin de anticuerpos y con ello una respuesta de defensa ante microorganismos patgenos. Esta respuesta genera, en algunos casos, cierta memoria inmunitariaproduciendo inmunidad transitoria frente al ataque patgeno correspondiente. La palabra fue acuada por Jenner a partir del latn variola vaccinia, adaptado del latn vaccnus, del latn vacca, vaca. Las vacunas son el principal logro de la investigacin biomdica y una de las principales causas de la mejora de la salud y la calidad de vida del ser humano. Desde el comienzo de las epidemias en China, la experiencia y la observacin dieron lugar a los primeros mtodos de profilaxis, la variolizacin. Las primeras evidencias de estas prcticas son atribuidas a Zhang Lu. 1 La primera vacuna descubierta fue la usada para combatir la viruela por Edward Jenner en 1796,2 y debe su nombre al hecho de que las ordeadoras de la poca que estaban en contacto con la viruela de vaca o viruela bovina (viruela "vacuna"), la cual era menos patgena, haca que estas personas se inmunizasen y no contrajesen la viruela humana.

Un enfermero vacunando a un soldado de la marina estadounidense.

ndice
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1 Clasificacin 2 Origen de las vacunas 3 Cronologa de las vacunas

o o o o

3.1 Siglo XVIII 3.2 Siglo XIX 3.3 Siglo XX 3.4 Siglo XXI

4 Tipos de vacunas 5 Desarrollo de la inmunidad 6 Tabla de vacunaciones en Espaa 7 Vacunas y economa 8 Vacunas y tica 9 Vacunas y thiomersal 10 Movimiento antivacunas, y su controversia mdica 11 Referencias 12 Vase tambin 13 Enlaces externos

Clasificacin[editar editar fuente]

Las vacunas se clasifican en dos grandes grupos:

Vacunas vivas atenuadas. Vacunas inactivadas.

Existen varios mtodos de obtencin:

Vacunas avirulentas preparadas a partir de formas no peligrosas del microorganismo patgeno. Vacunas posificadas a partir de organismos muertos o inactivos. Antgenos purificados. Vacunas genticas.

Las vacunas se administran por medio de una inyeccin, o por va oral (tanto con lquidos como con pastillas).

Origen de las vacunas[editar editar fuente]

La viruela fue la primera enfermedad que el ser humano intent prevenir inoculndose a s mismo con otro tipo de enfermedad.3 Se cree que la inoculacin naci en la India o en China alrededor del 200 a. C. En China, a los pacientes que sufran tipos leves de viruela se les recogan fragmentos de pstulas secas para molerlas hasta conseguir una mezcla con aspecto de polvo que

luego se le introduca por la nariz, esperando que esto les inmunizara. En 1718, Lady Mary Wortley Montague inform que los turcos tenan la costumbre de inocularse con pus tomado de la viruela vacuna. Lady Montague inocul a sus propios hijos de esta manera.

The Cow-Pockorthe Wonderful Effects of the New Inoculation! (1802), vieta satrica de James Gillray, de las Publications of ye AntiVaccine Society, que muestra a Edward Jenner administrando vacunas contra el virus de la viruela bovina en el hospital de San Pancracio. El temor popular era que la vacuna provocara el crecimiento de apndices vacunos en los pacientes.

En 1796, durante el momento de mayor extensin del virus de la viruela en Europa, un mdico rural de Inglaterra, Edward Jenner, observ que las recolectoras de leche adquiran ocasionalmente una especie de viruela de vaca o viruela vacuna (cowpox) por el contacto continuado con estos animales, y que luego quedaban a salvo de enfermar de viruela comn. Efectivamente se ha comprobado que esta viruela vacuna es una variante leve de la mortfera viruela humana. Trabajando sobre este caso de inoculacin, Jenner tom viruela vacuna de la mano de la granjera Sarah Nelmes. Insert este fluido a travs de inyeccin en el brazo de un nio de ocho aos, James Phipps. El pequeo mostr sntomas de la infeccin de viruela vacuna. Cuarenta y ocho das ms tarde, despus de que Phipps se hubiera recuperado completamente de la enfermedad, el doctor Jenner le inyect al nio infeccin de viruela humana, pero esta vez no mostr ningn sntoma o signo de enfermedad. 4 En 1881 Louis Pasteur lleva a cabo un audaz y brillante experimento pblico para comprobar de la efectividad de la vacuna antiantrxica ideada por l, en la granja, hoy histrica, de Pouilly-le-Fort. El desarrollo del experimento fue como sigue[cita requerida]:
El 5 de mayo inyecta 24 carneros, 1 chivo y 6 vacas con 58 gotas de un cultivo atenuado de Bacillus anthracis. En mayo 17, estos mismos animales fueron inoculados nuevamente con la misma cantidad de un cultivo menos atenuado, o sea ms virulento. El 31 de mayo se realiz la prueba suprema. Se inyectaron con cultivos muy virulentos, todos los animales ya vacunados, y adems, 24 carneros, 1 chivo y 4 vacas no vacunados, que sirvieron como grupo testigo a la prueba. El 2 de junio, una selecta y nutrida concurrencia apreci los resultados, que fueron los siguientes: Todos los carneros vacunados estaban bien. De los no vacunados, 21 haban muerto ya, 2 ms murieron durante la exhibicin ante la propia concurrencia y el ltimo al caer de la tarde de ese da. De las vacas, las 6 vacunadas se encontraban bien, mientras que las 4 no vacunadas mostraban todos los sntomas de la enfermedad y una intensa reaccin febril. Louis Pasteur

Al comunicar estos resultados, Pasteur introdujo los trminos de vacuna y vacunacin que provienen de la palabra latina vacca, fruto de los resultados obtenidos al inocular el virus de la vacuna; en la terminologa mdica como homenaje a Jenner, su ilustre predecesor.

Cronologa de las vacunas[editar editar fuente]

Slo la viruela ha sido eliminada en el mundo.

Siglo XVIII[editar editar fuente]

1796: Primera vacuna para viruela.

Siglo XIX[editar editar fuente]

1879: Primera vacuna para la diarrea crnica intestinal grave; 1881: Primera vacuna para el ntrax; 1882: Primera vacuna para la rabia; 1890: Primera vacuna para el ttanos; 1890: Primera vacuna para la difteria; 1897: Primera vacuna para la peste.

Siglo XX[editar editar fuente]

1926: Primera vacuna para tos ferina; 1927: Primera vacuna para la tuberculosis; 1937: Primera vacuna para la fiebre amarilla; 1937: Primera vacuna para el tifus; 1945: Primera vacuna para la gripe; 1952: Primera vacuna para la poliomielitis; 1954: Primera vacuna para la encefalitis japonesa; 1962: Primera vacuna oral para la poliomielitis; 1964: Primera vacuna para el sarampin; 1967: Primera vacuna para la paperas; 1970: Primera vacuna para la rubola; 1974: Primera vacuna para la varicela; 1977: Primera vacuna para la neumona (Streptococcus pneumoniae); 1978: Primera vacuna para la meningitis (Neisseria meningitidis); 1981: Primera vacuna para la hepatitis B; 1985: Primera vacuna para la haemophilus influenzae tipo b (HiB); 1992: Primera vacuna para la hepatitis A; 1998: Primera vacuna para la enfermedad de Lyme;

Siglo XXI[editar editar fuente]

2005: Primera vacuna para el virus del papiloma humano (principal factor de riesgo del cncer de crvix). 2008: Primera vacuna para prevenir la adiccin a la herona y a la cocana (Aunque siguen hacindose experimentos con esta vacuna para comprobar su efectividad).

2009: Posible vacuna contra la Hepatitis C, Primera Vacuna contra la Gripe A (H1N1)

Tipos de vacunas[editar editar fuente]

Alumna del Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Ciudad de Mxico en campaa de vacunas en Mexico

Centro de vacunacin de Air France, VII Distrito de Pars

Las vacunas pueden estar compuestas de bacterias o virus, ya sean vivos o debilitados, que han sido criados con tal fin. Las vacunas tambin pueden contener organismos inactivos o productos purificados provenientes de aquellos primeros. Hay cinco tipos de vacunas:

Inactivadas: microorganismos dainos que han sido tratados con productos qumicos o calor y han perdido su peligro. Este tipo de vacunas activa el sistema inmune pero es incapaz de reproducirse en el husped. La inmunidad generada de esta forma es de menor intensidad y suele durar menos tiempo, por lo que este tipo de vacuna suele requerir ms dosis. Dado que la respuesta inmune lograda es menor, se utilizan en estas vacunas unas sustancias denominadas adyuvantes. Estas sustancias estn compuestas por aluminio y sirven a la vacuna a aumentar la respuesta inmunitaria del organismo. Los compuestos de aluminio deben inyectarse por va intramuscular profunda ya que pueden producir irritacin, inflamacin y lesin de tejidos. Ejemplos de este tipo son: la gripe, clera, peste bubnica y la hepatitis A.

Vivas atenuadas: microorganismos que han sido cultivados expresamente bajo condiciones en las cuales pierden sus propiedades nocivas. Suelen provocar una respuesta inmunolgica ms duradera, y son las ms usuales en los adultos. Esto se debe a que el microorganismo no se encuentra inactivado y conserva su estructura. Por eso, en muchas ocasiones puede provocar la enfermedad en personas inmunodeprimidas. Por ejemplo: la fiebre amarilla, sarampin o rubola (tambin llamada sarampin alemn) y paperas.

Toxoides: son componentes txicos inactivados procedentes de microorganismos, en casos donde esos componentes son los que de verdad provocan la enfermedad, en lugar del propio microorganismo. Estos componentes se podran inactivar con formaldehido, por ejemplo. En este grupo se pueden encontrar el ttanos y la difteria.

