Guia Cultivo de Tej Veg II 2012

Guia de Cul tivo de Tejid os Vegetales
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------------------------------------------------------------------------------------------------------------------INDICE GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------PRCTICA Indice General .. Programa y Planificacin .. Abre viaturas......................................... .................................. ................. Prctica N 1. Preparacin de Medios de Cultivo. Condiciones de asepsia Prctica N 2 Induccin de Embriognesis Somtica................................ Prctica N 3 Organognesis............................................ ...................... Prctica N 4 Cultivo de Yemas y Microesquejes......................... .......... Prctica N 5 Cultivo de Embriones Cigticos...................................... . Prctica N 6 Extraccin de Protenas.................................... .... Prctica N 7 Ext raccin de ADN Anexo 1. Anexo 2. Anexo 3 Formulaciones de Medi os de Cultivo.............................. Trminos utilizados en Cultivo de Tejidos Ve getales...... Traduccin de Trminos............................ .................... P GINA 1 2 7 8 14 16 18 20 22 31 38 42 51 .52 53 55 58 60
Guia de Informes . Gua de informe para la prctica N2 .......................... ......................... Gua de informe para la prctica N3................ .................................. . Gua de informe para la prctica N6................ .................................. .. Gua de informe para la prctica N7................ .................................. .
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
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PRO GRAMA DE TE O RIA Cultivos de Tejidos Vegetales. Tema 1. Introduccin al cultivo in vitro de tejidos vegetales. a. Term inologa. b. Historia. c. Conceptos de Determinacin, Competencia, Totipotencia, Regeneracin, Morfo gnesis, Or ganognesis, y Embriognesis. d. Tipos de cultivos. e. Fases del cultivo. f. Aplicaciones. Tema 2: Factores que influyen en el crecim iento y desarrollo de los cultivos vegetales in vitro. 2.1. Factores extrnsecos a. Composicin qumica de los medios de cultivo. Com ponentes inorgnicos: m acronutrientes, micron utrientes. Com ponentes orgnico s: f uentes de car bono, vitam inas, m ezclas de sustancias no definidas y otros com ponentes. b. Composicin qumica de los medios de cultivo. Horm onas: auxinas, citoquininas, giberelinas, cido abscsico, etileno. Estructura y bio sntesis, naturales y sintticas. Ef ectos fisiol gicos en cultivo in vitro. c. Condiciones fsicas del cultivo y de los medios : m edios de soporte, pH, temperatura, hum edad r elativa y luz. 2.2. . Factores intrnsecos : genotipo, edad de la planta, edad del rgano o tejido, estado fisio l gico, estado fitosanitario, tamao del explante. Tema 3: Procesos de rediferenciacin. 3.1. a. Procesos de dedifer enciacin y r edifer enciacin in vitro. El ciclo celular y la rediferen ciacin. Callo: concepto, tipos, in duccin. b. Or ganognesis directa e indirecta. c. Micropropagacin: concepto, ventajas y desventajas. Fases y aplicaciones. 3.2. Embrio gnesis somtica: con cepto, im portancia in duccin de em brio gn esis som atica in vitro , cambio s estruct urales, factores que afectan la em br io gnesis som tica in vitro. Expresin gnica. Tema 4: Relacin entre Cultivos de tejidos vegetales y Fitopatologa. Contaminacin de los cultivos in vitro. Pro duccin de plantas libre de patgenos. Produccin de plantas resistentes a p atgenos. Tema 5: Suspensiones celulares. Cultivo de clulas en suspensin. Cultivo de clulas fotoautotrficas. Medio condicion ado y Medio nodriza. Aplicaciones: pro duccin de m etabolitos secundario s. Tema 6: Protoplastos. Aislamiento y p urif icacin. Cultivo y regen eracin. Ap licaciones: obtencin de hbr idos somticos y cbrido s, estudio s bioqum icos y f isiolgicos.
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Tema 7: Variabilidad de las plantas regeneradas in vitro. a. Var iacin som aclonal, : concepto. orgen factores que la afectan. b. Hip erhidricidad Tema 8: Polaridad. Concepto, polaridad a nivel celular. formacin de la p ared celular. Factores externos e internos que inf luencian la polar idad. Relacin entre polar idad y diferenciacin. ( 3 horas) Tema 9 : Ingeniera gentica de plantas. a. Con ceptos bsicos y m todo s de Biologa m olecular. b. Mtodo s de transform acin en p lantas. c. Marcadores m oleculares d. Aplicaciones de la In geniera Gen tica en el fitomejoramiento. Tema 10: Marco legal de la Biotecnologa. Biotica y Bioseguridad. Patentes , Derechos de Obtentor y Secretos Em presariales. Bio segur idad. (3 horas) ______________________________________________________________________
EVALUACIO N
TEO RA (65 %)
PRC TIC A (35 %)
Cada parcial= 17% Seminario terico= 14%
Inform es= 15% Proyecto= 20%
O BSERVAC I N: Los temas y fech as de los sem inarios tericos sern fijados el segun do da de clases.
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ABREVIATURAS.
(entre parntesis se indica la abreviatura utilizada generalmente en ingls)
AIA (I AA) ABA ANA (NAA)
Acido Indol Actico Acido Abscsico Acido Naftalenactico 6-Bencilaminopurina Acido 2,4-diclorofenoxiactico Acido giberlico Acido Indolbutrico Cinetina Sales minerales segn formulacin de Murashige y Skoog
BA BAP 2,4-D GA3 IBA K MS
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PRCTICA N1 Preparacin de medios de cultivo. Condiciones de asepsia.

INTRO DUCCIO N
Las plantas que crecen en la naturaleza tienen tres fuentes esenciales para su nutricin. Los nutrientes minerales los o btienen, junto con el agua, desde el suelo a travs del sistem a radical. El dixido de carbono atm osfrico es utilizado en el proceso de la fotosntesis para proveer carbono como fuente bsica de ener ga; por ltim o, el cuerpo de la planta, utiliza los carbohidratos y nutrientes para sintetizar las vitam inas y sustancias de crecim iento esenciales para su crecim iento y desarrollo normal. Los requerim ientos para que un tejido vegetal crezca in vitro, en general, son similares a aquellos de las plantas intactas creciendo en la naturaleza. S in em bar go, en la m ayora de los casos s lo se cultivan tejidos aislado s o una parte pequea de los rganos de la planta; estos tejido s u r ganos aislado s carecen de la capacidad para sintetizar sus propios carbohidratos, la m ayora de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento vegetales. Por lo tanto, todas las sustancias que necesitara una planta intacta en la naturaleza deben ser sum inistradas artificialmente a los tejidos cultivados. El establecim iento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalm ente esta determinado por la naturaleza del explante, por la com posicin del m edio nutritivo, y varios factores am bientales (luz, tem peratura, etc.).
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SUSTANCIAS Q UE SE AADEN USUALMEN TE AL MEDIO NUTRITIVO PARA INDUCIR C RECIMIENTO Y DESARRO LLO Requerimientos nutricionales y hormonales de los tejidos vegetales y cultivos de rganos AGUA SUSTANCIAS ORGANI CAS azcares am inocidos vitaminas auxinas citoquininas giberelinas cido abscsico etileno MEZCLA INDEFINI DA DE SUSTANCIAS MACRO elementos MICRO
N P Ca Mg S K
Fe Zn B Mn Cu I
Co Ni Al Mo
pH
Extracto de Levadura Agua de coco Extractos vegetales Hidrolizado de Casena Peptona y Triptona
PRO CEDIM IENT O PARA LA PREPARAC IO N DE LO S MEDIO S DE CULTIVO . 12Aada una porcin de agua destilada a un m atraz aforado Las sales (m acro y micronutrientes estn preparadas en form a concentrada y se almacenan en la nevera (4oC). En el ANEXO N 1 hay una tabla en la cual se in dica que volum en es necesario aadir para preparar un litro de m edio segn la form ulacin de Murashige y Skoog (1962). Aada las soluciones de sales en el orden y volum en indicado s, haciendo los clculos de acuer do al volum en de m edio que se va a preparar. 34Agregue las vitaminas: la Tiamina esta preparada en una solucin 0.08 g/l. Pesar el mio-Inositol, disolverlo en una pequea cantidad de agua destilada y aadirlo al m edio. 5Pese la sacarosa, disulvala en agua destilada y adala al medio.
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6-
Las horm onas estn preparadas en solucin a 1 m g/m l y se almacenan en nevera (4 C) por lapsos cortos de tiempo. Las horm onas utilizadas dependen del o bjetivo del experimento, en cada prctica indica la com posicin hormonal de los medios necesarios. Al final de esta prctica hay una tabla resumen de los m edio s que se prepararn para las prcticas Nros. 1, 2, 3 y 4. Calcule el volum en de solucin horm onal que debe aadirse a cada medio y agrguelo al medio correspondiente.
o
7-
Una vez que el m edio contenga todos sus componentes, enrase con agua destilada hasta el volum en deseado.
89-
Ajuste el pH a 5,8 con NaOH HCl. Pese el agar o gelrite para tener una concentracin final de 8 g/l o 2 g/l respectivamente y adalo al medio.
10 -
Caliente el m edio en el horno m icroondas hasta que el agar est disuelto; y luego reparta el m edio en envases adecuado s previamente rotulados: tipo de m edio, equipo, fecha.
BIBLIOGRAFIA. Ozias-Akins, P. y I.K. Vasil. 1985. Nutrition of Plant Tissue Cultures. En: Cell Culture an d Som atic Cell Genetics of Plants, Ed. I.K. Vasil., V.2. pags. 129-147. Pierik, Ir. R.L.M. 1984. In vitro culture of Higher plants. Department of Horticulture Agricultural University, Wageningen, 107 pags. Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe y I.K. Vasil. 1976. Plant Tissue Culture Media. In Vitro 12(7): 473-478.
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EJ EMPLO DE PREPARAC IO N DE 100 M L DE MEDIO NRO . 2. MEDIO 2 = Medio bsico de Murashige y Skoo g (1962) + 1 m g/l 2,4-D
Baln aforado de 100 m l + un poco de agua AGREGAR SALES DE MURASHIGE Y SKOOG 2 ml A 2 ml B 0.5 m l C 0.5 m l D 0.5 m l E 1 ml F AGREGAR LA VITAMINA Tiam ina-HCl (0.5 m l) AGREGAR 10,0 mg Mio-Inosit ol AGREGAR 3 g DE SACAROSA PREVI AMIENTE DI SUELTA EN AGUA AGREGAR HORMONAS 0.1 m l 2,4-D (stock 1 m g/m l) AFORAR A 100 m l AJUSTAR pH a 5,8 con NaOH HCl AGREGAR 0.8 g AGAR Y DI SOLVERLO EN EL MICROONDAS SERVI R EL MEDIO EN 10 TUBOS PEQUENOS
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TABLA DE MEDIO S DE C ULTIVO PARA LAS PRAC TICAS 2, 3, 4, 5 MEDIO AUXINA (m g/l) C ITOQ UININA (m g/l ) V DE MEDIO (ml) 1 600 NRO . DE ENVAS E S 30 fcos. floema zanahoria callo tabaco yem as y micro-esquejes embriones 2 3 4 5 6 7 8 1 2,4-D 0.5 AIA 0.5 AIA 0.1 ANA 0.1 ANA 0.1 AIA 2 2 K K 200 100 100 100 100 100 100 10 fcos. 5 fcos. 5 fcos. 5 fcos. 5 tubos 5 tubos 5 tubos floema zanahoria callo tabaco callo tabaco callo tabaco hojas Begonia yem as-microesquejes embriones TEJIDO Q UE SE VA A SEMBRAR
0.5 BA 1 BA 1 K
NO TA: Todo s los medios contienen los com ponentes bsicos de Murashige y Skoog (1962) indicados en el anexo N1.
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CO NDICIO NES DE ASEPSIA. Los tejidos cultivados in vitro deben mantenerse en condiciones aspticas: 1. Los explantes que se siem bran para establecer cultivos iniciales son sometidos a un proceso de desinfeccin que se describe en detalle en cada prctica. El procedim iento de desinfeccin depende del tipo de tejido y en qu condiciones f ue cultivado. 2. Es recom endable realizar todas las manipulaciones del tejido y m edios ya
esterilizados en una cm ara de flujo lam inar que elimina por filtracin las partculas suspen didas en el aire garantizando un ambiente no contam inado. 3. Para trabajar en el cuarto de cultivos donde estn las cmaras de flujo laminar se deben seguir las norm as siguientes: El am biente debe m antenerse limpio, la superficie de trabajo se desinfecta con alcohol 70% antes y despus de usarla, se debe usar bata de laboratorio y lavarse bien las manos antes de entrar, los in strumentos como pinzas, bistur, etc. se desinfectan flamendolos, la vidr iera utilizada se esteriliza en el autoclave. Las m anipulaciones que se hacen en la cm ara de flujo lam inar, se hacen cerca de la llam a del m echero, PRECAUCI ON: MANTENGA ALEJADO EL FRASCO DE ALCOHOL Y EL ALGODON IMPREGNADO DE ALCOHOL DE LA LLAMA DEL MECHERO, PUEDEN PRENDERSE. 4. Al finalizar el trabajo, se apaga el m echero, se cierra la llave del gas, se lim pia con alcohol la m esa de la cmara (no las paredes porque se manchan), se apaga la cmara y se deja el cuarto con la luz ultravioleta. PRECAUCION: LA LUZ ULTRAVI OLETA ES DAINA PARA LA SALUD, NO SE EXPONGA A ELLA NI LA MIRE.
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PRACTICA N 2 Induccin de embriognesis somtica.

