Mdulo 8. SISTEMA DE MEMBRANAS INTERNAS.

SNTESIS DE PROTENAS
RETCULO ENDOPLSMICO Y RIBOSOMAS Una de las caractersticas ms destacadas de la clula de los eucariotes es un laberinto de membranas internas paralelas que rodean al ncleo y que se extienden a distintas partes del citoplasma. Este complejo de membranas ocupa una buena parte del volumen total del citoplasma en algunas variedades celulares y constan de una serie de lminas estrechamente empacadas y plegadas en forma aplanada, de manera que dan origen a diversos compartimientos dentro del citoplasma. Las cavidades formadas por las lminas de las membranas se denominan cisternas (una palabra derivada del latn que significa reservorio). El componente principal de este complejo membranoso es el retculo endoplsmico (RE). En la mayor parte de las clulas las cisternas del RE parecen estar interconectadas. El RE se contina con la membrana externa de la envoltura nuclear, de manera que el compartimiento formado entre las dos membranas de la envoltura nuclear est conectado con las cisternas del RE. Las membranas de otros organelos no se conectan fsicamente con el RE y parecen formar compartimientos independientes dentro del citoplasma.

Este conjunto de membranas entre las que sobresale el RE recibe el nombre de sistema endomembranoso, o sistema de membranas internas, que incluye adems a la envoltura nuclear y a la membrana plasmtica, al aparato de Golgi, a los lisosomas, peroxisomas y a las vacuolas de las clulas vegetales. El sistema endomembranoso consta de una serie de membranas funcionalmente distintas, que se comunican unas con otras. Algunas se conectan fsicamente; otras mediante vesculas de transporte que se separan de una membrana y se fusionan con otra. Muchos de los compartimientos membranosos surgen del RE y despus avanzan hacia la superficie celular o a otros organelos mediante el complejo de

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Golgi. As, una molcula elaborada en el lumen del RE que est destinada a ser excretada de la clula se desplaza mediante vesculas de transporte a travs de otros compartimientos en el sistema y luego pasa por la membrana plasmtica hacia el exterior de la clula por medio de una vescula secretora. Los compartimientos de las endomembranas pueden considerarse como contrapartes del exterior de la clula. El RE contiene una gran variedad de enzimas que catalizan muchos tipos de reacciones qumicas. En algunos casos las membranas sirven de soporte para los sistemas enzimticos, en tanto que otras enzimas del RE se localizan en las cisternas. Las dos superficies de la membrana (interna y externa) cuentan con distintos grupos de enzimas y representan regiones celulares con diferentes capacidades de sntesis, al igual que en una fbrica hay diferentes reas para hacer distintas partes de un producto en particular. Hay dos tipos de RE: el RE rugoso (RER), que tiene ribosomas en su superficie y por lo tanto en las microfotografas electrnicas ostenta un aspecto rugoso, y el RE liso (REL), que carece de ribosomas, por lo que la superficie externa de su membrana tiene una apariencia lisa. Retculo Endoplsmico Rugoso (RER) La superficie externa de la membrana externa (citoplsmica) del RER est tapizada de partculas oscuras, los ribosomas, que constituyen el mbito fsico donde ocurre la sntesis de las protenas. Los ribosomas se presentan en todos los tipos de clulas, desde una bacteria hasta las complejas clulas vegetales y animales. No todas las protenas se sintetizan en la superficie de las membranas del RER; muchas de ellas se sintetizan en los ribosomas que se encuentran libres en el citoplasma o dentro de los organelos transductores de energa, las mitocondrias y cloroplastos, ya que estos organelos poseen su propio ADN. El RER juega un papel central en la sntesis de las protenas de sus propias membranas y en la sntesis de protenas de otras membranas. Muchas de las protenas que la clula exporta (como las enzimas digestivas o las hormonas proteicas) o aquellas destinadas a otros organelos o a la propia membrana plasmtica se forman en los ribosomas unidos a la membrana del RER. Despus, las protenas son transferidas a otras membranas mediante pequeas vesculas de transporte (pequeos sacos limitados por membranas) que se separan del RER y luego se insertan en la membrana correspondiente. Retculo Endoplsmico Liso (REL) El REL es el principal sitio de metabolismo de los fosfolpidos, esteroles y cidos grasos . Realiza tambin una funcin importante al localizar enzimas desintoxicantes que degradan sustancias qumicas como carcingenos (molculas que causan cncer) y los conviertan en molculas solubles fcilmente excretables por el organismo. Algunas lneas celulares, como las clulas del hgado, que procesan gran parte del colesterol y lpidos del organismo y sirven como uno de los principales sitios de desintoxicacin contienen grandes cantidades de REL. En otras clulas del cuerpo el REL llega a ser un componente menor. En el REL se sintetizan casi todos los lpidos requeridos para la formacin de las membranas, incluidos los fosfolpidos y el colesterol . Los fosfolpidos son sintetizados en la cara externa (citoslica). Si bien se sintetizan tanto fosfatidilcolina como el resto de los fosfolpidos, slo la fosfatidilcolina pasa a la cara interna de la membrana, gracias a un translocador fosfolipdico especfico (una flipasa). Los fosfolpidos de los componentes del sistema interno de membranas son transportados a travs de vesculas de transporte, pero los que corresponden a las membranas de cloroplastos, peroxisomas o mitocondrias necesitan que protenas transportadoras (carriers) especficas (protenas intercambiadoras de fosfolpidos) los trasladen desde el REL hasta la membrana correspondiente. Secuencias de Seal y Ribosomas Enlazados por Membranas Aunque los ribosomas pueden encontrarse libres en el citoplasma o estar unidos a la membrana de RER, no hay diferencias aparentes entre partculas de uno y otro sitio. De hecho, es la protena la que la que determina si el ribosoma donde se sintetiza debe estar libre o unido a la membrana. Las protenas secretadas, por ejemplo, contienen una secuencia de aminocidos, llamada secuencia de seal o