Acelulares: consisten en una mezcla de componentes subcelulares purificados del patgeno contra el que se quiere inmunizar, que normalmente consta de protenas antignicas altamente inmunognicas y que pueden contener toxoides. Una vacuna de este tipo se utiliza en la actualidad contra la tos ferina.

Recombinantes de subunidad: se utiliza la tecnologa del ADN recombinante para introducir el gen codificante para un antgeno altamente inmunognico en el genoma de un microorganismo productor (como E. coli o S. cerevisiae) con el objetivo de superproducir y purificar la protena antignica, que ser la base de una vacuna. Estas tcnicas de produccin de vacunas son muy tiles cuando el patgeno contra el que se quiere inmunizar es difcil de cultivar in vitro. Un ejemplo caracterstico es la vacuna subunitaria contra la hepatitis B, que est compuesta solamente por la superficie del virus (superficie formada por protenas). Para obtener esta vacuna, se clon el gen S del hepadnavirus causante de la hepatitis B en S. cerevisiae y se superprodujo y purific, dando como resultado y vacuna efectiva (el gen S codifica el antgeno de HBsAg autoensamblable localizado en la superficie del virus). Un tipo particular de vacunas recombinantes seran las vacunas comestibles, producidas mediante plantas transgnicas. En estos casos, el transgn transferido a la planta sera uno codificante para un antgeno de inters, que producir una respuesta inmune. Para tratarse de una vacuna comestible, la expresin del transgn debe estar dirigida por un promotor especfico de tejido, que haga que se exprese slo en determinados rganos comestibles, como las semillas de los cereales o los tubrculos. Las grandes ventajas de la produccin de vacunas comestibles residen en su bajo coste de produccin, en que el antgeno puede expresarse en rganos en los que sea estable a temperatura ambiente (como los mencionados anteriormente), lo que eliminara los costes de mantener la cadena del fro, y en la posibilidad de expresar de forma simultnea varios antgenos y adyuvantes en el mismo rgano de la planta. Por supuesto, este sistema de produccin tambin posee inconvenientes, como el control sobre el nivel de expresin del antgeno, la homogeneidad de la expresin (ajuste de dosis) o el mantenimiento de la integridad del antgeno ante sus exposicin a jugos gstricos e intestinales. Hasta ahora, los trabajos ms representativos en este tema han tratado sobre la produccin de la vacuna contra la hepatitis B, dando resultados satisfactorios al inmunizar ratones que comieron patata en la que se acumul el antgeno.

La vacuna contra la tuberculosis por ejemplo, es la llamada vacuna BCG (Bacilo de Calmette y Guerin, que debe su nombre a sus descubridores) se fabrica con bacilos vivos atenuados y por tanto no es contagiosa de esta enfermedad. Hoy da se estn desarrollando y probando nuevos tipos de vacunas:

Polisacardicas: ciertas bacterias tienen capas externas de polisacridos que son mnimamente inmunitarios. Poniendo en contacto estas capas externas con protenas, el sistema inmunitario puede ser capaz de reconocer el polisacrido como si fuera un antgeno (un antgeno puede ser una protena o un polisacrido). De esa manera generamos anticuerpos contra la bacteria y contra el polisacrido (exopolisacrido, en este caso). Este proceso es usado en la vacuna Haemophilus influenzae del tipo B (tambin conocido como bacilo de Pfeiffer).

Vector recombinante: combinando la fisiologa (cuerpo) de un microorganismo dado y el ADN (contenido) de otro distinto, la inmunidad puede ser creada contra enfermedades que tengan complicados procesos de infeccin. Los esfuerzos para crear vacunas contra las enfermedades infecciosas, as como inmunoterapias para el cncer, enfermedades autoinmunes y alergias han utilizado una variedad de sistemas de expresin heterloga, incluyendo vectores virales y bacterianos, as como construcciones recombinantes de ADN y ARN.5 Los vectores ms utilizados en este tipo de vacunas son el virus vaccinia, algunas bacterias lcticas (no patognicas) de los gneros Lactobacillus y Lactococcus y variedades atenuadas

de M. tuberculosis y Salmonella typhi (sta ultima se utiliza ms, dado que se conoce muy bien y sus efectos patognicos son mucho ms suaves). Los principales problemas de este tipo de vacunas son la posibilidad de que la respuesta inmunitaria ante ellas sea insuficiente para dejar memoria en el sistema inmune y la induccin de la produccin del antgeno una vez el vector est dentro del organismo (se est estudiando el uso de inductores como la tetraciclina y la aspirina).

Vacuna de ADN: vacuna de desarrollo reciente, es creada a partir del ADN de un agente infeccioso. Funciona al insertar ADN de bacterias o virus dentro de clulas humanas o animales. Algunas clulas del sistema inmunitario reconocen la protena surgida del ADN extrao y atacan tanto a la propia protena como a las clulas afectadas. Dado que estas clulas viven largo tiempo, si el agente patgeno (el que crea la infeccin) que normalmente produce esas protenas es encontrado tras un periodo largo, sern atacadas instantneamente por el sistema inmunitario. Una ventaja de las vacunas ADN es que son muy fciles de producir y almacenar. Aunque en 2006 este tipo de vacuna era an experimental, presenta resultados esperanzadores. Sin embargo no se sabe con seguridad si ese ADN puede integrarse en algn cromosoma de las clulas y producir mutaciones.

Es importante aclarar que, mientras la mayora de las vacunas son creadas usando componentes inactivados o atenuados de microorganismos, las vacunas sintticas estn compuestas en parte o completamente de pptidos, carbohidratos o antgenos. Estas sintticas suelen ser consideradas ms seguras que las primeras.

Desarrollo de la inmunidad[editar editar fuente]

El sistema inmunitario reconoce los agentes de la vacuna como extraos, destruyndolos y recordndolos. Cuando una versin realmente nociva de la infeccin llega al organismo, el sistema inmunitario est ya preparado para responder: 1) Neutralizando al agente infeccioso antes de que pueda entrar en las clulas del organismo; y 2) Reconociendo y destruyendo las clulas que hayan sido infectadas, antes de que el agente se pueda multiplicar en gran nmero. Las vacunas han contribuido a la erradicacin de la viruela, una de las enfermedades ms contagiosas y mortferas que ha conocido la humanidad. Otras como la rubola, la polio, el sarampin, las paperas, la varicela-zoster (virus que puede producir la varicela comn y el herpes zster) y la fiebre tifoidea no son tan comunes como hace un siglo. Dado que la gran mayora de la gente est vacunada, es muy difcil que surja un brote y se extienda con facilidad. Este fenmeno es conocido como inmunidad colectiva. La polio, que se transmite slo entre humanos, ha sido el objetivo de una extensa campaa de erradicacin que ha visto restringida la polio endmica, quedando reducida a ciertas partes de cuatro pases (India, Nigeria, Pakistn y Afganistn). La dificultad de hacer llegar la vacuna a los nios ha provocado que la fecha de la erradicacin se haya prolongado hasta la actualidad.

Tabla de vacunaciones en Espaa[editar editar fuente]

Vase tambin: Esquema de inmunizaciones en Venezuela.

Con el objetivo de proporcionar la mejor proteccin, se recomienda que los nios sean vacunados tan pronto su sistema inmunitario sea capaz de responder a vacunas, con las dosis de refuerzo posteriores que sean necesarias. Con este objetivo se elaboran a nivel nacional los calendarios o tablas de vacunaciones. En la siguiente tabla se muestran las recomendaciones del Ministerio de Sanidad, Poltica Social e Igualdad de Espaa realizadas en marzo de 2007.

Calendario de vacunacin 2008 - Actualizado el 30-03-2009.

En Espaa, el calendario de vacunaciones recomendado por el Ministerio de Sanidad comienza con el nacimiento y contina hasta los 14 aos. La administracin -en el centro de salud y/o en las escuelas- de las vacunas recogidas en el calendario es recomendada (no obligatoria) y gratuita. Cada Comunidad Autnoma tiene su propio calendario, que puede variar ligeramente del recomendado. Se pueden consultar por comunidades autnomas en la propia web del Ministerio [1]. El Comit Asesor de Vacunas (CAV) de la Asociacin Espaola de Pediatra (AEP) promueve la consecucin de un calendario de vacunaciones nico y ha actualizado sus recomendaciones en 2013.6 As mismo, tambin existen unas recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Tambin es importante destacar aquellas vacunas que en nuestro entorno no son necesarias, pero s es recomendable ponrselas cuando se va a viajar a zonas peligrosas (selvas, pases subdesarrollados...). El Ministerio de Sanidad igualmente proporciona informacin sobre este aspecto [2]. Al margen del calendario de vacunaciones y de situaciones de viaje, algunas vacunas son recomendadas durante toda la vida (dosis de recuerdo) como el ttanos, gripe, neumona, etc. Las mujeres embarazadas son a menudo examinadas para comprobar su resistencia a la rubola. En 2006 se ha ido haciendo comn una vacuna contra el herpes zoster (ripias). Para las personas de edad avanzada se recomiendan especialmente las vacunas contra neumona y gripe, enfermedades que a partir de cierta edad son an ms peligrosas.