1. O BJETIVO S a. b. Inducir el proceso de em brio gnesis som tica a partir de explantes de zanahoria. Establecer las caractersticas f undam entales del proceso de embriognesis som tica a partir de los tejido s sem brados de zanahoria, y en otros sistemas (caa de azcar y caf) establecidos en el laboratorio.
1. INTRO DUCCIO N. La em briognesis somtica es el proceso por el cual clulas somticas haploides o diploides se desarrollan hasta form ar un em brin, sin que hay a f usin de gametos. Este proceso ocurre en form a natural en una cantidad de especies, pero generalmente se le conoce m ejor como una ruta para la regeneracin in ducida por cultivo de tejidos. Un embrin som tico puede definirse com o una planta en su etapa inicial de desarrollo que presenta una estructura bipolar, con raz y vstago en polo s opuestos de un mismo eje, no tiene conexin vascular con los tejido s m aternos y su origen es unicelular o multicelular pero las clulas que lo originan no son productos de la fusin gam tica. Hay do s formas esenciales de em brio gnesis somtica in vitro: La em briognesis somtica directa, es aquella en la cual los embriones se originan directamente de un tejido sin que haya previamente proliferacin de callo, y la embriognesis somatica indirecta, es aquella en la cual la proliferacin de callo es un requisito previo para el desarrollo del embrin. La induccin de em briones somticos tiene diversas aplicaciones: permite la propagacin vegetativa masiva de genotipos selectos, es m uy til en las plantas don de la propagacin vegetativa por mtodos agronmicos tradicionales no es eficiente. En varios cultivos se estn utilizando em briones somticos para producir las llamadas sem illas sintticas, donde el embrin es encapsulado en un medio artificial que sim ula la semilla y luego puede utilizar se de modo similar a la misma. La induccin de em brio gnesis somtica in vitro se ha visto como un sistem a m s fcilmente manipulable para hacer estudios que perm itan determ inar los eventos bioqumicos y genticos que ocurren durante el proceso. En la presente prctica se sembrarn explantes tom ados de una zanahoria, este fue el primer sistema en el cual se logr inducir el proceso de embr iognesis somtica in vitro,
y ha sido muy estudiado, por ello es uno de lo s sistem as que ha sido mejor caracterizado hasta el presente y se lo considera un m odelo de cultivo in vitro y en especial de embriognesis somtica, por ello lo hemos escogido para este trabajo de laboratorio, adem s se o bservarn otros sistem as de cultivo que se trabajan en el laboratorio, para compararlos con la zanahoria, y permitir considerar las aplicaciones que dichos mtodos han tenido en la investigaciones que llevamos a cabo actualmente. 3. MATERIALES Y METO DOS. Procedimiento de siembra de los explantes. a. Desinfeccin de lo s tejidos Lave la zanahoria con agua, jabn y cepillo. Crtela en trozos de aproximadam ente 4 centmetros de largo y colquelas en una solucin de cloro al 20 % por 15 m inutos. Lleve a la cmara de flujo lam inar y enjuague 2 veces con agua destilada estril. b. S iembra Se sem brarn los explantes en los medios 1 y 2. Tome un trozo de zanahoria con una pinza estril, colquelo en una placa de Petri y con un sacabocados saque cilindro s de xilem a + floema + cambium . Corte disco s con un bistur y simbrelos sobre el m edio, tomando en cuenta la polaridad. S iembre 3 discos en cada frasco, selle los frascos con envoplast e incube en el cuarto de cultivo o en luz. c. Repique Bajo con diciones aspticas, transfiera los tejidos a m edio control (m edio 1, sin hormonas) fresco.
6. BIBLIO G RAFIA. Street, H.E. y L. A. Whiters. 1974. The anatomy of embryogenesis in culture. En: Tissue culture & Plant Science. H.E. S treet (Ed.) Ed. Acad. Press, Londres, pp. 71-100. Reinert, J. y Yeoman, J.J. 1982. Plant Cell and Tissue Culture. A Laboratory Manual. Ed.Sprin ger- Verlag, Berln, 83 pags.
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PRCTICA N 3 Organognesis
1. O BJETIVO S a. Inducir organo gnesis usan do hojas como explantes. b. Inducir or ganognesis indirecta en callos de tabaco. c. Establecer curvas de crecim iento de callos utilizan do diferentes parm etros.
2. INTRO DUCC I ON La organognesis es el proceso de r egeneracin que ocurre mediante la formacin de rganos de novo, com o vstagos, races, flores, hojas, etc. Puede ser directa si ocurre sin la formacin previa de callo o indirecta si se requiere la formacin previa de callo. El callo es un tejido no or ganizado y poco diferenciado formado por clulas en proliferacin que se producen tanto in vivo como in vit ro. Estos ltimos pueden ser de dos tipos segn su consistencia. a) friables, formados por clulas unidas en forma laxa, cuyas paredes celulares presentan mayores concentraciones relativas de hem icelulosa y pectina que de celulosa. b) com pactos form ados por clulas f uertemente unidas entre si, cuyas paredes celulares presentan m ayores concentraciones de celulosa que de hemicelulo sa y pectinas. Los callos in vitro en general se forman a partir de explantes cultivado s en presencia de altas concentraciones de auxinas. La organo gnesis indirecta tiene inters en program as de seleccin en lo s que se requiere variabilidad gen tica adicional a la ya existente en la naturaleza como por ejemplo la resistencia a antibiticos, herbicidas, sequa, etc. La organognesis directa se utiliza en la m icropropagacin de plantas lites.
3. MATERIALES Y METO DOS 3.1. Procedimiento de siem bra de los explantes Tome el callo o la hoja suministrada con una pinza estril, coloque cada uno en una placa de Petri, crtelo en trozos de tam aos sim ilares y siembre uno por frasco en los m edios respectivos (medios 1, 3, 4, 5 y 6). S elle los frasco s con env-o-plast e incube en el cuarto de cultivo. 3.2. Determinacin de peso fresco y peso seco.
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El da en que se inicie el cultivo, tom e una m uestra del callo y anote su peso (peso fresco). Luego envulvalo en papel de alum inio y colquelo en la estufa bien identificado, por varios das, hasta que est totalmente seco y determine su peso seco. Repita el procedimiento tom ando m uestras del material en cultivo durante 6 semanas. Elabore las respectivas curvas de crecim iento.
4. BIBLIO G RAFIA. Reinert J. M. M. Yeoman. 1982. Plant Cell and Tissue Culture. Laboratory Manual. Ed. Sringer- Verlag, Berln.
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PRACTICA N4 Cultivo de yemas y microesquejes.

1. O BJETIVO Observar la form acin de brotes en yemas de ro sa y microesquejes de crisantem o.
2. INTRO DUCC I ON Las plantas adultas presentan meristemas en los extremos del eje principal y en las ramificaciones del vstago de la raz. Los m eristem os del vstago o domo meristemtico se encuentran rodeados por los prim ordios foliares y en conjunto constituyen las yemas apicales o axilares dependiendo de su posicin en la planta. Las yemas axilares aisladas o las presentes en nm ero variable en los n udo s de microesquejes cultivados in vitro en presencia de hormonas, generalmente de citocininas, form an brotes. El nmero de brotes formados dep ender del n m ero de yem as preexistentes, de la concentracin de horm onas end genas, as como de las concentraciones relativas de las hormonas aadidas. Lo s brotes formados pueden provenir de yemas axilares preexistentes o de yemas adventicias; estas ltim as pueden form arse al proliferar en si m ism a la yema axilar. Generalm ente las yemas adventicias se forman en presencia de altas concentraciones de citocininas. El cultivo de yem as y m icroesquejes se utiliza en la m icropropagacin clonal masiva de plantas lites. El cultivo de lo s domos meristemticos o de yemas con pocos primordios se utiliza para la obtencin de plantas libres de virus.
3. MATERIALES Y METO DOS 3.1. Aislam iento y desinfeccin del explante: Corte secciones de m icroesquejes que contengan un nudo con su yema, lvelos con agua y jabn azul. Colquelos en una solucin de cloro comercial al 20% y agite en una plancha m agntica por 15 a 20 minutos. En la cmara de flujo laminar lave las secciones de tallo con agua destilada estril. 3.2. Siembra: Los explantes sern sembrado s en los medio s de cultivo 1 y 7. Cortar los extrem os del microesqueje y con la ayuda de una pinza siem bre un microesqueje por frasco, tom ando en cuenta siem pre la polaridad. Para sem brar yemas, aisle sta con la ayuda de un microscopio estereoscpico y material de
diseccin. S iembre una yema por frasco, selle los frascos con envoplast e incube en el cuarto de cultivo.
4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS. Realice observaciones semanales en el microscopio estereoscpico: Observe el m omento de form acin de los brotes. Estim e cualitativamente la form acin de brotes y com pare lo que
ocurre en los distintos medios.
5. PRE G UNTAS. a. Por qu los brotes regenerados a partir de yemas adventicias presentan m ayor variacin som aclonal que los regenerado s a partir de yemas axilares? b. Cul es la estructura general de una yema y qu criterios se utilizan para clasificarlas? c. Cules son las tcnicas que se combinan con el cultivo de m eristem as para obtener plantas libres de vir us?
6. BIBLIO G RAFIA Margara J. 1988. Multiplicacin vegetativa y cultivo in vitro. Los meristemos y la organognesis. Ed. M undi-Prensa. Madrid.
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PRACTICA N5 Cultivo de embriones cigticos.