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pptido seal, que suele localizarse en la primera parte del polipptido fabricado por el ribosoma. Si una protena carece de la secuencia de seal, ser sintetizada completamente por los ribosomas libres en el citoplasma. Por el contrario, si un ARNm codifica a una protena secretora, tambin se une al inicio a un ribosoma libre en el citoplasma. La secuencia de seal habitualmente se encuentra en el extremo amino de la cadena polipeptdica, por lo que es lo primero que emerge del ribosoma. Mientras se sintetiza la secuencia de seal el ribosoma permanece en el citosol, pero cuando emerge totalmente del ribosoma es reconocida por un complejo de molculas llamado partcula de reconocimiento de seal (PRS) , la cual se le une y dirige el ribosoma hacia una protena que se encuentra fija en la membrana del RER ( receptor de la PRS) y vecina a uno de los poros que existen en el RER, que se activa cuando el ribosoma se une a la membrana. La PRS est constituida por una molcula de ARN asociada a 6 cadenas polipeptdicas, una de las cuales contendra un sitio para la unin de la secuencia de seal y otro para la unin con el receptor ubicado en la membrana del RER. Una vez ubicado el ribosoma en el RER se reinicia la sntesis de la cadena polipeptdica, que es empujada a travs del poro del RER hacia la cisterna, en donde finalmente ser empacada en vesculas de transporte para su modificacin y secrecin. En algunos casos la secuencia de seal es eliminada de la protena por una peptidasa de seal (localizada en el interior de la membrana del RER) cuando pasa a travs de la membrana del RER; en otros casos contribuye a la formacin de la estructura y funcin de la protena y permanece intacta.

Las protenas secretoras no son las nicas que contienen secuencias de seal y que se sintetizan en los ribosomas del RER. Algunas protenas que son parte integrante de la membrana plasmtica o que se encuentran en otras partes del sistema endomembranoso tambin tienen secuencias de seal. Parece haber seales de alto de transferencia, las cuales hacen que algunas protenas se inserten slo parcialmente en la membrana del RER; estas protenas se "atoran" en la membrana, dejando una porcin en la cisterna del RE y otra en el citoplasma. Es el caso de las protenas que forman parte de la membrana del propio RER. La mayora de las protenas que se sintetizan en el RER son glicosiladas , como consecuencia de la adicin de un oligosacrido preformado, compuesto de 2 molculas de Nacetilglucosamina, 9 manosas y 3 glucosas, que se asocian a la cadena lateral de una de las molculas de asparagina que forman parte de la protena que entra al RER. La unin del oligosacrido a la protena es catalizada por la oligosacariltransferasa, enzima que se encuentra en la cara interna de la membrana del