Vacunas y economa[editar editar fuente]

La economa es uno de los mayores retos de las vacunas. Muchas de las enfermedades que ms demandan una vacuna (incluyendo elsida, la malaria o la tuberculosis) estn presentes especialmente en pases pobres. A pesar de que algunas empresas farmacuticas y compaas de biotecnologa han incentivado el desarrollo de vacunas para estas enfermedades limitadamente (dado que las expectativas de ingresos son bajas) el nmero de vacunas realmente administradas ha aumentado dramticamente en las ltimas dcadas, especialmente aquellas suministradas a los nios en los primeros aos de vida. Esto

quizs se deba ms a medidas gubernamentales que a incentivos econmicos. La mayora del desarrollo de vacunas hasta la fecha se ha debido a impulsos de gobiernos y ONG, agencias internacionales, universidades... Muchos investigadores y polticos hacen un llamamiento para unir y motivar dicha industria, usando mecanismos de presin como los precios, impuestos o compromisos empresariales que puedan asegurar la retribucin a las empresas que exitosamente consigan una vacuna contra el VIH (causante del sida).

Vacunas y tica[editar editar fuente]

El calendario oficial de vacunacin no es obligatorio, sino recomendado, por lo que como en otros tratamientos mdicos, el profesional sanitario debe explicar los beneficios y perjuicios de los efectos que puede tener sobre el paciente, y por tanto, la norma es el consentimiento informado previo a su inoculacin. El principio tico de la autonoma exige que se informe detalladamente a las personas que pueden ser vacunadas, para que tomen una decisin apropiada en libertad. 7 8

Vacunas y thiomersal[editar editar fuente]

El thiomersal (tiomersal o timerosal) es un agente antisptico y antifngico derivado del mercurio que ha sido usado como conservante en vacunas desde la dcada de 1930. Aunque actualmente la mayora de las vacunas usadas en Estados Unidos y Europa ya no usan tiomersal, diversos movimientos antivacunas achacan a este compuesto un supuesto aumento de trastornos del desarrollo como retrasos en el lenguaje, autismo e hiperactividad. El principal trabajo cientfico que apoyaba dicho vnculo9 desat una gran controversia. En 2010, una investigacin del Consejo Mdico General del Reino Unido determin que el autor de dicho estudio, Andrew Wakefield, haba violado protocolos ticos, no inform de serios conflictos de intereses y falsific datos. El Consejo decidi suspenderlo del ejercicio de la prctica mdica en el Reino Unido. 10 A la vista de dicho informe, la revista The Lancet decidi retractarse y retirar el artculo de Wakefield.11 Durante el desarrollo de la controversia, algunos estamentos mdicos oficiales estadounidenses y europeos aconsejaron una reduccin del uso de thiomersal en vacunas infantiles como respuesta a la creciente preocupacin de algunos padres a pesar de reconocer que no existen evidencias de que sea responsable de ningn trastorno.12 No obstante, tras examinar el perfil actual del thiomersal, el Comit Consultivo Mundial sobre Seguridad de las Vacunas concluy que no hay evidencia de toxicidad por mercurio en lactantes, nios o adultos expuestos al thiomersal en las vacunas. Aunque algunas autoridades nacionales de salud pblica estn tratando de sustituir las vacunas que lo contienen (como medida de precaucin), no existe evidencia cientfica contrastada de toxicidad derivada del thiomersal.

Movimiento antivacunas, y su controversia mdica[editar editar fuente]

Vanse tambin: Movimiento antivacunas y Controversia de las vacunas.

En el continente americano, el sarampin fue eliminado en 2002. No hay casos que se originen ahora porque todo el mundo han sido inmunizado. No obstante en zonas marginadas de Mxico por una aplicacin incorrecta de vacunas hay brotes de tuberculosis y casos hospitalarios por varicelas complicadas.13 En mayo de 2011 hubo un brote de sarampin en Francia. Como ya no se vean casos de sarampin, la gente pens que no haba necesidad de inmunizar a sus nios. El alto numero de casos se debi a un exceso de confianza. 14

Electroforesis

Electroforesis.

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La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico.1 La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. La electroforesis se usa en una gran mayora en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosao de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.
ndice
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1 Electroforesis 2 Velocidad de una molcula 3 Movilidad molecular 4 Factores que afectan a la electroforesis 5 Notas 6 Vase tambin

7 Enlaces externos

Electroforesis[editar editar fuente]

La gran mayora de macromolculas estn cargadas elctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y dbiles dependiendo de la constante de ionizacin de grupos cidos y bsicos. Por ejemplo los cidos nucleicos son policidos fuertes. Por lo general, para caracterizar la molcula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo elctrico y se utiliza para determinar, en el caso de protenas, la masa molecular o para detectar cambios de aminocidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares; en el caso de cidos nucleicos se determina su tamao, medido en pares de bases

Velocidad de una molcula[editar editar fuente]

Para separar distintas especies moleculares, se crea un campo elctrico para la molcula colocada en un lquido portador. Al generar este campo existir una intensidad pasando constantemente del polo positivo al polo negativo, por lo tanto, actuar una fuerza sobre la molcula y esta experimentar una aceleracin hasta obtener una velocidad en la que la resistencia, por viscosidad del medio, neutraliza la fuerza impulsora, es decir, la molcula se desplaza con una velocidad constante.

Donde q es carga y E es la intensidad del campo elctrico. Se asume que la partcula es esfrica y a partir de la Ley de Stokes se obtiene que

donde R es el radio de la esfera, su velocidad y la viscosidad del fluido. Por lo tanto la velocidad ser:

Esta velocidad se alcanza a los pocos segundos, por consiguiente se puede concluir que es constante durante todo el experimento.

Movilidad molecular[editar editar fuente]

La movilidad molecular ( ) es una magnitud caracterstica de la partcula o molcula que refleja la velocidad

relativa a la fuerza del campo.

A partir de la ecuacin de velocidad se obtiene que:

Que tambin puede ser expresada por:

Donde

el nmero de electrones y

es la carga del electrn.

La movilidad depende de la carga de la partcula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razn es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.

Factores que afectan a la electroforesis[editar editar fuente]

En general la electroforesis depende directamente del campo elctrico y este depende de distintos parmetros. Basndose en la ley de Ohm se tiene que

Diferencia de potencial (V): define el campo elctrico; la velocidad de avance es directamente proporcional a ella. Resistencia (R): la movilidad de las molculas es inversamente proporcional a ella. Intensidad (I) : cuantifica el flujo de carga elctrica, se relaciona directamente con la distancia recorrida por las molculas. Por ltimo, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente elctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra desnaturalizndola.

Secuenciacin de ADN
La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de losnucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.

Grfico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis capilar (electroferograma).

ndice
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1 Los inicios 2 Secuenciacin de Maxam-Gilbert 3 Mtodos de terminacin de la cadena

o o

3.1 Secuenciacin por terminador fluorescente 3.2 Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito

4 Pirosecuenciacin 5 Automatizacin y preparacin de las muestras 6 Estrategias de secuenciacin a gran escala 7 Nuevos mtodos de secuenciacin

o o o

7.1 Secuenciacin de alto rendimiento 7.2 Secuenciacin de una nica molcula de ADN 7.3 Otras tecnologas de secuenciacin

8 Principales hitos en la secuenciacin del ADN 9 Vase tambin 10 Referencias 11 Enlaces externos

Los inicios[editar editar fuente]

Durante treinta aos la mayor parte de la secuenciacin de ADN se llev a cabo con el mtodo de terminacin de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores, incluyendo al reconocido biologo de la universidad de Stanford, J. Navarro, en 1975.1 2 Antes del desarrollo de mtodos rpidos de secuenciacin del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,3 4 se utilizaban varios mtodos de laboratorio. Por ejemplo, en 19735 Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un mtodo conocido como "de punto corrido" (wandering spot). La secuenciacin del ARN, que por razones tcnicas es ms sencilla de llevar a cabo que la del ADN, se desarroll con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la secuenciacin del ARN, que data de la era previa al ADN recombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacterifago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de Gante.6 7

Secuenciacin de Maxam-Gilbert[editar editar fuente]

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas8 Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de secuenciacin "ms-menos",9 10 la secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar. En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20%. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace unaautoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones entre ADN yprotenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes.

Mtodos de terminacin de la cadena[editar editar fuente]

Artculo principal: Mtodo de Sanger.

Parte de un gel de secuenciacin con marcaje radiactivo.

Mientras que el mtodo de secuenciacin qumica de Maxam y Gilbert y el mtodo ms-menos de Sanger y Coulson eran rdenes de magnitud ms rpidos que los mtodos previos, el mtodo de terminacin de la cadena desarrollado por Sanger era incluso ms eficiente y rpidamente se convirti en el mtodo de eleccin. La Tcnica de Maxam-Gilbert requiere el uso de productos qumicos altamente txicos y grandes cantidades de ADN marcado radiactivamente, mientras que el mtodo de terminacin de la cadena utiliza pocos reactivos txicos y cantidades menores de radiactividad. El principio clave del mtodo de Sanger es el uso de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. El mtodo clsico de terminacin de la cadena o mtodo de Sanger necesita una hebra molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucletidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y nucletidos modificados que terminan la elongacin de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los cuatrodesoxinucletidos estndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada reaccin se aade solo uno de los cuatro didesoxinucletidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucletidos terminan la elongacin de la cadena al carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formacin del enlace fosfodister entre dos nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN. La incorporacin de un didesoxinucletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucletidos se aaden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la secuenciacin. Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por calor y separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autoradiografa o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel. En la imagen de la derecha, la pelcula de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminacin de la cadena tras la incorporacin de un didesoxinucletido (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). El nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucletido que se aadi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.

Los fragmentos de ADN se pueden marcar utilizando radiactividad o fluorescencia en el cebador (1), en la nueva cadena de ADN con dNTP marcado, o con un ddNTP marcado.