1. OBJETIVO Observar la regeneracin de plantas a partir del cultivo in vitro de em briones cigticos.
2. INTRO DUCCIO N. El cultivo de embriones cigticos consiste en el aislam iento y crecimiento in vitro en condiciones estriles de un embrin inm aduro con el fin de obtener una planta viable. En principio existen dos tipos de cultivos de embriones: a. cultivo de em briones inmaduros, los cuales se originan de semillas que no acabaron de m adurar. El xito de este tipo de cultivo depen de principalmente del estado de desarrollo del em brin utilizado. b. Cultivo de em briones maduros, los cuales a su vez se encuentran en semillas m aduras. Este tipo de cultivo es relativamente fcil. Algunas de las aplicaciones del cultivo de em briones son: acortamiento del ciclo de m ejoram iento, prevencin del aborto em brionario, produccin de haploides y para conseguir la form acin de callos, rescate de embriones hbridos interespecficos.
3. MATERIALES Y METO DOS. 3.1. Desinfeccin de las semillas. Lave las sem illas con agua y jabn. Colquelas en una solucin de cloro com ercial al 20 % y agite en una plancha magntica por 15 minutos. Luego colquelas en una cpsula de Petri con agua destilada estril en condiciones aspticas por 30 minutos. En la cmara de flujo laminar lave con agua destilada estril. 3.2. Siem bra. Los embriones sern cultivados en los m edios 1 (control) y 8. Colo que una sem illa en una cp sula de Petri, separe lo s cotiledones y aisle el embrin cuidadosamente. S iembre un embrin por frasco, selle los frasco s con env-o-plast e incube en el cuarto de cultivo.
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4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS. Realice observaciones semanales en relacin a: Porcentaje de sobrevivencia y porcentaje de germinacin de los em briones en los diferentes tratamientos. Longitud del vstago
5. PRE G UNTAS. a. Cules otras aplicaciones tienen los cultivos de embriones?
6. BIBLIO G RAFIA. Pierik, R.L.M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mun di-Prensa.
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PRCTICA N 6 Extraccin de protenas en tejidos vegetales cultivados in vitro

1. O BJETIVO S Al fin alizar esta prctica el estudiante debe ser cap az de: 1.1. Realizar extracciones de proten as de tejido s vegetales cultivado s in vitro . 1.2. Aplicar el m todo de Bradford p ara estimar la con centracin proteica. 1.3. Preparar geles de poliacrilamida 1.4. Realizar corr idas electroforticas de protenas en geles de po liacrilam ida 1.5. Visualizar protenas en geles de poliacrilam ida por tincin con Azul de Coom asie e interpretar los p atrones electrofortico s de protenas. 2. INTRO DUCCI N Una form a de est udiar la diver sidad gentica es analizar la expresin de protenas, que son los pro ductos primarios de los genes. Tambin han sido muy utilizadas las iso enzimas que son las difer entes formas m oleculares de un a protena que presenta la m ism a especificidad en zim tica. Han sido establecido s mapas genm icos isoen zim ticos para varias especies de plantas. Las protenas e isoen zim as tambin son m uy tiles para detectar diferen cias en la expr esin gentica durante el desarro llo. Uno de lo s mtodos m s utilizados para est udiar las protenas es la electroforesis, m ediante la cual las protenas migran por el efecto de la aplicacin de un cam po elctrico so bre un m edio de soporte slido, que en esta prctica estar con stituido prin cipalm ente por poliacrilamida. El gel tam bin p uede ser de alm idn, agarosa, etc. Segn las
condicion es de la corrida electrofortica, en geles con SDS (Do decil sulfato de so dio) las protenas adquieren car ga negativa y se separan de acuer do a su tamao. Cuando las protenas son colocadas en un gel con un gr adiente de pH, las protenas migran de acuer do a su punto isoelctrico (valor de pH al que la molcula no posee car ga elctrica y es incap az de desplazarse en un cam po elctrico). Para detectar isoenzimas se realiza una corr ida electrofortica en condiciones no desnat uralizantes y luego se debe suministrar el sustrato y los cofactores apropiado s para que ocurra una reaccin tal que
se o bten ga un pro ducto coloreado.
El pro ducto coloreado se deposita en el gel,
formando una ban da visible en el lugar don de la isoenzim a h a sido localizada electroforticamente. Las ban das visualizadas de enzimas especficas repr esentan productos protenicos, lo s cuales tienen una base gen tica, y p ueden proveer informacin gentica como marcadores co dom inantes. Sin em bar go el problem a es que los lo ci isoenzimticos estn sujetos a m odif icacin po st-transcripcional lo cual restrin ge su utilidad com o m arcador es gentico s. El anlisis de lo s cam bio s en las protenas e isoenzim as durante los proceso s de dif erenciacin y desdif erenciacin in vitro es de much a im portancia p ara lo grar una m ayor comprensin de la regulacin de la expresin gnica asociada a ciertos eventos m orfognico s. La deteccin de protenas asociadas con ciertos patrones de
dif erenciacin se ha utilizado como punto de p artida para lograr el aislam iento de genes asociado s a un aspecto determ inado del desarrollo, por ejem plo para identificar genes relacionados con el pro ceso de em brio gnesis. Kiyosue et al. (1992) lo graron aislar un clon de cDNA que codif ica ECP31, una proten a asociada con clulas em br iognicas de zanahoria. En esta prctica se harn extracciones de protenas de tejido s vegetales cultivados in vitro, posteriormente se separar n por electroforesis en geles de poliacrilamida y sern visualizadas por tincin con Azul de Coomassie. Fin alm ente, se analizarn los resultado s o btenidos y su aplicacin al est udio de los cultivos de tejidos vegetales.
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3. MATERIALES Y M TO DO S 3.1. Extraccin y cuantificacin de protenas. a. Pesar 500 mg de hojas, p ulver izar las con nitrgeno lquido y m acerar en fro con 1 m l (2 volm enes) de am ortiguador de extraccin A. (2,3 v eces). Prep arar el am ortiguador de extraccin A en el momento de usar (10 ml S tock Buff er A + 150 mg PVP, 100 l -Mercaptoetanol). b. Transferir el macerado a tubos de microcentrf uga y centrifugar por 20 m inutos a 13.000 rpm. c. Recoger el so brenadante en otro tubo y centrif ugar nuev am ente por 10 minutos. d. Tomar 100 l del sobr enadante para determ inar la concentracin de protenas solubles por el m todo Bradfor d. Par a esto, se le aade 1 m l del r eactivo de Bradfor d a los 100 l del extracto, usan do 100 l de Amortiguador de Extraccin A como blanco, la con centracin se estim a utilizando una curva patrn de Albmina de Suero Bovino ( el mtodo de Br adford se encuentra descrito al fin al de esta prctica). e. Medir el volumen del resto del sobrenadante y calcular la cantidad total de protenas en el extracto. f. Para precip itar las protenas, se a aden al so br enadante 1/10 vo lm enes de cido Tricloroactico 100% (-20 C) con 1 % -Mercaptoetanol, y se incuba durante 2 horas a -20 C, en este punto se p uede dejar toda la noche. g. Recoger las protenas por centrif ugacin a 5.000 rpm, 4 C, 5 m inutos. h. Descartar el so brenadante decantando. Elim inar la mayor cantidad po sible de cido Tricloroactico invirtien do lo s tubo s so bre pap el absor bente. i. Lav ar el precipitado con etanol 100% (-20 C) tres veces, 5 minutos cada vez. En cada lavado, use el vortex para despegar el p ellet del tubo. j. Descartar el etanol decantando, y dejar que se evaporen los restos de etanol en fro, es decir, sobre hielo y en la cam pana extractora de gases. k. Resuspen der las protenas en am ortiguador de m uestra Laemm li 2X m odif icado (5 m l Laemmli 4X + 500 l -Mercaptoetanol + 4.5 m l Agua destilada).
El clculo del vo lum en del Amortiguador Laem mli que se utilizar para resuspen der las proten as precipitadas, se determ ina en base a la cuantificacin de protenas que se hizo por el m todo de Bradfor d. La p astilla se resuspen de en un volumen de am ortiguador tal, que permita cargar en el carril del gel 50-200 g de protena. Por ejemplo, que en 25 l de am ortiguador (volum en mximo que p uede car gar se en el bolsillo del gel) queden disueltos 50 a 200 g de proten a. l. Transferir el extracto de protenas a un tubo de microcentrfuga. Centrifugar 3-5 minutos, calentar a 95 C por 5 m in y aplicar la muestra al gel el m ism o da. Si no se va a aplicar el m ismo da, se almacena a -70 C por el menor tiempo posible. Nota: Hacer un pequeo agujero a los tubo s eppen dorf antes de calentar para que las tapas no se abr an por la pr esin del vapor.
3.2. Preparacin de geles de poliacrilam ida y separacin electrofortica de protenas. a. Lim piar lo s vidrio s cuidadosamente con agua y jabn, lim piar con alcohol, enjuagar con agua destilada y dejar secar.
b. Armar el dispositivo de la cmara de electroforesis que serv ir como m olde para el gel, luego llen arlo con agua destilada para comprobar que no hay f uga de lquido. Descartar el agua y secar.
c. Utilizan do el peine como gua, hacer una marca en el nivel hasta el cual debe llegar el gel.
d. Preparar las m ezclas de acrilamida para el gel sep arador y el gel con centrador segn la siguiente tabla. Se prepar a la mezcla para am bos geles sim ultneamente pero sin agr egarle el N,N, N, N- Tetrametil-etilendiam ina (TEMED) n i el Per sulfato de Am onio (P S A), estos do s se agr egan justo antes de vertir la mezcla en el m olde.
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Solucin Stock Acr ilamida 30 - 0.8% 1 M TRI S pH 8.8 1 M TRI S pH 6.8 H2O SDS 20% TEMED PSA 10%
Gel Separador (14%) 4.67 m l 3.76 m l 1.46 m l 50 l 10 l 50 l
Gel C oncentrador (5%) 0.84 ml 0.63 ml 3.48 ml 25 l 5 l 25 l
PREC AUCI N IMPO RTANTE: La acr ilamida es neurotxica por lo tanto debe utilizar se propipeta o micropipetas para pipetearla, adem s todo el proceso de manip ulacin (prepar acin de la mezcla y del gel, tincin, etc.) debe llev arse a cabo con guantes. e. Agregar el TEMED y el PSA a la m ezcla del gel separador, m ezclar bien y con una pipeta Pasteur llenar con esta m ezcla el espacio entre lo s dos v idrio s, hasta la
marca hecha prev iam ente. Esto debe realizar se rpidamente y evitando que queden bur bujas en el gel. f. Con un a pipeta Pasteur, agregar suavem ente agua sobre el gel, y esper ar hasta que el gel polimerice (aprox imadam ente 20 min). g. Se saca el agua con mucho cuidado y se seca utilizan do pap el de filtro. Colocar el peine, agregar el TEMED y PSA a la mezcla del gel concentrador y vertirlo de la misma forma que el gel separador. Esper ar que polim erice el gel concentrador (aproximadam ente 10 m in), y retirar el peine con m ucho cuidado. Lavar lo s bolsillo s con un piceta con agua destilada. h. Agr egar una pequea cantidad de grasa de vaco a la U gris del electrodo y arm ar el sandwich con los geles. Agr egar am ortiguador de corrida en la estruct ura que contiene lo s geles par a comprobar que no hay f uga de lquido. Colocar el sandwich dentro de la cubeta de electroforesis que ha sido llenada previamente con am ortiguador de corr ida. i. Usando un a jerin ga Ham ilton, car gar en el gel lo s m arcador es de peso m olecular previamente calentados a 95 C dur ante 5 min utos, y luego el volum en de muestra
previamente calculado. Recuer de tom ar nota, del orden en el cual car g lo s estndares de peso m olecular y las m uestras en los bolsillos del gel. j. Tapar la cubeta de electroforesis y conectarla a la f uente de po der ap agada, tener cuidado que el electrodo rojo est conectado al con ector rojo de la fuente de poder, y el electrodo negro est conectado al conector negro de la f uente de poder. Encienda la f uente de poder y aum ente el voltaje hasta 70 voltio s. Despus de unos min utos debe verificarse visualmente si las m uestras estn corrien do en la direccin correcta. Mantener este voltaje hasta que las m uestras pasen el gel con centrador y luego aumentar a 120 voltios hasta que el frente de corrida de color azul llegue hasta el bor de inferior del gel. k. Apagar la fuente de po der y desconectar la cm ara. Desensamblar el sandwich, separ ar los vidrio s cuidadosam ente y sacar el gel, que ser colocado dur ante 20 minutos en la solucin de tincin con azul de Coom asie, en agitacin con stante. l. Quitar la so lucin de tincin y lavar bien el gel con agua destilada. m . Agregar solucin de destincin y dejar el gel en esta solucin con agitacin constante, hasta que se p uedan o bservar las ban das de protenas con claridad. n. Una vez que se h ayan teido las ban das de protenas, el gel debe ser fotografiado para su registro y p uede ser em pacado en bolsas plsticas, o p uede ser secado en el secador de geles. 3.3. Soluciones utilizadas en la prctica. a. 250 m l de Am ortiguador TRIS 1M p H 6.8; 8 ; 8.8: Pesar 30.28 g de Tris- Base y disolv er en 150 m l de Agua destilada, ajustar al pH deseado con HCl concentrado y llevar el volum en a 250 m l. b. 250 m l de Solucin Stock Acrilamida - Bisacrilamida 30 - 0.8%: Disolver en agua destilada 75 g de Acr ilamida y 2 g de Bis- acrilam ida, llevar el volumen a 250 ml, filtrar con papel W hatman Nro. 1 y almacenar en un frasco oscuro a 4 C. PREC AUCI N IMPO RTANTE: La acrilamida es neurotxica. Usar guantes y mscara durante su prep aracin y m anip ulacin.
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c. S tock de Amortiguador de extraccin A: Mezclar 5 m l de 1M Tris pH 8.0, 5 m l de 100 % Glicerol, 100 l de 0.1 M EGTA, 10 ml de 2 M KCl 1.492 g de KCl, llevar el volumen a 100 ml con agua destilada. Guardar en alcuotas de 10 m l a -20 C. d. Am ortiguador Laemmli de Muestra 4X: Mezclar 25 ml de 1M Tris pH 6.8, 4 g de SDS, 40 m l de 100 % Glicerol, 20 mg de azul de bromofenol, llevar el vo lum en a 100 m l y disolver. - Guar dar en alcuotas de 10 ml a -20 C. e. Mezcla de Marca dores de Peso Molecular: Mezclar 8 l de Ovoalbm ina, 8 l de BSA, 8 l de Citocromo C, 8 l m ioglobin a y 48 ul de Amortiguador Laemm li de muestra 2 X. La mezcla de m arcadores se calienta a 95C por 5 minutos justo
antes de cargar en el gel.- Car gar 12 l de esta m ezcla para un carril en m inigeles (aprox.3.6 g de cada marcador) o Car gar 30 l en geles gran des. Preparar aparte el Quim iotripsingeno: Mezclar 8 l de Quim otripsingeno con 92 l de Am ortiguador Laemm li de m uestra 2X. f. Am ortiguador de Corrida TRIS-G licina 10X: Disolv er en agua destilada 15 g de Tris Base, 72 g de Glicina y 5 g SDS, afor ar a 500 ml con agua destilada. Para realizar la corrida tomar 50 ml del stock 10X y llevar a 500 ml con agua destilada, mezclar bien la solucin antes de a adirla a la cmara de electroforesis. g. Solucin de Tincin Azul de Coom assie R. Mezclar 150 ml de metanol con 50 m l de cido actico, llevar el volum en a 500 ml, luego agr egar 1 g de Azul de Coom assie R y disolver. h. S olucin de Destincin: Mezclar 100 m l de metanol, 100 ml cido actico y llevar el volum en a un litro con agua destilada.
4. BIBLIO G RAFA Bradford, M. 1976. A Rapid an d Sen sitive Method for the Quantitation of Microgr am Quantities of Protein Utilizin g the Prin ciple of Protein-Dye Bin ding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. Harris, E:L. V. y An gal, S . (Eds.). 1989. Protein purification m ethods. Ed. I. R.L. Press, Oxfor d, 317 pags.
Kiyosue, T., Yamaguchi-Shino zaki, K., Shinozaki, K., Higashi, K., Satoh, S., Kamada, H. and Har ada, H. 1992. Iso lation and characterization of a cDNA that encodes ECP31, an em bryo genic-cell protein from carrot. Plant Molecular Biology 19: 239-249. Laemmli, U.K. 1970. Clevage of struct ural protein s durin g the assem bly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 : 680-685. Menndez- Yuff, A., Gar ca de Garca, E. y Segur a-Nieto, M. 1994. Com parative study of protein electrophoretic patterns during em bryo gen esis in Coffea a rabica cv. Catim or. Plant Cell Reports 13: 197-202.
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C UANTIFIC AC I N DE PRO TENAS PO R EL M TO DO DE B RADFO RD (1976). 1. Preparacin del reactivo de Bradford: a. Disolv er 100 m g de azul de Coom assie G-250 en 50 ml de alcohol al 95%. b. Aadir 100 ml de cido fo sfrico al 85%. c. Aforar hasta 1 l con agua destilada d. Filtrar con papel Whatman Nro. 1. 2. E laboracin de la curva de calibracin: a. Preparar una solucin patrn de protena con albmina de suero bov ino ( BSA) de 1 mg/ml. b. Preparar diluciones de la solucin anterior que contengan 1,2,4,6,8,10 g de BSA en 100 l de agua destilada. c. Preparar un blanco mezclando 100 l de agua con 1 ml del reactivo de Bradfor d. d. Mezclar 100 l de cada dilucin con 1 m l de r eactivo de Bradfor d (hacerlo por triplicado). e. Incubar 10 min utos a tem peratura am biente y m edir la absor ban cia a 595 nm. f. Graficar el peso de protena contra la absor bancia correspondiente. Aplicar un
clculo de regresin lineal y dibujar la recta estim ada. Esta curva se utilizar p ara estimar la cantidad de protenas en una muestra pro blem a. Anlisis de regresin lineal: Y = B + AX Donde: Y = absor bancia X = concentracin de la solucin a medir B = p unto de corte con el eje Y A = p endiente de la recta 3. E stimacin de la concentracin de protenas en una muestra problema a. Co locar en un tubo eppen dorf 100 l del extracto de proten a a medir y mezclarlo con 1 ml del r eactivo de Bradfor d. b. Preparar un blanco con 100 l del amortiguador de extraccin y 1 ml del reactivo de Bradford. c. Incubar durante 10 minutos a tem peratura am biente. d. Medir la absor ban cia a 595 nm. e. Estimar la concentracin del extracto de proten a utilizando la curva de calibr acin.
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PRCTICA N 7 Extraccin de A DN vegetal