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RE (esto explicara por qu las protenas citoslicas no son glicosiladas). Durante su estada terminal en el RER, en la mayora de las protenas destinadas a exportarse las 3 glucosas y una manosa son eliminadas. APARATO DE GOLGI: UNA PLANTA PROCESADORA Y EMPACADORA DE PROTENAS El aparato de Golgi fue descripto por vez primera en 1898 por el microscopista italiano Camillo Golgi, quien descubri la manera en que poda teirse especficamente este organelo. En muchas clulas el aparato de Golgi consta de haces de membrana en forma de platos, que pueden distenderse en ciertas partes y forma vesculas o sacos que se llenan con productos celulares. En algunas clulas animales el aparato de Golgi se localiza a un lado del ncleo; en otras clulas vegetales o animales se encuentran varios aparatos de Golgi, que constan de pilas separadas de membranas dispersas en la clula. El aparato de Golgi funciona sobre todo como un aparato procesador, modificador y distribuidor de protenas. Muchas de las protenas secretadas por las clulas, as como las que se integran a la membrana plasmtica y las que son dirigidas a otros organelos del sistema endomembranoso, pasan a travs del aparato de Golgi. Despus que estas protenas son sintetizadas por ribosomas unidos al RER se transportan al aparato de Golgi mediante vesculas de transporte formadas en la membrana del RER. Estas vesculas se fusionan con la membrana del aparato que est ms cerca del ncleo (cisterna cis del Golgi); luego las protenas pasan a travs de la o las cisternas medias del organelo (tambin por medio de vesculas de transporte de membrana) y finalmente salen de la cisterna trans del Golgi tambin en vesculas. Mientras se movilizan a travs del aparato de Golgi, las protenas glicosiladas en el RE se modifican en diversas formas, segn las seales complejas que forman parte de la secuencia de aminocidos de cada cadena polipeptdica.

En algunos casos, los carbohidratos y otras molculas que se agregan a las protenas se utilizan como seales de distribucin, permitiendo al aparato de Golgi dirigir la protena hacia diferentes partes de la clula. El aparato de Golgi de las clulas vegetales tambin produce una gran variedad de polisacridos extracelulares utilizados como componentes de la pared celular, a excepcin de la celulosa, que en las clulas vegetales es producida en el exterior de la membrana plasmtica. Un aspecto importante de sealar es que las protenas no salen del RER si no estn perfectamente plegadas y ensambladas. Las protenas que no estn en condiciones son degradadas en el

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propio RER, que funciona as como un rgano de control de calidad. Otro aspecto interesante es que las protenas residentes del RER llevan una corta seal que las identifica; si son errneamente empacadas en una vescula y dirigidas al Golgi, la seal es reconocida y son enviadas de retorno desde el aparato de Golgi al RER, donde son destruidas. LISOSOMAS En el citoplasma de las clulas animales se hallan dispersos pequeos sacos de enzimas digestivas denominados lisosomas. Las enzimas de estos organelos degradan molculas complejas, incluyendo lpidos, protenas, carbohidratos y cidos nucleicos, originados dentro y fuera de la clula. En los lisosomas se identifican cerca de 40 enzimas diferentes, todas hidrolasas que son activas a pH 5 (proteasas, lipasas, fosfolipasas, glicosidasas, fosfatasas, sulfatasas, nucleasas). Se sintetizan en el RER y son luego modificadas en el aparato de Golgi, en donde se identifican y distribuyen en los lisosomas mediante seales nicas de carbohidratos que se unen a las protenas. El pH del compartimiento lisosomal es logrado por el bombeo de protones por medio de una ATPasa de la membrana. Las protenas que integran la membrana lisosomal son altamente glicosiladas, para evitar ser degradadas por las proteasas del lumen. Existen tres caminos de degradacin en los lisosomas: la endocitosis, que de acuerdo al tamao de las partculas ingeridas puede ser dividida en pinocitosis (vesculas <150 nm) y en fagocitosis (partculas >250 nm) y la autofagia. La pinocitosis es un proceso regular de la mayora de las clulas: mediante una invaginacin de la membrana celular se produce finalmente una pequea vescula conteniendo solutos y lquido extracelular, que constituye un endosoma joven. Parte de las molculas contenidas en este endosoma son recicladas hacia la membrana o el citosol y el resto siguen su ruta, se fusionan con una vescula proveniente del Golgi que contiene hidrolasas y se forma as un endosoma adulto, que finalmente se transformar en un lisosoma.