Existen algunas variaciones tcnicas del mtodo de secuenciacin de terminacin de la cadena. En un mtodo, los framentos de ADN son marcados con nucletidos marcados con fsforo radiactivo. Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente. Se siguen necesitando cuatro reacciones, pero los fragmentos de ADN marcados con colorantes se pueden leer utilizando un sistema ptico, lo que facilita un anlisis ms rpido y econmico y su automatizacin. Esta variante se conoce como "secuenciacin mediante colorantes acoplados al cebador" (dye-primer sequencing). El ltimo avance de L Hood y colaboradores11 12 desarrollando ddNTPs y cebadores con marcaje fluorescente seala el marco para una secuenciacin de ADN automatizada y de alto rendimiento.

Escala de secuencia mediante secuenciacin radiactiva comparada con mximos de fluorescencia.

Los diferentes mtodos de terminacin de la cadena han simplificado en gran medida la cantidad de trabajo y planificacin necesaria para la secuenciacin de ADN. Por ejemplo, el kit "Sequenase" de la casa USB Biochemicals, basado en el mtodo de terminacin de la cadena contiene la mayora de los reactivos necesarios para la secuenciacin, pre-divididos en alcuotas y listos para usar. Se pueden dar algunos problemas de secuenciacin con el mtodo de Sanger, como uniones no especficas del cebador al ADN, que afectan a la correcta interpretacin de la secuencia de ADN. Adems tambin puede afectar a la fidelidad de la secuencia obtenida estructuras secundarias internas de la cadena de ADN molde o ARN que pueda actuar de cebador al azar. Otros contaminantes que pueden afectar a la reaccin son el ADN exgeno o inhibidores de la ADN polimerasa.

Secuenciacin por terminador fluorescente[editar editar fuente]

Electroforesis capilar.

Una alternativa al marcado del cebador es el marcado de los terminadores de la cadena, un mtodo conocido como "secuenciacin por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este mtodo es que la secuenciacin se puede llevar a cabo en una sola reaccin, en lugar de en cuatro reacciones como en el mtodo del cebador marcado. En una secuenciacin por terminador fluorescente se marcan cada uno de los cuatro didesoxinucletidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Este mtodo es atractivo por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el mtodo de referencia en la secuenciacin automatizada con analizadores de secuencia controlados por computadora (ver ms abajo). Entre sus limitaciones potenciales estn los efectos de los terminadores fluorescentes en el fragmento de ADN, que produce alturas y formas de picos desiguales en los registros de secuencia de ADN del cromatograma tras laelectroforesis capilar (ver ilustracin de la derecha) Este problema se ha solventado en gran medida con la introduccin de nuevos sistemas enzimticos de polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporacin, as como mtodos para eliminar los "pegotes de colorante" producidos por ciertas caractersticas qumicas de los colorantes que pueden dar lugar a artefactos en los registros de secuencia de ADN. El mtodo de secuenciado por terminador fluorescente junto con analizadores de secuencia de ADN de alto rendimiento se utiliza ahora para la inmensa mayora de los proyectos de secuenciacin, puesto que es ms fcil de llevar a cabo y tiene un coste menor que los anteriores mtodos de secuenciacin.

Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito[editar editar fuente]

La secuenciacin por bisulfito es una variante de la secuenciacin Sanger utilizada para el mapeo de metilaciones aleloespecficas en los sitios CpG. Se extrae el ADN a secuenciar y se fragmenta con el fin de facilitar la posterior desnaturalizacin

a la que se va a someter para separar las dos hebras de ADN. A continuacin se incuba en presencia de bisulfito entre 15 y 20 horas. Dicho compuesto acta desaminando las citosinas del ADN convirtindolas en uracilo. Sin embargo, es incapaz de actuar sobre aquellas que se encuentren metiladas. El siguiente paso consiste en la amplificacin de la regin que queremos mapear por PCR y su posterior secuenciacin. Finalmente, se compara la secuencia obtenida con la de un control que no ha sido sometido a la accin del bisulfito: aquellas citosinas que estuviesen metiladas aparecern como tales en el control, mientras que en la muestra tratada sern sustituidas por una timina. La secuenciacin alelo-especfica por bisulfito presenta algunas limitaciones, entre las cuales se encuentran las siguientes: -Conversin incompleta: La secuenciacin mediante bisulfito depende de la conversin de cada uno de los residuos de citosina no metilados a uracilo. Si la conversin es incompleta, los posteriores anlisis que se realicen interpretarn incorrectamente las citosinas no metiladas no convertidas en uracilo como citosinas metiladas, dando lugar a falsos positivos para la metilacin.Slo las citosinas que se encuentren en cadenas simples de ADN sern susceptibles de ser atacadas por bisulfito por lo que el paso de desnaturalizacin del ADN es crtico en este anlisis.Es importante por tanto optimizar parmetros como la temperatura y la concentracin de sales para mantener el ADN desnaturalizado y as permitir una conversin completa por bisulfito. Por otra parte tambin se ha propuesto que embebiendo el ADN en gel de agarosa se incrementa el grado de separacin debido a que se mantienen las cadenas separadas. -Degradacin del ADN durante el tratamiento con bisulfito: Es una de las limitaciones ms importantes de este mtodo y tiene lugar paralelamente a la conversin. Para que se produzca una total conversin son necesarias una serie de condiciones tales como largos tiempos de incubacin, temperatura elevada y altas concentraciones de bisulfito. Estas condiciones en su conjunto pueden promover la degradacin del ADN en una proporcin elevada. Esto puede suponer un grave problema si partimos de muestras con una baja concentracin de ADN o de muestras tomadas post-mortem, adems dicha degradacin dar lugar a pequeas roturas al azar a lo largo de la cadena de ADN lo que puede dar lugar a errores durante la amplificacin por PCR. -Desulfonacin incompleta de los residuos de pirimidina: Una inadecuada alcalinizacin de la solucin puede tener como consecuencia una incompleta desulfonacin de los residuos de pirimidina, lo cual a su vez puede afectar negativamente a las polimerasas de ADN, las cuales sern incapaces de replicar la cadena molde.Esta situacin se puede evitar monitorizando el pH de la solucin asegurando as que se produzca una desulfonacin completa.

Pirosecuenciacin[editar editar fuente]

La pirosecuenciacin es un mtodo de secuenciacin de ADN en tiempo real basado en la liberacin de los pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reaccin de polimerizacin del ADN a partir de sus dNTPs. Inicialmente, esta metodologa se empleaba para monitorizar de forma continua la actividad de la ADN-polimerasa. Frente a otras tcnicas de secuenciacin, esta variante no requiere correr en un gel los fragmentos de ADN generados en la reaccin de polimerizacin, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs (dideoxinucletidos). Este mtodo requiere de la preparacin de una molcula monocatenaria de ADN a la cual se hbrida un pequeo cebador. Igualmente, la pirosecuenciacin requiere de los 4 dNTPs, la polimerasa de ADN, as como tres enzimas: sulfurilasa (y el sustrato adenosina 5'- fosfosulfato o APS), luciferasa (y el sustrato luciferina)y apirasa. A medida que la reaccin transcurra, se ir sintetizando la cadena complementaria e iremos obteniendo una serie de picos de seal en el pirograma que nos permitirn determinar la secuencia. El proceso ocurre en ciclos sucesivos de tres pasos:

En el primero de ellos, se aade al medio de reaccin uno de los 4 dNTPs el cual, si es el complementario a la base de la hebra molde que toca copiar, ser procesado en la reaccin de polimerizacin e incorporado a la cadena en extensin por la ADNpolimerasa, liberando un PPi. Dicho PPi es posteriormente convertido a ATP al reaccionar con una molcula de adenosina 5 -fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa. Finalmente, tiene lugar la emisin de radiacin como consecuencia de la oxidacin de la luciferina a oxiluciferina catalizada por la luciferasa de lucirnaga, consumiendo el ATP generado en la reaccin anterior. Si el dNTP que ha sido aadido al medio de reaccin no es el complementario al que ocupa la posicin que toca copiar, ste es degradado por una enzima llamada apirasa antes de que se aada el siguiente dNTP. Esto ltimo permite eliminar el exceso de dNTP, ya que de no ser ste complementario y permanecer en el medio, al aadir posteriormente la base complementaria a la cadena en extensin, no sera posible discenir si la emisin de luz detectada se debe a la incorporacin de uno u otro nucletido. El nmero medio de fotones emitidos por cadena molde es proporcional al nmero de nucletidos incorporados a la cadena, siendo esta relacin lineal nicamente para un nmero bajo de incorporaciones. La radiacin emitida es captada por una cmara acoplada a un sistema de cargas, el cual representa la seal en forma de pico en el pirograma. As vemos que la informacin de la secuencia se representa en el pirograma en la que la altura de los picos refleja la cantidad de nucletidos incorporada: picos de mayor altura indicarn que se ha incorporado el mismo nucletido varias veces, esto es, que en la cadena de ADN dicho nucletido se encuentra varias veces repetido de manera seguida.

Automatizacin y preparacin de las muestras[editar editar fuente]

Vista del comienzo de un ejemplo de lectura con el terminador (fondo coloreado).