1. O BJETIVO S 1.1. Fam iliarizar al estudiante con la tcnica de extraccin y purificacin de ADN genmico de plantas. 1.2. Determinar la p ureza y concentracin del ADN extrado m ediante tcn icas espectrofotom tricas. 1.3. Realizar la electroforesis en gel de agaro sa del ADN extrado. 1.4. Enfatizar la importancia de la o btencin de ADN vegetal en la aplicacin de la tecnologa del ADN recombinante.
2. INTRO DUCCI N Desde que W atson y Cr ick en 1953 form ularon la natur aleza de doble h lice complem entaria del ADN, el anlisis de su estruct ura y f uncin aclar las bases de los procesos biolgicos. Mucho de nuestro entendim iento actual de la gentica m olecular est basado en lo s hallazgos de las funcion es del ADN, las cuales vien en determinadas en gr an extensin por la estr uctura fsica de la doble h lice. Una cadena de ADN es un polmero lar go, no ramificado, com puesto de slo cuatro tipos de subunidades. Estos son los desoxiribon ucletidos que contienen las bases Adenina (A), Citosina ( C), Guanina ( G) y Tim ina (T). Los nucletidos estn unido s por enlaces fo sfo diester covalentes que un en al Carbono 5 de un gr upo desoxiribo sa con el Carbono 3 del prximo. La caracterstica esencial del modelo de do ble hlice, es que todas las bases de la m olcula de ADN estn en el lado interno de la doble hlice, con los azcares fo sfato del lado externo. Esto hace que las bases de una hlice estn m uy cercanas a las de la otra hlice, lo cual requier e un apareamiento entre un a base pur ina gr ande (A o G) en una cadena y una base pirimidina pequea (T o C) en la otra. Luego los estudios bioqumicos dem ostraron que el apareamiento ocurra entre A y T y entre G y C. La estructura del ADN provee las bases de la h erencia. Un gen lleva la informacin biolgica en una form a que debe ser copiada fielmente y transm itida de cada clula a todas las de su pro genie.
El contenido de ADN n uclear en plantas superiores es muy var iable. Mientras que to dos los mamfero s tienen aprox imadam ente 3 x 109 pb por genom a haplo ide, las plantas superior es po seen un contenido de ADN en genom a h aploide que var a desde 7 x 10 pb en Arabidop sis thaliana hasta 2 x 10 p b p ara ciertas gim nosperm as. Estudio s en biolo ga molecular de plantas han mostrado que la mayora del ADN en plantas de genom as gr an des, es ADN repetitivo. En contraste con el ADN que codifica par a genes que son traducido s a proten as, el ADN repetitivo, en vez de codificar para genes, juega un pap el en la or gan izacin del genoma vegetal, expresin gn ica y desarrollo.
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3. MATERIALES Y M TO DO 3.1. Extra ccin y purificacin de ADN Mtodo segn Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. I solation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15. a. Macerar de 100 a 150 mg de material vegetal con Nitrgeno lquido. b. Mezclar con 700 l de amortiguador par a la extraccin de DNA ( CTAB 2X, 10% de -mercaptoetanol, el cual se aade antes de usar). c. Co locar el macer ado vegetal en un tubo Epp en dorf de 1.5 ml. d. Incubar a 65 C durante 45 m inutos, agitando en un vortex cada 15 minutos. e. Permitir que las m uestras se enfr en a temperatura ambiente durante 2 minutos. f. Centrif ugar en una centrifuga Eppen dorf a m xima velocidad durante 20 m in utos. g. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1.5 m l y aadir 500 l de CIA (Cloroform o: Alcohol isoamlico 25:1), mezclando el tubo suavemente por inversin, para evitar la ruptura del ADN. h. Centrif ugar la m ezcla durante 5 m in utos a mxima velocidad en un a centrif uga Eppen dorf. i. Transferir la fase acuosa (super ior) (teniendo cuidado de no contaminarla con la interfase blanquecina) a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, y agregar 50 l de CTAB 10X. Mezclar suavem ente. j. Repetir la extraccin con CIA (p aso g-h). k. Agregar 500 l de I sopropanol fro (- 20 C). Mezclar por inversin del tubo varias veces y m antener a -20 C durante 30 m inutos par a la precipitacin del DNA. l. Centrifugar a 14.000 r.p.m . por 20 m inutos. m . Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el pellet de ADN, que se dejar secar de 1 a 2 minutos invirtiendo el tubo so bre un papel absor bente.
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n. Lavar el ADN en 1 ml etanol 70% y centrifugar durante 10 m inutos. Descartar el etanol. Realizar un segun do lavado con etanol 90 % y dejar secar el ADN dur ante varios min utos a temperatur a am biente. . Resuspen der el ADN en 50 l de am ortiguador TE agua destilada estril durante 30 minutos. o. Incubar el ADN disuelto con 5 l RNAasa H 10 m g/ml, a 37 C durante 1 hora par a la digestin del RNA total contaminante presente en la m uestra. ( Optativo en este caso). p. Precipitar el ADN agregando 200 l de alcohol isoprop lico frio (-20 C), mezclar por inversin y refrigerar a -20 C durante 30 m inutos. q. Centrif ugar por 20 m inutos a 14.000 r.p.m. en una centrf uga Epp endorf. r. Descartar el sobrenadante y secar el pellet por inver sin de lo s tubos sobr e papel absor bente, durante varios m inutos. s. Disolver el ADN en 50 a 100 l de TE y alm acenar a -20 C.
3.2. Electroforesis en gel de agarosa del ADN extrado Para analizar la integr idad del extracto de ADN obtenido, se r ealiza un a electroforesis en gel de agaro sa 0.8% en amortiguador T BE 0.5 X. La cm ara de electroforesis debe ser llenada con buff er TBE 0.5 X. a. S e mezclan 9l del extracto de ADN, con 1l de buff er car gador y se colocan en un bolsillo del gel. b. Se mezclan 2 l de m arcador de peso m olecular (ADN del fago doblem ente digerido con las endonucleasas Hin d III y Eco RI) con 1 l de buff er car gador y se colocan en otro bolsillo del gel. c. Se llev a a cabo la electroforesis, a 50 vo ltios hasta que las m uestras p enetren y luego colocar la fuente de po der a 100 voltios, hasta que el azul de bromofenol haya migrado aprox im adamente 3 cm . d. Se tie el gel con 4 l de brom uro de etidio en 200 ml de agua por 5 m inutos
PRE C AUCI N: El brom uro de etidio es un po dero so agente mutagnico por lo tanto debe manip ular se con guantes. e. Lavar el gel con agua destilada por 10 m inutos. f. S e observa y se fotografa en un transiluminador bajo irradiacin ultravioleta. PRE C AUCI N: La luz ultravioleta es daina p ara lo s ojo s y la piel, por lo que debe usarse siempre una p antalla protectora. 3.3. Determinacin espectrofotomtrica Para determinar la cantidad y p ureza del extracto, se m ide su absorban cia a 260 y 280 nm, en un espectrofotmetro. La lect ura a 260 nm permite calcular la concentracin de cido s nuclicos en la m uestra. Una DO de 1, correspon de aproxim adamente a 50 g/m l de ADN de doble cadena, 40 g/m l de ADN y ARN de caden a sencilla, y 20 g/m l de oligon ucletidos de cadena sencilla. La relacin entre las lecturas a 260 y 280 nm, nos da un estim ado de la pureza del cido nuclico. Las prepar acion es p ur as de ADN y ARN, tien en un valor DO260/DO280 = 1.8 y 2, respectivam ente. Si existe contaminacin por protenas y fenoles, esta relacin disminuir. 3.4. PREPARACI N DE SO LUCIO NES a. Solucin de C T AB 2 X REAC TIVO S 2% CTAB( Hexadeciltrimetilamonio) 1,4 M NaCl (la sal CTAB debe disolver se en la solucin desp us de agregar el NaCl) 20 m M EDTA 100 m M Tris HCl p H: 8,00 PVP Agua destilada 20 mM 100 mM 1% 0,5 M pH 8.0 1.0 M 4 ml 10 m l 1 gr Volum en final 100 ml [FINAL] 2% 1,4 M [STO CK] 100 ml 2,00 g 8,12 g
b. Solucin de C T AB 10X
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REAC TIVO S 2% CTAB( Hexadeciltrimetilamonio) 1,4 M NaCl (la sal CTAB debe disolver se en la solucin desp us de agregar el NaCl) 20 m M EDTA 100 m M Tris HCl p H: 8,00 Agua destilada
[FINAL] 10 % 0,7 M
[STO CK]
100 ml 10,00 g 4g
20 mM 100 mM
0,5 M pH 8.0 1.0 M
4 ml 10 m l
Volum en final 100 ml
c. Am ortiguador TE Reactivos 10 mM Tris HCl p H: 8,00 1 mM EDTA pH: 8,00 [Stock] 1M 0.5 M 1l 10 ml 2 ml
d. Am ortiguador carga dor de geles -0.25 % azul de brom ofenol -0.25 % Xileno Ciano l FF -30 % Glicerol en agua -Almacen ar a 4 C e. Bromuro de etidio -Disolver 1 g en 100 ml f. Buffer T BE5X 54 g Tris base 27.5 g cido brico 20 ml EDTA 0.5M, pH 8 Llevar a 1 litro con agua destilada
4. BIBLIO G RAFA Br uce, A., B. Dennis, J. Lewis, M. Raff, K. Ro berts, J.D. Watson. 1994. Molecular Bio lo gy of The Cell. Thir d Edition. Gar lan d Publih ing, Inc. N.Y. 1294 pp. Nordheim , a., R.E. Herrera, K. Meese, L. Runkel, P.M. S cholten, H. Schrter and P.E. Shaw. 1988. Str uct ural an d Topological Polymorphism of DNA. In: Kah l, G.
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(De.) Architecture of Eukaryotic Gen es. VCH Ver lagsgesellschaft m bH, D-6940 Weinheim . 518 pp. Sambrook, J., Fr itsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Clonin g. A Laboratory Manual. 2nd. Edition. Cold Sprin g Har bor Laboratory Press. N.Y. Taiz, L. an d E. Zeiger. 1991. Plant Physiolo gy. The Benjamin/ Cumm ings P ublishin g Company, Inc. N.Y. 565 pp. Doyle, J.J. an d J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.
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ANEXO N1. FORMULACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIO DE MURASHIGE Y SKO OG (1962) NO MBRE CONSTITUYENTES DEL STO CK NH4 NO3 KNO3 H3BO3 KH2PO4 KI Na2MoO4.2H2O Co Cl2.6H2 O CaCl2.2 H2O MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O Zn SO4.7H2O CuSO4.5H2 O Na2EDTA FeSO4.7H2 O TIAMINA-HCl mio-Inositol cido nicotnico piridoxina glicina SACAROSA AGAR o GELRITE CONC. DEL STOC K g/l 82.5 95.0 1.24 34.00 0.166 0.050 0.005 88.0 74.0 4.46 1.72 0.005 3.72 2.78 0.08 VO L. STOC K PARA 1 l DE MEDIO 20 20 CONC. FINAL EN EL MEDIO mg/l 1 650 1 900 6.2 170.0 0.83 0.25 0.025 440.0 370.0 22.3 8.6 0.025 37.2 27.8 0.1 100 0.5 0.5 2.0 30 g/l 8 g/l 2 g/l
A B
E F G
5 10 1.25
ME DIO DE MURASH IGE Y SKO OG (RM-1965)

NO MBRE
CONSTITUYENTES
CONC. DEL STOC K g/l
VO L. STOC K PARA 1 lt DE MEDIO m l/l
CONC. FINAL EN EL MEDIO mg/l
A B
NH4 NO3 KNO3 H3BO3 KH2PO4
82.5 95.0 1.24 34.00 0.166 0.050 0.005 88.0 74.0 4.46 1.72 0.005 3.72 2.78 0.08
20 20
1 650 1 900 6.2 170.0
KI Na2MoO4.2H2O Co Cl2.6H2 O
0.83 0.25 0.025
CaCl2.6 H2O MgSO4.4H2O MnSO4.4H2O
440.0 370.0 22.3
Zn SO4.7H2O CuSO4.5H2 O
8.6 0.025
Na2EDTA FeSO4.7H2 O
10
37.2 27.8
TIAMINA-HCl mio-Inositol AGAR o GELRITE
0.4 100 8 g/l
2 g/l
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ME DIO B5 DE GAMBO RG
CO NC . DEL STOC K g/l
V DEL STO CK ml/l
CO NC . FINAL m g/l
MACRO NUTRIENTE S KNO3 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2 O Na2EDTA CaCl2.2 H2O NaH2PO4. H2O (NH4)2 SO4 MICRO NUTRIENTE S MnSO4.H2O H3BO3 Zn SO4.7H2O NaMoO4.2H2 O CuSO4.5H2 O Co Cl2.6H2 O KI VITAMINAS Ac. Nicotnico Piridoxina Tiamina Inositol Sacaro sa Cada stock de sales se prepar a separ adamente. Las vitam inas se preparan en un solo stock y se agregan 2 m l por cada llitro de m edio. 1000.0 300.0 200.0 25.0 2.5 2.5 75.0 mg/40 ml 20.0 20.0 200.0 2 1 1 10 100 mg/l 20 g/l 1 1 1 1 1 1 1 10 3 2 0.250 0.025 0.025 0.750 125.0 12.5 2.78 3.36 15.0 15.0 13.4 20 20 10 10 10 10 10 2 500 250 27.8 33.6 150 150 134
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SO LUC IO N HO AGLAND MAC RO ELEM ENTO S MO LARIDAD SO LUCIO NES S T O CK Ca( NO3)2 K(NO3)2 MgSO4 KH2PO4 FeCl3 1M 1M 1M 1M 1M VO LUMEN A AGRE G AR PARA 1 LT DE MEDIO (ml) 5 5 2 1 1
MIC RO ELEMENTO S
MO LARIDAD SO LUCIO NES S T O CK
VO LUMEN A AGRE G AR PARA 1 LT DE MEDIO (ml)
H3BO3 MnCl2.4H2O ZnCl2 CaCl2.2 H2O Na2MoO4.2H2O
2.86 g/l 1.81 g/l 0.11 g/l 0.05 g/l 0.025 g/l
1 1 1 1 1
Para preparar la solucin de Hoaglan d se lleva esto a 1 lt y luego se aaden 3 lt de agua por cada litro de solucin m adre. Se puede usar citrato frrico en vez de clor uro frrico, se prepara una solucin con 30.4 g/l (5 m g de Fe/ ml) y se aaden 2 ml por lt de solucin m adre. La solucin Fe-EDTA (F) de Murashige y Skoog (1965) puede utilizarse agregando 2 ml/ lt solucin madre.
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ANEXO 2 TRMINO S UTILIZADO S E N CULTIVO DE TEJIDO S VE G ETALES ADVENTIC IO . Desarrollo de una estructur a en p untos de origen inusuales, por ejem plo vstagos o races originados de un callo o embriones que no se forman a partir de cigotes. ANTIBI TICO . Sustancia nat ural, de peso m olecular relativamente bajo, producida por m icroorganismos, inhiben el crecim iento o destruyen a otros organismos. La toxicidad generalm ente es selectiva. PIC E . (shoot tip, stem tip, shoot apex) Comprende el m eristem a y los primordios foliares. ASEPSIA. Sin infeccin o m icroorganismos contaminantes en el cultivo. BIO TE C NO L O GA. Aplicacin de principios cientficos y de in geniera al procesam iento de materiales por agentes biolgico s para producir bienes y servicio s. C ALLO (C ALLUS). Un tejido constituido por clulas dediferenciadas generalm ente producido como resultado de heridas o al cultivar un explante in vitro. CE PA C ELULAR. Una cepa celular se deriva ya sea de un cultivo primario o de una lnea celular por la seleccin o clonaje de clulas que tienen propiedades o marcadores especficos. Al describir una cepa celular, deben definir se sus caractersticas especficas. CL N. Grupo de organism os genticamente idnticos producido por proceso asex ual o sexualmente por autopolinizacin (inbreeding) de lneas puras. En cultivo de clulas procariticas o eucariticas, el trm ino cln es em pleado para describir un a poblacin de clulas descen dientes de un solo pro genitor. En biolo ga m olecular se utiliza para copias m ltiples de secuencias idnticas de DNA que son pro ducidos cuando son insertados dentro de un vehculo como un plsmido u otros vectores. C RECIMIENTO . Aum ento irreversible en el tamao, volum en o longitud, el cual generalm ente es acompaado por un increm ento en peso seco y en la cantidad de protoplasma. Generalmente el crecim iento incluye divisin y alargamiento celular. C ULTIVO DE TEJIDO S VEG ETALES. Mantenimiento o crecimiento de clulas vegetales, tejidos, r ganos o plantas com pletas in vitro. El cultivo de tejido s vegetales son una serie de mtodos que se utilizan en la m ultiplicacin y mejoramiento de plantas y actualmente se emplean para hacer estudios fisiol gicos, bio qum icos, de m orfognesis, anatoma, etc. C ULTIVO DE CLULAS . Este trmino es usado para denotar el crecim iento de clulas in vitro incluyen do el cultivo de clulas aisladas. En los cultivos celulares, las clulas ya no estn organizadas en tejidos. C ULTIVO DE RGANO S. Es el mantenimiento o crecimiento de primordio s de rgano o del total o partes de un rgano in vitro de tal m odo que p ueda permitir la diferenciacin y preservacin de su arquitectura y funcin.
C ULTIVO AXNICO . Es un cultivo sin form as de vida forneas in deseables. Un cultivo axnico puede incluir el cocultivo de diferentes form as celulares, tejidos u organism os, con fines especfico s. DE S INFEC TANTE. Un agente qumico o fsico que elim ina la infeccin de una planta, rgano o tejido. DIFERENC IAC I N. Es la transform acin de clulas ap arentem ente genticam ente idnticas todas originadas del cigote u otra clula nica, en clulas diver sificadas con varias esp ecializaciones bio qum icas, fisiol gicas y estructurales. Es la suma de procesos por los cuales se adquiere o se pier den competencias metablicas especficas y se distinguen las clulas hijas entre s o de su clula progenitora. Dif erenciacin celular es la prdida progresiva de los caracteres citolgico s y fisiolgicos de las clulas embrionarias y adquisicin de las caractersticas de clulas adultas, eventualmente ligada a la especializacin. DEDIFERENCIAC I N C ELULAR. Regresin pro gresiva de clulas diferenciadas hacia el estado meristemtico. Las clulas desdiferenciadas, al igual que las clulas m eristem ticas, presentan ciertas caractersticas citolgicas de las clulas embrionar ias, tales com o: vacuom a reducido, relacin ncleo/citoplasma elevada, plastidios poco diferenciados. Estas clulas reco bran la aptitud para dividirse y pueden ser capaces de expresar su totipotencia rediferencindo se para pro ducir em briones y rganos. DIFERENC IADO . Clulas que m antienen en cultivo todo o m ucha de la estructura especializada y funcin tpica del tipo celular in vivo DE S ARRO LLO . Denota los cambios pro gresivos en tam ao, estructura, y funcin, los cuales co lectivam ente comprenden la transform acin de un cigte en una planta madura reproductiva. Se suele h ablar del desarrollo de rganos particular es a partir de estruct uras iniciales o primordios. Puede decir se que el desarrollo es un proceso gr adual que tom a tiempo para lograrse com pletam ente, generalm ente est acompaado por increm entos en peso y tamao, involucra la apar icin de n uevas estructuras y fun ciones y la pr dida de las originarias, se caracteriza por discontinuidades tem porales y espaciales y cam bios en la velocidad, y eventualm ente disminucin de la velocidad o detencin cuando se alcanzan las dim ensiones maduras. El desarrollo involucra tanto crecim iento como diferenciacin. El crecimiento es utilizado par a denotar los cam bio s cuantitativos que ocurren durante el desarrollo. La diferenciacin se aplica a lo cambios cualitativos. EMB RIO GNESIS . Proceso de iniciacin y desarrollo del em brin. E m briognesis somtica. Proceso de iniciacin y desarrollo del em brin a partir de clulas vegetativas o no gamticas. ENZIMA. Protena capaz de catalizar una reaccin. Es una sustancia, la cual en cantidades m nim as promueve el cam bio qum ico sin que ella mism a sea usada en la reaccin, en virtud de su po der par a increm entar la reactividad de una o unas sustancia(s) especfica(s) llam ada sustrato. EPIG E NTICO (EVENTO). Cualquier cam bio en el fenotipo que no resulta de una alteracin en la secuencia de DNA. Este cam bio puede ser estable y her edable e in cluye la
alteracin en la metilacin del DNA, activacin transcripcional, control traduccional y m odificaciones post-traduccionales. ETAPA I. Paso de la propagacin de p lantas in vitro, caracterizado por el establecimiento de un cultivo asptico. ETAPA II. Paso de la propagacin de p lantas in vitro, caracterizado por el aum ento rpido en el n m ero de r ganos u otras estructuras. ETAPA III. Paso de la propagacin de plantas in vitro, caracterizado por la preparacin del propgulo para su transferencia al suelo; proceso que com prende el enraizam iento de los vstagos, el endurecimiento de las plantas y la iniciacin del cam bio del estado heterotrfico al estado auttrofo. ETAPA IV. Paso de la propagacin de plantas in vitro, caracterizado por el establecimiento en el suelo de una planta derivada del cultivo de tejidos. EXPLANTE. Pequeo segmento escin dido de la planta (pice, rgano, fragm ento de rgano o de tejido), usado par a el inicio de un cultivo in vitro. FRIABILIDAD. Trmino que indica la ten dencia a separarse unas de otras en las clulas vegetales es cultivo. G AM ETO C L N. Plantas regeneradas de cultivos celulares derivados de meiosporas, gametos o gametofitos. G ERMO PLASMA. Variabilidad gentica total presente en una especie cultivada y sus especies silvestres. H ABITUAC I N: La habilidad adquirida por una poblacin de clulas, de crecer y dividir se indepen dientem ente del suministro de reguladores de crecimiento exgenos. H IPERH IDRIC IDAD: Anorm alidades anatmicas y morfolgicas de los tejidos cultivados in vitro que les dan un aspecto vidrio so o traslcido, y originadas por una acum ulacin inusual de agua en el apoplasto. Anteriorm ente a esta anorm alidad se le denom inaba vitrificacin. HO RMO NA VE G ETAL (FIT O HO RMO NA). Sustancia or gnica que no es un nutriente (una sustancia que sum inistra carbono y energa o elementos m inerales esenciales), activa en cantidades muy pequeas (< 1 m M, a m enudo < 1 mM), la cual se forma en ciertas zonas de la planta y que usualmente es transportado a otros sitios, donde evoca respuestas bio qumicas, fisio lgicas y morfolgicas especf icas. Las horm onas vegetales son activas en los tejidos donde son producidas as com o a distancia. Las horm onas vegetales, promueven, inhiben o m odifican el crecim iento y desarrollo. Las clases ms comnmente conocidas de horm onas son las auxinas, giberelinas, citoquin inas, el cido abscsico y el etileno. INDUCC I N. Iniciacin de una estruct ura, rgano, o proceso in vitro. IN SITU . en su lugar de origen (latn).
IN VIVO . proceso que ocurre en un or ganismo viviente intacto. IN VITRO . Cultivo de parte de un organismo o m icroorganism os en v idrio. Por ejem plo: en tubos de ensayo o en frascos, en un m edio artificial y bajo condiciones aspticas. JUVENILIDAD. Los ciclo s de vida de muchas especies perennes incluyen dos fases en las cuales ciertas caractersticas morfolgicas y fisiolgicas son diferentes. Desp us de la germinacin, la m ayora de las plntulas perennes entran a una fase de crecim iento rpido en la cual usualm ente la floracin no puede ser in ducida. Una m orfologa caracterstica, evidente especialmente en la forma de las hojas, se produce a veces durante este tiempo. Las p lantas que tienen estas caractersticas se dice que estn en fase juvenil, en oposicin a la fase m adura o adulta. LIBRE DE VIRUS . Planta libre de vir us especficos, esta denominacin se basa en la aplicacin de tests diseados par a detectar la presencia de dichos or ganism os. LINEA CELULAR. Una lnea celular sur ge de un cultivo prim ario en el m om ento del primer subcultivo exitoso. El trm ino lnea celular implica que los cultivos de ella consisten de linajes celulares originalmente presentes en el cultivo prim ario. M ERISTEMO IDE. conjunto de clulas par ecidas a las del m eristem a que se encuentran en una zona de la planta que no es la usual ( generalm ente en un callo) y tienen la capacidad potencial de originar prim ordios. M ERISTEMA. Extrem o distal del tallo o de la raz. Tejido de clulas indiferenciadas, las cuales se dividen continuamente y se diferen cian en tejidos especializado s. El tejido m eristem tico es pues un tejido em brional del que se form a otros tejido s adultos y diferenciados de diversas m aneras. El cultivo de meristemas forma una especialidad en la propagacin in vitro. MIC RO PRO PAGACI N. propagacin clon al in vitro de plantas a partir de p ices de vstago o explantes nodales, usualm ente con una proliferacin acelerada de vstago s durante lo s subcultivos. MO RFO GNESIS . Es la integracin y coordinacin de lo s eventos de crecim iento y diferenciacin que ocurren e nivel celular y es el proceso que explica el origen de los caracteres morfolgicos y la forma global. MIC RO PRO PAGACI N. Propagacin clonal in vitro de plantas a partir de pices de vstago o explantes nodales, usualmente con una proliferacin acelerada de vstagos durante los subcultivos. ( Definicin de The Society for In Vitro Biolo gy (http://sivb.or g/edu_term inology.asp) NUTRIENTE. Elem ento o com puesto necesario para la supervivencia de un organismo, provee energa y material de crecim iento. Los nutrientes se clasifican en macronutrientes y micronutrientes. RG ANO . Parte m ulticelular de un animal o planta el cual forma una unidad estructural y funcional. Ej. hoja, raz, etc.
O RG ANO G NESIS . En cultivo de tejido s vegetales, un proceso de dif erenciacin por el cual se forman rganos de la planta de novo o de estruct uras pre-ex istentes. En la biolo ga del desarrollo, este trmino se refiere a la diferenciacin de un sistem a de rganos desde clulas precursoras. PAT G ENO . Microorganismo que causa enfermedad. PRO TO PLASTO . Son clulas vegetales en las cuales la p ared celular ha sido eliminada completamente por mtodos fsicos o qum ico s. Fusin de protoplastos . tcnica por la cual los protoplastos son fusionados en una sola clula. PRIMO RDIO . Estado todava rudimentario de un rgano que empieza a form arse. PRO PAGAC I N VEG ETATIVA. Reproduccin de planta usando proceso s no sexuales que involucran el cultivo de partes de la planta como cortes de tallo u hojas. RE C ULTIVO . Proceso por el cual un explante o tejido vegetal, m onocapa celular, etc. es transferido a un m edio fresco sin ser subdividido. RE G ENERACI N. En cultivos de plantas, es una resp uesta m orfogentica a un estm ulo que resulta en la pro duccin de r ganos, embriones, o plantas com pletas. SENESC ENCIA. Se refiere a los procesos de deterioro colectivo y progresivo que culminan en la m uerte de un rgano u or ganism o. SUBCULTIVO . Es el proceso por el cual el tejido o explante es primero subdiv idido y luego transferido a m edio de cultivo fresco. TEJIDO . Trama celular, de m uchos tipos, de los cuales estn hechos los organismos. Cada tipo de tejido consiste generalmente de clulas del m ism o tipo (que llevan a cabo la m ism a funcin), agr upadas en gran cantidad con un arreglo caracterstico. TO TIPO TENC IA. Un a caracterstica celular en la cual se retiene el potencial para formar todos los tipos celulares de un or ganism o adulto. VARIAC I N SO MACLO NAL. Las plantas regener adas de clulas somticas utilizando cultivo de tejido s no son genticamente uniform es sino que presentan una significativa variabilidad gen tica. Esta variabilidad ha sido llam ada v ariacin somaclonal. VARIANTE. In dividuo que presenta caracteres fenotpicos o genotpicos, hereditarios o no, diferentes a lo s restantes individuos del cln al que pertenecen. Variacin no prejuzga la naturaleza a diferencia de mutacin. VIRUS. Parsito obligado, sub-m icroscpico con stituido de cido nucleico (DNA RNA) y protena. Usualm ente m anifiesta su presencia causando enferm edad. S on incapaces de multiplicar se f uera del tejido hospedero.
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YEMA. Rudimento de un vstago, que se form a habitualm ente en la axila de las hojas y suele estar protegida por una serie de catfilo s. Este tipo de yem a se llama axilar, para diferenciarla de la yema term inal del vstago, constituida por el punto vegetativo y por las hojitas jvenes m s prximas, que, dotadas de rpido crecimiento, se comban sobre l.
GL O SARIO ADN RECO MBINANTE BIBLIO TE C A DE DNA. Es un conjunto de fragmentos clonados de DNA que en su totalidad representan el genoma com pleto de un or ganismo. BIBLIO TE C A DE cDNA. Secuencias de DNA clonadas deriv adas de la transcripcin reversa de todos los mRNAs de un organism o. cDNA. Es un DNA de cadena simple complem entario a un RNA. CE BADO R ("PRIMER"). Es una secuencia corta (a m enudo de RNA) que se aparea con una hebra de DNA de cadena sencilla y que provee un extremo 3'-OH en el cual la DNA polimerasa inicia la sntesis de una caden a de desoxiribon ucletido. C ISTR N. Un segm ento de DNA que especifica una cadena de polipptido en la sntesis de protena. CL N. Se denomina as a un gran nm ero de clulas o molculas todas idnticas a una molcula ancestral. CL O NAJ E . El clonaje de un fragm ento de DNA perm ite producir cantidades in defin idas del fragm ento. DE S NATURALIZACI N. del DNA o RNA describe la separacin de las dos cadenas de una m olcula duplex de DNA; con frecuencia la separacin de las cadenas se logra por calentam iento. Desnaturalizacin de una protena describe su conversin desde la conformacin fisiolgica a alguna otra conform acin (inactiva). DNA RECO MBINANTE. Conjunto de procedim ientos por los cuales se r econstruyen m olculas de DNA por unin de secuencias de f uentes diferentes. DNA SATLITE. Consiste de muchas repeticiones en serie (idnticas o relacionadas) de una unidad bsica corta repetitiva. "DOWNSTREAM". (corriente abajo). Son las secuencias de DNA que se encuentran despus del p unto de iniciacin de la transcripcin de un gen, la transcripcin usual del m RNA se hace en sentido 5' a 3'. Norm alm ente la transcripcin o curre de izquierda ("upstream") a derecha ("do wnstream"). Identifica secuencias que se encuentran ms all en la direccin de expresin; por ejem plo, la regin co dif icante de un gen est "down stream " desde el co dn de iniciacin.
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ENZIMAS DE RES TRICCI N. Enzimas aisladas principalmente de procariotes, que reconocen secuencias cortas especficas dentro de la doble cadena de DNA y clivan la do ble cadena. EX N. Cualquier segm ento de un gen interrumpido por intrones, que est representado en el producto del RNA maduro. INTR N. Una secuencia de n ucletidos de un gen eucaritico que no aparece como m RNA. Los intrones interrumpen las secuen cias co dificantes (exones). Segmentos de DNA que se transcriben pero son removidos del interior del trnscrito empalm ando las secuencias (exones) que estn a cada lado de l. G EN. Es el segm ento de DNA que est involucrado en la produccin de un a cadena de polipptido y al cual se le asigna una f uncin. Incluye las regiones que preceden y siguen la regin codificante as com o las secuen cias intervinientes (intrones) entre los segmentos individuales (exones). G EN Q UIM RICO. Genes com puestos de promotores de un origen, y secuencias codificantes de otro y secuen cias 3' de un tercer organismo. H BRIDO . Un organism o o clula com o resultado de un cruce o fusin de dos padres o clulas genticam ente diferentes. ING ENIERA G ENTICA. Alteracin del material hereditario de un or ganismo por tcnicas de DNA recom binante de modo que se lleven a cabo f unciones especf icas. El producto obtenido al aplicar procedim ientos para reconstruir m olculas de DNA por unin de secuencias de f uentes difer entes se llama DNA recom binante, y las tcnicas son llamadas ingeniera gentica. kb. Es una abreviatura para 1000 pares de bases de DNA o 1000 bases de RNA. LOC US . Es la po sicin de un crom osoma en el cual reside el gen para una caracterstica particular; un locus puede estar ocupado por cualquiera de los alelo s del gen. MARCADO R G E NTICO . Trm ino utilizado para denominar genes de inters. MARCO DE LEC TURA ABIERTO . ("open reading frame"). Secuencia de nucletidos en el DNA donde no se encuentran codones de term inacin de la transcripcin, donde los tripletes sucesivo s de n ucletidos pueden ser ledas como codones que especifican aminocidos. S ecuencia (potencialm ente) traducible a protena. MAPA DE RES TRICC I N. Es un un "m apa" que r epresenta el arreglo lineal de sitios de corte de varias enzimas de restriccin so bre una cadena de DNA. MAPE O GENTIC O . Demarcacin de la po sicin de un gen a lo largo de una cadena de DNA o de un crom osoma. MUTAC I N. es el cambio en la secuencia del ADN. El organism o que lleva el gen alterado se llama mutante.
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NO RT H ERN "BLO T". Es una tcnica para transferir RNA desde un gel de agaro sa a una m atriz slida en el cual p uede se hibr idizado con un DNA com plementario. PAR DE BASES (bp). es una asociacin de A con T o de C con G en una do ble hlice de DNA; otros pares son posibles en el RNA bajo ciertas circunstancias. PCR. (Reaccin en cadena de la polim erasa). Es la m ultiplicacin de un fragm ento de DNA a partir de un par de cebadores o "primers" (oligonucletido) en ciclos r epetidos por accin de una DNA polimerasa termoestable llam ada Taq polim erasa. Representa una forma de clonaje molecular sin clulas. PLSMIDO . Es un DNA circular extra cromosm ico autnom o y autorreplicativo. PRO MO T O R. Es una regin del DNA involucrada en la un in de la RNA polimerasa para iniciar la transcripcin, por lo cual representa un punto crtico en el control de la expresin gentica. REPETICIO NES DIRE C TAS. Secuencias de DNA idnticas o estrecham ente relacionadas presentes en dos o ms copias en la misma orientacin en la m ism a m olcula: Ejem plo: 5' AGTCA.................AGTCA 3' 3' TCAGT.................TCAGT 5' RFLP. (" Restriction Fragment Lenght Polymorphisms"). Se ref iere a las diferencias en el DNA que alteran los sitios de r estriccin de enzimas. Por ejem plo, el cam bio de bases en el sitio diana de una enzima de r estriccin causa que al hacer el clivaje de esta cadena de DNA con dicha enzima, los fragm entos resultantes tengan diferentes tamaos, lo cual puede evidenciar se al separar dicho s fragmentos en un gel. RAPD. (" Ran dom Amplified Polym orphic DNA"). Amplificacin al azar de segmentos de DNA mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (P CR) con cebadores de secuencias ar bitrarias de nucletido s. REPETICIO NES INVERS AS . Comprende dos copias de la misma secuencia de DNA repetidas en orientacin opuesta en la m ism a m olcula. Las repeticiones adyacentes invertidas con stituyen un palndrom e. SECUENCIA CO NSENSO . Es una secuencia idealizada en la cual cada posicin representa la base encontrada m s frecuentem ente cuando se com paran muchas secuencias reales. TERMINADO R. Es una secuencia de DNA, que le in dica a la RNA polim erasa la terminacin de la transcripcin. TRANSC RIPTASA REVERSA. Una enzim a que sintetiza DNA usan do RNA como templado. Las tecnologas de DNA r ecom binante la utilizan para la sntesis de DNA complem entario (cDNA) a partir de mRNA.
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SO UTH ERN (Transferencia por el m todo Southern, "S o uthern blot"). Describe el procedim iento para transferir DNA desde un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa, donde puede ser hibridizado con un cido nuclico complem entario. TRANSFO RMACI N. En cultivos celulares de plantas, la introduccin e integracin genm ica estable de DNA forneo en una clula vegetal por algn m edio, resultando en una m odificacin gentica. TRANSG NICO . Son todos aquello s organismos superiores que han sido modificados genticam ente por ingeniera gen tica. TRANSPOS N. (elem ento transponible). Segmento discreto de DNA que es capaz de replicarse o escin dirse e in sertarse en una nueva posicin del genoma. (segmentos de DNA que tienen la capacidad de cam biar su posicin en el genoma). "UPS TREAM" (corriente arriba). S on las secuencias de DNA que se encuentran antes del punto de iniciacin de la transcripcin de un gen, la transcr ipcin usual del m RNA se hace en sentido 5' a 3'. I dentifica secuencia que se encuentran en direccin opuesta a al expresin. "WESTERN B LO T". Tcnica anloga al Southern, la cual luego de la separacin de protenas por electroforesis en un gel, las transfiere a una m atriz donde son inmobilizadas, y luego son visualizadas utilizando sondas inm unolgicas marcadas con radioactividad o fluorescencia.
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ANEXO N 3
TRADUCC I O N DE ALG UNO S TERMINO S USADO S EN LA BIB LIO GRAFIA SO BRE C ULTIVO IN VITRO
Axilar Blade Bud Branches Glasshouse Culture Clean Cut Check Container Culture m edia Dispense Dip Develop Embryo Excised Explant Field Fresh Flask Growth Glass Gr eenhouse Hood Harden Leaf Leaflet Labware Tissue culture W ash
axilar Measurem ent medida lmina u hojilla Main principal yema Mature maduro ramas Night noche invernadero Nodal (node) nudo cultivo Output produccin lim piar, limpio Overgrown sobrecrecimiento cortar Only solamente verificar Plants plantas depsito Planting transplantar m edio de cultivo Placed colocar distribuir Pot maceta sumergir Plasticware material de plstico desarrollo Petri dish placa de Petri em brin Primordium (dia) primordio(s) seccionar Root raz explante Rot pudricin campo Rinse enjuagar fresco Supply sum inistro frasco Surface superficie crecer S hoot vstago vidrio, cristal S tem tallo invernadero Set conjunto campana S h ipm ent enviar dureza Seedlin g plntula hoja de la planta Seed sem illa fololo Size tam ao m aterial de laboratorio Shaker agitador cultivo de tejidos lavar
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Papa
Crisantemos
Papa
GUIA DE INFORMES CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
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GUA DE INFORME PRCTICA N2
Induccin de embriognesis somtica