Los instrumentos modernos automticos de secuenciacin del ADN (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar ms de 384 muestras marcadas por fluoresciencia de una sola vez y llevar a cabo 24 ciclos de secuenciacin al da. No obstante, los secuenciadores automticos de ADN llevan a cabo solamente separacin del ADN basada en el tamao (por electroforesis capilar), deteccin y registro de la coloracin fluorescente, y los datos resultantes se dan como cromatogramas que registran los picos de fluorescencia. Se efectan por separado las reacciones de secuenciacin mediante una termocicladora, lavado y resuspensin en una solucin tamponada antes de pasar las muestras al secuenciador. En el pasado los operadores tenan que arreglar los extremos terminales de baja calidad (ver imagen de la derecha) de cada secuencia manualmente para eliminar los errores de secuenciacin. Sin embargo, hoy se puede realizar mediante software como "Fast Chromatogram Viewer" el arreglo automtico de los extremos terminales en grandes cantidades.13

Estrategias de secuenciacin a gran escala[editar editar fuente]

Los procedimientos actuales solo pueden secuenciar directamente fragmentos relativamente cortos (de entre 3001000 nucletidos de longitud) en una sola reaccin.14 El principal obstculo para secuenciar fragmentos de ADN de una longitud superior a este lmite es la capacidad insuficiente de separacin para resolver grandes fragmentos de ADN cuyo tamao difiere en un slo nucletido. En cambio, las limitaciones impuestas por la incorporacin de ddNTPs fueron resueltas en gran medida por Tabor, de la Hardvard Medical, Carl Fueller, de USB biochemicals, y colaboradores. 15

El ADN genmico se fragmenta en trozos al azar y se clonan en una biblioteca bacteriana. El ADN de los clones bacterianos individuales se secuencia y la secuencia se ensambla observando las regiones solapantes. (Click para ampliar)

La secuenciacin a gran escala persigue la secuenciacin de fragmentos muy grandes de ADN. Incluso los genomas bacterianos relativamente pequeos constan de miles de nucletidos y slo el Cromosoma 1 humano consta de 246 millones de bases. As pues, algunos enfoques abordan el problema cortando (con enzimas de restriccin) o cizallando (mediante fuerzas mecnicas) fragmentos grandes para obtener otros ms pequeos. El ADN fragmentado se clona en un Vector de ADN, normalmente uncromosoma artificial bacteriano (BAC) y amplificado en Escherichia coli. El ADN amplificado se puede purificar entonces a partir de las clulas bacterianas (Una desventaja de los clones bacterianos para el secuenciado es que algunas secuencias de ADN pueden ser inherentemente inclonables en todas las lneas bacterianas disponibles debido al efecto deletreo de la secuencia clonada en la bacteria hospedadora u otros efectos). Estos fragmentos cortos de ADN purificados a partir de colonias bacterianas individuales se secuencian completamente y se ensamblan computacionalmente en una secuencia larga y contigua identificando las secuencias que se solapan entre ellas (por secuenciacin por fuerza bruta o "shotgun"). Este mtodo no requiere informacin preexistente sobre la secuencia de ADN y a menudo se la conoce como secuenciacin de novo. Los intervalos entre las secuencias ensambladas se pueden rellenar mediante paseos de cebadores, a menudo mediante pasos de sub-clonado (o secuenciacin a base de transposones dependiendo del tamao del resto de regin que quede por secuenciar). Todas estas estrategias implican efectuar muchas lecturas menores del ADN por alguno de los mtodos anteriores y posteriormente ensamblarlos en secuencias contiguas. Las diferentes estrategias tienen diferentes inconvenientes en cuanto a velocidad y exactitud. El mtodo de secuenciacin por fuerza bruta es el ms prctico para secuenciar genomas grandes, pero su proceso de ensamblaje es complejo y potencialmente proclive al error -en particular en

presencia de repeticin de secuencias. Debido a esto, el ensamblaje del genoma humano no est literalmente completo las secuencias repetitivas de los centrmeros, telmeros y otras partes del cromosoma quedan como huecos en el ensamblaje del genoma. A pesar de contar con solo el 93% del genoma ensamblado, el Proyecto Genoma Humano se declar completado porque la definicin de secuencia del genoma humano se limit a la secuencia eucromtica (completa al 99% en aquel momento), para excluir esas regiones repetitivas intratables.16

Pasos para la resecuenciacin. Preparacin de la muestra:Extraccin del cido nucleico. Preparacin del molde:Amplificacin y preparacin de una pequea regin de la regin objetivo. (Click para ampliar)

El genoma humano tiene una longitud de unos 3000 millones de pares de bases; 17 si la longitud media de cada fragmento es de 500 bases, llevara un mnimo de seis millones de fragmentos secuenciar el genoma humano (sin tener en cuenta el solapamiento, es decir si fuera posible hacerlo de una sola vez). Mantener el control de un nmero tan elevado de secuencias presenta desafos significativos que solo se pueden abordar mediante el desarrollo y la coordinacin de varios algoritmos de procedimiento y computacin, tales como el desarrollo y mantenimiento eficientes de bases de datos. Se utiliza la Resecuenciacin o secuenciacin marcada para determinar un cambio en la secuencia de ADN a partir de la secuencia "de referencia". A menudo se efecta utilizando la PCR para amplificar la regin de inters (se necesita una secuencia de ADN preexistente para disear los cebadores de ADN). La resecuenciacin realiza tres pasos, la extraccin del ADN o ARN del tejido biolgico, la amplificacin del ARN o ADN (habitualmente por PCR) y despus la secuenciacin. La secuencia resultante se compara con la de referencia o con una muestra normal para detectar mutaciones.

Nuevos mtodos de secuenciacin[editar editar fuente]

Secuenciacin de alto rendimiento[editar editar fuente]
La elevada demanda de secuenciacin de bajo coste ha dado lugar a las distintas tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento.18 19 Estos esfuerzos han sido financiados por instituciones pblicas y privadas as como desarrolladas y comercializadas dentro de la empresa privada por las compaas de biotecnologa. Se pretende que las tecnologas de

secuenciacin de alto rendimiento disminuyan los costes de secuenciacin de las bibliotecas de ADN ms all de lo que se puede hacer con el mtodo corriente del terminador marcado basado en la separacin del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos mtodos de alto rendimiento usan mtodos que paralelizan el proceso de secuenciacin, produciendo miles o millones de secuencias a la vez. Amplificacin clonal in vitro Ya que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciacin de una sola molcula, la mayora de los mtodos utilizan un paso con clonacin in vitro para generar muchas copias de cada molcula individual. Uno de los mtodos es la PCR de emulsin, en la que se aislan las molculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa. Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la bliblioteca de molculas aisadas y seguidamente se inmovilizan para ser ms tarde secuenciadas. La PCR de emulsin se usa en los mtodos publicados por Margulis y colaboradores (comercializado por 454 Life Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca et al. (conocido como "secuenciacin polony ", trmino formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la secuenciacin SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por Applied Biosystems).20 21 22 Otro mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de puente", en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida, desarrollados y usados por Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina). Estos mtodos producen ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un solo fragmento. El mtodo con una nica molcula desarrollado por el laboratorio de Stephen Quake (y ms tarde comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificacin, fijando directamente las molculas de ADN a una superficie.23 Secuenciacin paralelizada Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan fsicamente en posiciones separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo. La "secuenciacin por sntesis", como en la popular secuenciacin electrofortica con terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar las bases presentes en la molcula complementaria de ADN. Los mtodos de terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores marcados con colorante, aadiendo un nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la polimerizacin de otro nucletido. La Pirosecuenciacin (utilizada por 454) tambin usa la polimerizacin del ADN para aadir nucletidos, aadiendo cada vez un tipo diferente y despus detectando y cuantificando el nmero de nucletidos aadidos a una determinada localizacin a travs de la luz emitida por la liberacin de los pirofosfatos unidos a ellos.20 24 La "secuenciacin por ligacin" es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo.25 21 22 Se usa en el mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este mtodo utiliza un reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia especfica produce una seal correspondiente a la secuencia complementaria en esa posicin concreta.

Secuenciacin de una nica molcula de ADN[editar editar fuente]

El mtodo tSMS (siglas en Ingls de True Single-Molecule Sequencing) de Helicos es uno de los ms modernos comercializados hoy da para la secuenciacin. A diferencia de sus predecesores, no lleva a cabo ningn tipo de amplificacin de la muestra, sino que es capaz de secuenciar a partir de una nica molcula monocatenaria de ADN. La muestra de ADN a analizar es troceada en fragmentos de entre 100 y 200 pares de bases. A continuacin, se aade una cola de poli-A al extremo 3' de cada uno de estos fragmentos generados, estando el ltimo de ellos marcado con una sonda fluorescente. Estas molculas servirn directamente de sustrato para el proceso de secuenciacin. El siguiente paso consiste en la hidridacin de los fragmentos sobre una micro-placa que contiene millones de poli-T pegados en su superficie. Dicha molcula de poli-T actuar adems como cebador en el proceso de secuenciacin. A continuacin, la micro-placa es introducida en un dispositivo dotado de una cmara CCD capaz de captar la fluorescencia emitida por cada uno de los fragmentos unidos a los poli-T, localizando as la posicin de cada una de las molculas en la placa. Una vez ha sacado una foto de toda la superficie, la micro-placa es tratada con una solucin que produce cuyos componentes producen la escisin del fluorforo unido a la ltima adenina. La reaccin de secuenciacin comienza mediante la adicin de una solucin con la polimerasa. A continuacin, se aade una solucin de un nico tipo de nucletido marcado con un fluorforo (por ejemplo, la adenina). Entonces, la polimerasa cataliz su incorporacin al cebador en aquellos casos donde corresponda, segn la secuencia del fragmento concreto. El siguiente paso es el lavado de la solucin para eliminar aquellos nucletidos no unidos, tras lo cual la cmara toma una nueva foto de la superficie, localizando aquellas molculas donde s se han incorporado. De nuevo, la placa se trata con una solucin que elimina el fluorforo de los nucletidos incorporados. A continuacin, el proceso se repite aadiendo una nueva solucin con la polimerasa y un nucletido diferente (por ejemplo la timina), e igualmente con la guanina y la citosina. La magnitud de la tcnica radica en que, simultneamente se estn secuenciando millones de fragmentos distintos de ADN; proceso que podemos seguir al mismo tiempo gracias a las imgenes captadas por la cmara. Un software analiza dichas imgenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales deben ser ensambladas posteriormente por programas informticos.