1. Realice observacion es de lo s cultivos en el micro scopio estereoscpico cada 2 sem anas y lleve a cabo un registro, de acuer do a las indicaciones que encontrar a contin uacin: a. Evale la magnitud del cr ecimiento mediante una escala cualitativa y rellen e el cuadro siguiente:
SE M ANA 2 4 6
MEDIO 1
MEDIO 2
MEDIO 1 (sin hormonas) 8 10 12 14
MEDIO 2 (sin hormonas)
Escala a utilizar:
0 + ++ +++
= = = =
no crecim iento muy poco crecim iento crecim iento intermedio m ucho crecim iento
b. Cada dos sem anas, tome nota de las siguientes caractersticas de lo s cultivos: b1. Color acin b2. Presencia de tran sformaciones hiperhdricas b3. Presencia de p seudotalos b4. Consistencia del callo (fr iable o com pacto) b5. Presencia de embrion es somticos: b5.1. Describir m orfolgicamente lo s embr iones b5.2. Contar el n mero de embrion es por explante
NOTA: Preste atencin al tiem po de cultivo en el cual se comenzaron a observar los embrion es somticos. 3. Elabore un esquem a del proceso de embrio gnesis som tica in directa observada, indicando y describien do brevem ente cada fase del mismo. Indique tam bin la secuencia temporal de lo s eventos descritos. 4. Explique la inf luencia de las horm onas vegetales en el proceso de em brio gn esis somtica in directa.
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GUA DE INFORME PRCTICA N 3
Organognesis
1. Realice observacion es de los cultivo s de callo de tabaco en el microscopio estereo scpico cada 2 sem anas y lleve a cabo un registro, de acuer do a las
indicaciones que encontrar a continuacin : a. Evale la magnit ud del crecimiento del callo mediante una escala cualitativa. b. Cam bio s m orfolgicos en el callo: Consistencia (friable o com pacta), coloracin, presencia de pseudotalo s, presen cia hiperhdricas. c. Presencia y cantidad de brotes y/o races. En este caso anote aparte sus caractersticas morfolgicas. Para facilitar el registro de las o bservaciones en la tabla, utilice las abr eviat uras siguientes: Cuantifique el crecim iento desde 0 h asta +++ TH = presencia de transform acin hiperhdrica CF = callo friable, CC = callo compacto (no friable) V = color ver de, M = color crem a PT = presencia de p seudotalo s B = presencia de brotes, ( ) indicar entre par ntesis la cantidad R = presencia de r aces, ( ) in dicar entre parntesis la cantidad Ta bla 1. Cultivo de callo de tabaco S EMANA M EDIO 1 (control) 2 4 6 8 10 12 14 MEDIO 3 MEDIO 4 MEDIO 5 de transform aciones
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2. Relacione la com posicin de los medios de cultivo con las r espuestas observadas en los tejido s. Compare los resultados con los reportados por S koog y Miller ( ). 3. Realice o bservaciones de los cultivos de secciones de hoja de Begonia en el microscopio estereoscpico cada 2 sem anas, y lleve a cabo un registro en la tabla que se suministra a continuacin. Destaque el tiempo de aparicin de los brotes, el nmero de brotes por explante y sus caractersticas morfol gicas.
Ta bla 2. Cultivo de secciones de hoja de Begonia
SEMANA 2 4 6 8 10 12 14
OBSERVACIO NES
4. So bre la base de lo s resultados observado s en la tabla 2, describa la secuencia de fases en el proceso de or gano gn esis directa. 5. Complete la siguiente tabla con los valores de peso fresco y p eso seco determinados durante la prctica:
Ta bla 3. Peso fresco (PF) y peso seco (PS) de los callos de tabaco crecidos en diferentes medios de cultivo. SEMANA 1 1 2 3 4 5 6 Medio 1 Medio 3 Medio 4 Medio 5
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6. Con lo s datos de la Tabla 3 elabore un grf ico par a cada parm etro (PF, P S ) y en cada uno dibuje las curvas de cr ecim iento para cada medio de cultivo. 7. Interprete el gr fico elabor ado en el p unto 6 y com pare el efecto de la com posicin de los medios de cultivo sobr e el crecim iento de los cultivos. 8. Cul de los p arm etros m edidos considera usted m s aprop iado para evaluar el crecim iento de lo s tejido s?. Considera usted que lo s m todo s utilizados son igualm ente apropiado s para estim ar el crecimiento en otros sistem as de cultivo in vitro (cultivo s en susp ensin, em br iones cigticos, microesquejes, races, etc.)?
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GUIA DE INFORME PRCTICA N 6. Extraccin de protenas en tejidos vegetales cultivados in vitro .