Otras tecnologas de secuenciacin[editar editar fuente]

Otros mtodos de secuenciacin por ADN podan tener ventajas en trminos de eficiencia o exactitud. Al igual que la secuenciacin por terminador marcado por tincin, estn limitadas a la secuenciacin de fragmentos nicos aislados. La "secuenciacin por hibridacin" es un mtodo no enzimtico que usa un chip de ADN. En este mtodo, un nico reservorio de ADN se marca mediante fluorescencia y se hbrida con un coleccin de secuencias conocidas. Si el ADN desconocido se hbrida fuertemente en un punto dado de entre las secuencias, hacindole que "luzca", entonces se infiere que esa secuencia existe dentro de los ADN desconocidos que son secuenciados.26 La Espectrometra de masas tambin se puede usar para secuenciar las molculas de ADN; las reacciones convencionales de terminacin de la cadena producen molculas de ADN de diferentes longitudes y la longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de utilizar una separacin por gel).27 Hay nuevas propuestas para la secuenciacin de ADN que estn en desarrollo, pero an no han sido probadas. Entre estas estn el marcaje de la ADN polimerasa,28 o la lectura de la secuencia a medida que la cadena de ADN pasa por nanoporos. (secuenciacin de nanoporos),29

La secuenciacin en el sistema nanoporo se puede resumir en los siguientes pasos:

El ADN a secuenciar se rompe en fragmentos de 100 kb aproximadamente Se desnaturalizan para obtener fragmentos monocatenarios y se hibridan con sondas que se unen a distintas partes del fragmento de ADN

Los fragmentos de ADN con las sondas unidas se hacen pasar por el nanoporo, creando una curva de corriente frente a tiempo. Los picos que se forman determinan la posicin de la sonda en cada fragmento de genmico

De acuerdo con una serie de reglas del apareamiento de bases, se puede determinar la secuencia de ciertas porciones del fragmento de ADN genmico. Esto se hace para cada sonda y de manera paralela para todos los fragmentos de la librera de ADN

El resultado es una especie de mapa que nos detalla las posiciones de las sondas para cada fragmento de la librera Por tcnicas de anlisis de los datos con un software se llega a conocer la secuencia de ADN

Otras tcnicas de secuenciacin estn basadas en microscopas, como la microscopa de fuerza atmica o el microscopio electrnicoque se usan para identificar las posiciones de los nucletidos individuales dentro de largos fragmentos de ADN marcando los nucletidos con elementos pesados (p.ej. halgenos) para la deteccin visual y su registro.30 En octubre de 2006 el NIH public un boletn de noticias describiendo las nuevas tcnicas de secuenciacin y anunciando varias concesiones de becas.31 En octubre de 2006, la Fundacin Premio X estableco el Premio Arconte X (Archon X Prize), que premia con 10 millones de dlares al "primer equipo que pueda construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100 genomas humanos en 10 das o menos, con una exactud no menor a un error por cada 100.000 bases secuenciadas, con secuencias que cubran correctamente al menos el 98% del genoma, y a un coste no mayor de 1.000 $ por genoma."32

Principales hitos en la secuenciacin del ADN[editar editar fuente]

1953 Descubrimiento de la estructura de la doble hlice de ADN. 1972 Desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, que permite el aislamiento de fragmentos definidos de ADN; antes de este descubrimiento las nicas muestras accesibles para la secuenciacin eran de bacterifacos o virus de ADN.

1975 El primer genoma de ADN completamente secuenciado fue el del bacterifago X174 1977 Allan Maxam y Walter Gilbert publicaron el artculo "Secuenciacin del ADN mediante degradacin qumicas. 33 Fred Sanger, independientemente, publica "Secuenciacin del ADN mediante sntesis enzimtica".

1980 Fred Sanger y Wally Gilbert reciben el Premio Nobel de qumica 1982 GenBank comienza su andadura como repositorio pblico de secuencias de ADN.

Andre Marion y Sam Eletr de Hewlett Packard crean Applied Biosystems en Mayo, que acaba siendo hegemnica en la secuenciacin automatizada.

Akiyoshi Wada propone la secuenciacin automatizada y recibe apoyo para la construccin de rebots con la ayuda de Hitachi.

1984 Los cientficos del Medical Research Council descifran la secuencia completa de ADN del virus de Epstein-Barr, de una longitud de 170 Kbases.

1985 Kary Mullis y colaboradores desarrollan la reaccin en cadena de la polimerasa, una tcnica para replicar pequeos fragmentos de ADN.

1986 El laboratorio de Leroy E. Hood en el Instituto de Tecnologa de California y Smith anuncian la primera mquina semiautomtica de secuenciacin de ADN.

1987 Applied Biosystems comercializa la primera mquina de secuenciacin automatizada, el modelo ABI 370.

Walter Gilbert abandona el panel sobre el genoma del Consejo Nacional de Investigacin de los Estados Unidos para crearGenome Corp., cuyo objetivo es la secuenciacin y comercializacin de los datos.

1990 El Instituto Nacional de salud de los Estados Unidos comienza ensayos a gran escala de secuenciacin de Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and Saccharomyces cerevisiae (a 75 centavos (US)/base).

Lipman y Myers publican el algoritmo BLAST para la alineamiento de secuencias. Barry Karger (Enero34 ), Lloyd Smith (Agosto35 ), y Norman Dovichi (Septiembre36 ) hacen una publicacin sobre laelectroforesis capilar.

1991 Craig Venter desarrolla la estrategia para encontrar genes que se expresan con ESTs (Expressed sequence tags).

Uberbacher desarrolla GRAIL, un programa de prediccin de genes.

1992 Craig Venter abandona el NIH para abrir el "The Institute for Genomic Research" (Instituto para la investigacin genmica, ElTIGR).

El Trust Wellcome comienza su participacin en el Proyecto Genoma Humano. Simon y al. desarrollan los BACs (cromosoma artificial bacteriano) para el clonado. Mapa fsico del primer cromosoma publicado:

Page y otros. - Cromosoma Y;37 Cohen y otros. cromosoma 21.38 Lander - mapa gentico completo del ratn;39 Weissenbach - mapa gentico humano completo.40

1993 El trust Wellcome y MRC crean el Centro Sanger, cerca de Cambridge, Reino Unido.

La base de datos GenBank se traslada de Los lamos (DOE) al NCBI (NIH).

1995 Venter, Fraser y Smith publican la primera secuencia de un organismo de vida libre, Haemophilus influenzae (tamao del genoma: 1.8 Mbase).

Richard Mathies y colaboradores escriben un artculo sobre los marcajes colorantes en la secuenciacin (PNAS, Mayo).41

Michael Reeve y Carl Fuller, polimerasa termoestable para la secuenciacin.15

1996 Los socios internacionales del Proyecto Genoma Humano acuerdan publicar los datos de secuenciacin en bases de datos pblicas en 24 horas.

Un consorcio internacional publica la secuencia del genoma de la levadura S. cerevisiae (tamao del genoma 12.1 Mbases).

Yoshihide Hayashizaki en el RIKEN completa el primer juego de cDNAs de longitud completa de ratn. ABI presenta un sistema de electroforesis capiar, el analizador de secuencias ABI310.

1997 Blattner, Plunkett y colaboradores. publican la secuencia de E. coli (Tamao genmico 5 Mb)42 1998 Phil Green y Brent Ewing de la Universidad de Washington publican phred para interpretar los datos de secuenciacin(en uso desde 1995).43

Venter funda una nueva compaa, Celera; Secuenciar el genoma humano en 3 aos con un coste de $300m. Applied Biosystems presenta la mquina de secuenciacin capilar 3700. Wellcome dobla su financiacin al Proyecto Genoma humano hasta $330 million para llegar a 1/3 de la secuencia. Objetivos del NIH y el DOE: Obtener un "borrador de trabajo" del genoma humano para 2001. Sulston, Waterston y otros finalizan la secuencia de C. elegans (tamao del genoma de 97Mb).44

1999 El NIH cambia la fecha de finalizacin del borrador a la primavera de 2000.

NIH lanza el proyecto de secuenciacin del genoma del ratn. Primera secuencia del cromosoma humano 22 publicada.45

2000 Celera y colaboradores secuencian la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Tamao del genoma 180Mb) - lo que supone la validacin del mtodo de Venter de secuenciacin por fuerza bruta. El consorcio Proyecto Genoma Humano y Celera debaten sobre aspectos relacionados a la publicacin de datos.

El consorcio Proyecto Genoma Humano publica la secuencia del cromosoma 21.46 HGP y Celera anuncian conjuntamente los borradores de trabajo de la secuencia del genoma humano y prometen una publicacin conjunta.

Las estimaciones del nmero de genes del genoma humano se sitan entre 35.000 y 120.000. El consorcio internacional completa la primera secuencia de una planta, Arabidopsis thaliana (Tamao del genoma 125 Mb).

2001 El Proyecto Genoma Humano publica el borrador de la secuencia del genoma humano en Nature el 15 de febrero.47

Celera publica la secuencia del genoma humano.48

2005 420,000 secuencias VariantSEQr de cebadores de resecuenciacin humanas publicadas en la nueva base de datos NCBI Probe.

2007 Por primera vez se secuencia un grupo de especies estrechamente relacionadas. Se secuencian 12 Drosoflidos (mosca de la fruta), haciendo despegar la era de la filogenmica.

Craig Venter publica su genoma diploide completo: el primer genoma humano en ser completamente secuenciado. 49

EXOTOXINAS. Son sustancias liberadas al medio que rodea al patgenoENDOTOXINAS. Forman parte del propio microoganismo.NaturalezaProteicaNo proteica (Lipopolisacridos)EfectosAtacan a los tejidos especficos: Neurotoxinas, a las clulas nerviosas. Toxina botulnica. Enterotoxinas, a las clulas digestivas. Toxina colrica.Provocan efectos generales: diarreas, shock y hemorragias internas.Tolerancia al calorSe desnaturalizanSon termoestablesRespuesta inmuneProvocan la formacin de anticuerposNo provocan la formacin de anticuerposToxicidadMuy txicasMenos txicasToxinas. Son sustancias producidas por los microorganismos que producen efectos Epidemiologa y Modos de transmisin de las enfermedades infecciosas. 1.Enfermedades transmitidas por contagio directo a travs de heridas en la piel. Conocemos los problemas que encuentran los microorganismos para atravesar la piel, siempre aprovechan las heridas. Los microorganismos que invaden las heridas pueden proceder de la piel, la ropa, el suelo, objetos... es importante desinfectar inmediatamente las heridas. El pie de atleta afecta a los pies y es producido por un hongo "Trichophyton" 2.Enfermedades transmitidas a travs del aire. Se transmiten en el interior de microgotas de humedad o de polvo (proceden de personas enfermas, tos estornudo...) Generalmente infectan las vas respiratorias. La tuberculosis es producida por la bacteria "Mycobacterium tuberculosis" y afecta a los pulmones. La gripe es producida por un retrovirus y afecta a la mucosa respiratoria. . 3.Enfermedades transmitidas por va sexual Enfermedades venreas, se transmiten por contacto sexual, utilizacin de jeringuillas contaminadas o durante el parto. La mayora responden bien a la quimioterapia excepto el SIDA que al ser producido por un retrovirus debe combatirse con mtodos preventivos en las relaciones sexuales. Actualmente se utilizan con xito los retrovirales. Otra enfermedad de transmisin sexual es la gonorrea producida por una bacteria."Neisseria gonorrhoeae". 4.Enfermedades transmitidas por el agua y los alimentos. Se deben a una mala conservacin o almacenamiento de los alimentos y a las aguas contaminadas por restos fecales. Puede provocarlas la ingestin del microorganismo o de la toxina producida por aqul. Afectan al tracto digestivo y a veces se instalan en otros tejidos. La salmonelosis es producida por la bacteria "Salmonella tiphi", el clera por otra bacteria "Vibrio cholerae". La amebiasis producida por el protozoo "Entomoeba histolytica". Generalmente producen diarreas y deshidratacin. 5.Enfermedades transmitidas por los animales. Los animales utilizados como vectores por los microorganismos patgenos pertenecen al grupo de los Artrpodos: garrapatas, piojos, pulgas y mosquitos. A veces son slo vectores mecnicos, transportan al microbio. En otros casos actan como vector biolgico donde el microbio completa su ciclo reproductivo. La malaria o paludismo producido por el protozoo Plasmodium que es transmitido por un mosquito Anopheles.

Crecimiento microbiano: Curva de crecimiento. En un medio favorable, un microorganismo aumenta su tamao y, cuando ste se duplica, la clula se divide. El perodo que necesitan las clulas de una poblacin de microorganismos para crecer, dividirse y originar dos clulas nuevas por cada una de las que existan anteriormente se denomina tiempo de generacin o tiempo de duplicacin. El incremento del nmero de clulas de una poblacin de microorganismos se llama crecimiento microbiano, y como el nmero de clulas se dobla cada cierto tiempo, se dice que el crecimiento es exponencial. En los laboratorios los microorganismos se cultivan en sistemas cerrados, lo que significa que no se suministran mas nutrientes ni se eliminan los productos txicos, por lo que el crecimiento pasa por cuatro etapas distintas y secuenciales: Fase de latencia Es el perodo comprendido entre la inoculacin del microorganismo en el medio de cultivo y el comienzo del crecimiento. Puede ser corto o dilatado, segn las condiciones. Fase exponencial Se caracteriza porque el tiempo de generacin se mantiene constante. Esta variable es tpica de cada especie, aunque est influida por las caractersticas del medio de cultivo. Fase estacionaria En un cultivo cerrado, la poblacin no puede crecer indefinidamente de manera exponencial, pues se consumen los nutrientes o se acumulan productos txicos resultantes del metabolismo. El intervalo en el que cesa el crecimiento de una poblacin es la fase estacionaria.Fase de muerte Despus de que una poblacin ha llegado a la fase estacionaria, las clulas pueden seguir vivas, pero a menudo dejan de metabolizar y mueren. Cuando esto sucede, se dice que la poblacin est en fase de muerte. BIOTECNOLOGIA La biotecnologa es el conjunto de actividades que tienen en comn el aprovechamiento de las clulas de todos los organismos para producir sustancias tiles a la humanidad. Aunque el trmino es moderno, rene tcnicas y mtodos conocidos desde la antigedad. A continuacin enumeraremos el campo de accin de esta ciencia multidisciplinar (ya que se apoya en la microbiologa, la biologa molecular, bioqumica, gentica, inmunologa, qumica, ingeniera industrial e informtica )contemplando tanto sus aspectos ms tradicionales como los progresos de la investigacin en este campo. 1.los microorganismos y la biotecnologa industria del vino industria de la cerveza industria del pan industria del aceite industria de la leche y derivados. 2.produccin de alimentos microorganismos como alimentos biotecnologa y agricultura biotecnologa y ganadera 3.la biotecnologa y la medicina produccin de hormonas

Produccin de antibiticos Produccin de vacunas Obtencin de anticuerpos monoclonales e interferones Terapia gnica Prevencin de enfermedades hereditarias 4. la biotecnologa en la proteccin del medio ambiente eliminacin de metales pesados eliminacin de mareas negras obtencin de energa no contaminante tratamiento de residuos urbanos e industriales depuracin de aguas residuales tratamiento de la contaminacin producida por herbicidas, pesticidas e insecticidas. 1.Los microorganismos y la biotecnologa *Las levaduras( Saccharonyces cerevisiae) que se encuentran bajo la piel de las uvas son las que realizan espontneamente la fermentacin del mosto, aunque suelen aadirse cultivos seleccionados para acelerar el proceso. *La cerveza se elabora a partir de cereales que contienen en sus granos almidn que no fermenta -directamente. Por lo tanto es necesario que el polisacrido se hidrolize a glucosa para que puedan actuar las levaduras. El cereal ms empleado es la cebada aunque puede emplearse el maz y el arroz, sus semillas al germinar producen amilasas que son las enzimas que convierten el almidn en glucosa. Para ello se maltea el grano (se humedece y se le deja germinar) y posteriormente se muele. El extracto acuoso se separa del triturado, se le aade el lpulo( planta que da el sabor amargo , aromatiza e impide el crecimiento bacteriano ) y se cuece. Luego se le aadir la levadura para que se produzca la fermentacin. *En la fabricacin del pan necesitamos harina de cereales, agua y levadura ( Saccharonyces cerevisiae) , las enzimas de la harina convierten parte del almidn en glucosa que fermenta rpidamente produciendo CO2 que queda atrapado en la masa provocando el aumento de volumen. Tambin se forma alcohol que se destruye cuando se cuece el pan para inactivar la levadura y eliminar el agua, el resultado es la textura esponjosa caracterstica. *La fabricacin del aceite consiste en la obtencin del zumo de la aceituna por medios fsicos de molienda, centrifugacin y decantacin. Las aceitunas no deben permanecer almacenadas durante horas para evitar su fermentacin. *En la industria de la leche y sus derivados como son mantequilla, crema cida, cuajada, yogur o queso, se necesitan microorganismos como son las eubacterias de los gneros: Streptococcus, Leuconostoc y Lactobacillus ( son anaerobios facultativos). La obtencin del queso comprende dos fases: la formacin de la cuajada ( leche + bacterias + renina( enzima que coagula las protenas )= fase lquida o suero + cuajada) y la maduracin de la cuajada que se lleva a cabo por la accin de las bacterias y los mohos dependiendo del tipo de queso que se pretenda fabricar.

2.Produccin de alimentos *Son muchos los ejemplos de microorganismos empleados como alimentos: a) Protenas de una sola clula PSX, se extraen de las cianobacterias, levaduras, microalgas y hongos, se utilizan en la alimentacin humana y animal. b) Espirulinas ricas en aa esenciales y ac. Grasos poliinsaturados, se utiliza como suplemento diettico. c) La levadura seca de la industria cervecera se usa como alimento para los animales de granja y como suplemento diettico en la alimentacin humana. d)Las microalgas por su alto valor nutritivo se estn utilizando en la alimentacin humana y animal. e)Del moho se extrae una protena Quom que es un alimento para el consumo humano. * En la agricultura las nuevas tcnicas de ingeniera gentica han abierto amplias expectativas , tanto en la potenciacin de caractersticas deseables, rendimiento de cultivos, resistencia a herbicidas o a plagas como en la creacin de variedades y especies nuevas de mayor riqueza nutricional. * En la ganadera tambin las tcnicas de ingeniera gentica han mejorado la produccin animal principalmente se han aplicado a la acuicultura, ello se debe a que en la mayora de lo peces la fecundacin es externa, lo cual permite la introduccin de genes en el cigoto. A partir de estas tcnicas se han obtenido carpas transgnicas (que crecen entre un 20% y un 46% ms rpidamente) y salmones transgnicos (que resisten mejor las bajas temperaturas).