1. Durante la realizacin de la prctica, com plete el siguiente cuadro con sus dato s. Muestra D.O . g de Protena en 100 l Volumen de sobrenadante (ml) Protenas Totales en la muestra (g) Volumen de acetona para precipitar (ml)
2. Co loque lo s v alores calculados en la pr ctica, protena total por m uestra, volumen de resuspensin de las protenas, y el vo lum en de car ga en el gel: Muestra g de protena total en la muestra Volumen de Resuspensin (l) Volumen de C arga (l)
NO TA: recuerde tomar nota del or den en el cual carg los estndares de peso m olecular y las m uestras en el gel.
3. Anexe a este inform e una fotocopia de la foto del gel obtenido en la prctica, y seale en dicho gel lo siguiente: a. Al lado de cada ban da correspon diente a los estndares de peso molecular, indique su peso.
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b. En la parte superior de cada carril del gel, in dique el nom br e de la muestra correspon diente, puede asignarle un n mero o letra a cada m uestra, y h acer una leyen da en la cual se defina que significa cada n m ero o letra. 4. Una vez r ealizada la electroforesis y teido el gel, mida la m ovilidad relativa de las ban das de estndares de peso m olecular y elabore un grf ico en papel semilo g, en el cual el eje Y (en escala no lo gar tmica) sea la m ovilidad r elativa en centmetros (distancia desde el or igen del gel hasta el centro de la ban da), y el eje X (escala logartmica) sea el peso molecular cono cido de la proten a. Este grfico sirve p ara estimar el peso m olecular de un a protena de acuer do a su m ovilidad relativa en un gel. 5. Observe las ban das en el gel y compare los patrones obtenido s con los dif erentes tejido s, o bserv e dif erencias respecto a presen cia y ausen cia de ban das y tam bin dif erencias en intensidad de las ban das. 6. Calcule el peso m olecular de las bandas predominantes utilizan do par a ello la ecuacin de la grfica elaborada en la seccin 4 de esta gua. 7. Responda las siguientes preguntas: a. Tomando en cuenta las condiciones de extraccin y sep aracin electrofortica de protenas utilizadas en esta prctica, Qu propiedades inf luyen en la movilidad de las protenas durante la electroforesis en geles de poliacrilam ida? b. Explique algunas aplicaciones de los mtodo s de protenas en estudios de cultivos de tejidos v egetales. c. Qu ventajas y desventajas tiene la utilizacin de patrones de protenas e isoenzimas en estudio s de clasificacin de v ariedades de plantas?
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GUIA DE INFORME PRCTICA N 7 Extraccin de A DN vegetal