3. La biotecnologa y la medicina Gran cantidad de productos farmacuticos, entre los que destacan antibiticos,vitaminas y esteroides son producidos por microorganismos, as el hongo Penicillium notatum produce penicilina, determinadas levaduras y bacterias producen vitamina B12 y B2 . La ingeniera gentica tambin se utiliza para incorporar genes humanos en determinados animales, as por ejemplo en la leche de las ovejas transgnicas se obtienen la antiripsina utilizada en los enfermos de enfisema para facilitar la respiracin. Tambin la insulina humana se obtiene mediante la introduccin del gen de la insulina en la bacteria Escherichia coli. Determinados frmacos han sido obtenidos por ingeniera gentica: la insulina y la hormona del crecimiento humano. La modificacin de bacterias ha hecho posible que fabriquen insulina con la misma composicin que la humana, mediante la introduccin del gen correspondiente de las personas (1982). La ingeniera gentica tambin ha permitido conseguir vacunas sin tener que utilizar virus vivos. 4. La biotecnologa en la proteccin del medio ambiente A la aplicacin de los microorganismos para paliar o aminorar las agresiones al entorno se le denominabiorremediacin. En la actualidad se estn empleando microorganismos para el tratamiento y utilizacin de residuos de origen biolgico o bin procedentes de procesos agrcolas por medio de sistemas de depuracin natural o biolgicos que utilizan bacterias y algas. En lagunas anaerobias se tratan los residuos orgnicos procedentes de granjas animales. Estos sistemas mixtos de bacterias y algas se basan en la capacidad de ciertas algas para desarrollarse comensalmente en un medio con bacterias capaces, a su vez, de oxidar los residuos. El resultado es la liberacin de O2 y

substratos de materia orgnica rica en protenas, que puede ser utilizada como piensos para peces y animales de granja.Tambin se utilizan microorganismos para eliminar iones metlicos, retirar metales pesados, biodegradar hidrocarburos, aceites y disolventes apolares, eliminar de los combustibles fsiles el azufre orgnico, mineralizar herbicidas, pesticidas e insecticidas... Entre los microorganismos ms interesantes para este tipo de actividades biodegradativas y destoxificadoras destacan las bacterias aerobias del gnero Pseudomonasy las de los gneros Alcaligenes, Rhizobium, Rhodobacter, Arthrobactery Acinetobacter. La tecnologa del ADN recombinante abre la posibilidad de reunir en un nico microorganismo las capacidades de nteres medioambiental que aparecen en otros por separado, o desarrollar nuevas capacidades. INGENIERA GENTICA Es una tcnica que consiste en la introduccin de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a travs de los llamados enzimas de restriccin que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos y de esta forma separar los fragmentos que interese. Se llama ADN recombinante aqul que resulta de intercalar en un ADN receptor un fragmento de ADN extrao. En la actualidad se puede aislar un gen determinado ADN pasajero, y, mediante el vector adecuado, introducirlo en las bacterias. Cuando estas se reproducen aumentan mucho el nmero de copias de dicho gen. A este proceso de amplificacin se le denomina clonacin. El vector utilizado puede ser un plsmido bacteriano un virus. LA CLONACIN Es el uso de mtodos asexuales para producir copias idnticas de un individuo. Para ello se utilizan clulas pluripotentes que son extradas del individuo y cultivadas "in vitro" para formar un individuo idntico al inicial. Este mtodo se ha utilizado tradicionalmente en los vegetales en la reproduccin por esquejes. En anfibios y ratones (mamferos) se realiza mediante la introduccin de una clula somtica del individuo original en un vulo al que previamente se le ha extirpado el ncleo haploide. PLMISDOS Y VIRUS Es un pequeo ADN circular de doble hlice del que puede haber varios ejemplares en una bacteria. Estos plsmidos se duplican autnomamente y se produce la lisis de la bacteria, quedan libres en el medio y pueden entrar en otras bacterias, proceso que se denomina transformacin. (Se utiliza NaCl que hace ms permeables al ADN las membranas bacterianas) De esta forma las bacterias adquieren los caracteres del plsmido. Para conocer cuales bacterias han sido transformadas, se aade al gen pasajero genes que codifican protenas degradadoras de ciertos antibiticos, de forma que cuando se aade el antibitico slo sobreviven las bacterias que han incorporado el ADN del plsmido. Los plsmidos de bacterias no se integran en el cromosoma bacteriano. Sin embargo plsmidos de levaduras si lo hacen y esto permiten que sean utilizados como vectores de grandes genes de mamferos. Existe un plsmido denominado Ti que posee una bacteria que parasita vegetales y que ha sido utilizado como vector de genes que previamente han sido intercalados en Ti. Los virus tambin son utilizados como vectores ya que cuando un virus parasita una bacteria inicia el ciclo ltico y es posible que arrastre algn fragmento de ADNbacteriano que incorpora la cpside de un virus y cuando este alcanza la segunda bacteria le incorpora el fragmento de ADN de la primera

: transduccin. TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE El ADN recombinante es un fragmento de ADN construido de forma artificial con segmentos no homlogos que pueden proceder de otros organismos. Las encargadas de cortar por lugares especficos el ADN son los enzimas de restriccin, estas son endonucleasas que fragmentan el ADN siempre en secuencias conocidas palndromos (capicas). Cortan las dos hebras pero dejan colas de una sla hebra que servirn para la unin. El fragmento cortado puede contener un gen interesante que vamos a incorporar al ADN de otro organismo. Para ello es necesario un vector ( plsmido virus). Para construir un ADN recombinante se somete el ADN del vector y el ADN del plsmido a la accin de un enzima de restriccin; los extremos lugares de corte son cohesivos pegajosos ya que se unen fcilmente al ser sus secuencias complementarias. Se forma un plsmido quimera. El plsmido puede duplicarse en la bacteria y se produce la clonacin del fragmento. Si el fragmento cortado contiene un gen interesante, este se expresa en la bacteria y se obtiene el producto deseado. Como la bacteria se multiplica a gran velocidad, la cantidad de producto pronto ser suficiente. Existen mtodos para amplificar una determinada secuencia fragmento de ADN, se utiliza un cebador y una ADN polimerasa resistente a las altas temperaturas (PCR). Cualquier resto de ADN puede ser as amplificado para ser analizado. Dado que en los procariontes no hay proceso de maduracin de ARNm, si se desea intercalar un gen eucaritico en una bacteria, no se puede introducir un segmento con intrones y exones. Se utiliza la transcripcin inversa para producir ADN a partir de ARNm (maduro, sin intrones). Posteriormente el ADN debe duplicarse por complementariedad y entonces ser introducido en un vector (plsmido virus) para que lo introduzca en una bacteria. Los genes introducidos ADN pasajero puede proceder de: ADN de una clula que ha sido fragmentado por los enzimas de restriccin. -ARNm que se utiliza como molde para fabricar mediante la retrotranscripcin y otros enzimas una cadena de doble hlice de ADN. -ADN sintetizado artificialmente.

Micropropagacin

micropropagacin de cultivares de Rosa mediante tcnicas de cultivo in vitro.

Micropropagacin es el conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rpida, eficiente y en grandes cantidades.1 La micropropagacin se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniera gentica, mutagnesis o mejoramiento gentico. Se utiliza tambin la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

ndice
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1 Generalidades sobre los mtodos 2 Fases del proceso de micropropagacin

o o o o o o

2.1 Preparacin de la planta madre 2.2 Desinfeccin del material vegetal 2.3 Introduccin del material in vitro 2.4 Multiplicacin de los brotes 2.5 Eleccin de un medio de enraizamiento de los explantos 2.6 Aclimatacin de los explantos enraizados

3 Referencias 4 Enlaces externos

Generalidades sobre los mtodos[editar editar fuente]

En la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada (llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genticamente idnticas, denominadas clones. El explanto ms usado para los procesos de propagacin in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanteras con luz artificial dentro de la cmara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23 C, adems de controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas y reguladores de crecimiento, azcar, agua y agar. La composicin del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagacin.

Fases del proceso de micropropagacin[editar editar fuente]

Dentro del proceso de micropropagacin se pueden diferenciar varias fases o etapas:

1: Desinfeccin de las yemas de la planta y/o desinfeccin de semillas 2: Introduccin del material seleccionado in vitro 3: Multiplicacin de brotes 4: Enraizamiento 5: Aclimatacin

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicacin de plantas in vitro y puede ser aplicada a diferentes especies vegetales.

Preparacin de la planta madre[editar editar fuente]

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un perodo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias ptimas y con un control de la nutricin y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.2

Desinfeccin del material vegetal[editar editar fuente]

Una vez elegida la planta madre, se extraern los fragmentos a partir de los cuales se obtendrn los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de races o semillas. Antes de extraer los explantos se har una desinfeccin de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes ms comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener tales condiciones, se trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirn en un tubo de cultivo conteniendo medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfeccin del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluida durante un perodo de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

Introduccin del material in vitro[editar editar fuente]

Luego de la desinfeccin superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estril. En un perodo de una semana o quince das, comienza el proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Multiplicacin de los brotes[editar editar fuente]

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollar luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cmara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el nmero de plantas en cada repique o divisin de las plantas. El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El nmero de plantas que se obtiene por la va de la micropropagacin permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

Eleccin de un medio de enraizamiento de los explantos[editar editar fuente]

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamao aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicacin se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus races en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicacin y enraizamiento transcurren en forma simultnea.

Aclimatacin de los explantos enraizados[editar editar fuente]

Los explantos recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatacin. En esta etapa las plantas sufrirn cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, estn poco adaptados a crecer en un invernculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiracin y prdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecacin del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una cutcula con cera bien desarrollada, que representa la barrera fsica para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarn en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plstico, para mantener la humedad relativa elevada. La eleccin de un sustrato con buenas caractersticas fsicas, es clave para el xito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de races muy rpido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las races para evitar daarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los das se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente hmedo a nivel del sustrato. A los 15 das del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la maana o en la ltima hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por da destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan

cambios en algunos aspectos anatmicos y fisiolgicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatacin, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrs y tener mayor tasa de sobrevivencia.