EXPERIMENTO 3.2. 1) Anexe una fotocopia de la fotograf a del gel de agarosa luego de la corrida electrofortica, y se ale los siguientes aspectos: a- Identifique cada carril del gel. b- El peso m olecular (p b) de las ban das del marcador de peso molecular utilizado c- El peso molecular (p b) aprox imado del ADN extrado. 2) Discuta so br e la cantidad de ADN genmico en plantas superior es. 3) Discuta acerca de la integridad y p ureza del ADN extrado y relacion e lo o bservado con el paso o) del protocolo, exper imento 3.1. 4) Cm o podra Ud. calcular la concentracin aproximada de ADN en el extracto utilizando slo la corrida electrofortica? 5) Qu propiedades influyen en la movilidad de los cidos n ucleico s en la electroforesis en geles de agarosa? 1) Complete la siguiente tabla. Muestra DO 260 DO 280 C oncentracin ( g/m l)
2) Calcule la concentracin de ADN en la muestra con las m edidas o btenidas en el espectrofotmetro. 3) Discuta so br e la p ur eza de la pr eparacin. 4) Explique brev em ente alguno s de los m todos que Ud. conoce para analizar el ADN vegetal una vez que se ha r ealizado la extraccin y purificacin del m ism o.
Page 57

Guia Cultivo de Tej Veg II 2012

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PRC TIC A (35 %)

Cada parcial= 17% Seminario terico= 14%

Inform es= 15% Proyecto= 20%

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AIA (I AA) ABA ANA (NAA)

BA BAP 2,4-D GA3 IBA K MS

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PRCTICA N1 Preparacin de medios de cultivo. Condiciones de asepsia.

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PRCTICA N 6 Extraccin de protenas en tejidos vegetales cultivados in vitro

se o bten ga un pro ducto coloreado.

El pro ducto coloreado se deposita en el gel,

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Gel Separador (14%) 4.67 m l 3.76 m l 1.46 m l 50 l 10 l 50 l

Gel C oncentrador (5%) 0.84 ml 0.63 ml 3.48 ml 25 l 5 l 25 l

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PRCTICA N 7 Extraccin de A DN vegetal

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0,5 M pH 8.0 1.0 M

Volum en final 100 ml

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ANEXO N1. FORMULACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO

ME DIO DE MURASH IGE Y SKO OG (RM-1965)

CONC. DEL STOC K g/l

VO L. STOC K PARA 1 lt DE MEDIO m l/l

CONC. FINAL EN EL MEDIO mg/l

NH4 NO3 KNO3 H3BO3 KH2PO4

1 650 1 900 6.2 170.0

0.83 0.25 0.025

CaCl2.6 H2O MgSO4.4H2O MnSO4.4H2O

440.0 370.0 22.3

TIAMINA-HCl mio-Inositol AGAR o GELRITE

0.4 100 8 g/l

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CO NC . DEL STOC K g/l

V DEL STO CK ml/l

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MO LARIDAD SO LUCIO NES S T O CK

VO LUMEN A AGRE G AR PARA 1 LT DE MEDIO (ml)

H3BO3 MnCl2.4H2O ZnCl2 CaCl2.2 H2O Na2MoO4.2H2O