La fagocitosis es un proceso menos frecuente y generalmente ocurre en clulas especializadas, como los macrfagos y neutrfilos (dos tipos de glbulos blancos sanguneos). En estos casos el proceso es mediado por receptores, siendo los ms conocidos los anticuerpos (protenas denominadas colectivamente inmunoglobulinas), que se unen a la superficie del organismo infeccioso (por ej. una bacteria) y la recubren, dejando una parte de la molcula libre (la seccin Fc). Esta regin es reconocida por receptores Fc especficos que se hallan en la superficie de los macrfagos y neutrfilos, que de esta manera inducen la formacin de pseudopodios que engloban la bacteria, formando un fagosoma. La fusin de este fagosoma con un endosoma adulto generar un lisosoma.

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El tercer tipo de degradacin es la autofagia, mecanismo por el cual algunos organelos (por ej. las mitocondrias del hgado, que tienen una vida media de diez das) son envueltos en un trozo de membrana del RE para constituir cuerpos denominados autofagosomas, que luego de fusionarse con un endosoma adulto se convierten en lisosomas. Si bien no est confirmado, algunas molculas presentes en el citosol podran seguir un camino de degradacin que no implica su incorporacin a vesculas: en este caso ingresaran directamente a los lisosomas o se adheriran a organelos destinados a convertirse en autofagosomas. Cuando una clula muere, la membrana lisosmica se rompe y libera hacia el citoplasma enzimas digestivas, que degradan a la clula en su conjunto. A este sistema de "autodestruccin" se atribuye el rpido deterioro que sufren muchas clulas despus de la muerte. Algunas formas de dao tisular, al igual que acontecimiento propios del envejecimiento, se relacionan con la existencia de lisosomas "con fugas". Se cree que la artritis reumatoide se debe, en parte, a la lesin de las clulas del cartlago provocada por enzimas liberadas de los lisosomas. PROTEASOMAS La mayora de las protenas que se degradan en el citosol de las clulas eucariticas lo hacen a travs de grandes complejos de enzimas proteolticas denominados proteasomas. Un proteasoma consta de un cilindro central formado por proteasas cuyos sitios activos se supone que quedan ubicados hacia el interior de la cmara. Cada extremo del complejo est tapado por otro gran complejo proteico que tiene al menos diez tipos de subunidades proteicas. Estas protenas son las que estn destinadas a unirse a las protenas condenadas a ser digeridas y que luego las dirigen hacia su destruccin en el interior del cilindro, donde las proteasas degradan a las protenas hasta pptidos pequeos que luego son liberados y salen por el otro extremo 1. Cmo hacen los proteasomas para conocer cules protenas celulares deben ser degradadas? Las proteasomas actan nicamente sobre protenas que han sido previamente marcadas para su destruccin mediante la unin covalente de una protena denominada ubiquitina (una pequea protena de slo 76 aminocidos). Hay un conjunto de enzimas especializadas destinadas a etiquetar a las protenas destinadas a ser destruidas unindoles molculas de ubiquitina (varias unidades) en un proceso denominado ubiquitinacin, que deja a las vctimas a merced de los proteasomas, mediante el proceso de reconocimiento que efectan las protenas de la tapa del proteasoma. Uno puede pensar que este drama intracelular es insignificante (excepto, quizs, para la infortunada protena). Pero cientficos de muchos laboratorios estn ahora encontrando que tales mataderos moleculares resultan participantes esenciales en los caminos metablicos que regulan un enorme repertorio de procesos celulares. Una clula tpica en el cuerpo cuenta con alrededor de 30.000 proteasomas. Cuando ellos funcionan mal ya sea que se extralimiten engullendo protenas importantes o fallando en destruir aquellas que estn daadas o impropiamente formadas pueden ocasionar la aparicin de enfermedades.

Ver La Cmara Celular de la Muerte (The Cellular Chamber of Doom. Alfred L. Goldberg, Stephen J. Elledge & J. Wade Harper, Scientific American 284 (1): 56-61, January 2001).
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Si bien los proteasomas no forman parte del sistema de endomembranas, su inclusin en este mdulo obedece a que desempean una funcin similar a la de los lisosomas, pero limitada exclusivamente a la degradacin de las protenas que la clula ha decidido desechar. VACUOLAS Aunque se han identificado lisosomas en la mayor parte de las clulas animales, su presencia en las clulas vegetales es motivo de controversia. Muchas de las funciones que realizan los lisosomas en clulas animales las efectan, en clulas de plantas y hongos, grandes sacos limitados por una membrana sencilla, denominados vacuolas. Aunque a veces los trminos vacuola y vescula suelen usarse como sinnimos, las vacuolas por lo comn son estructuras de mayor tamao, producidas en ocasiones por la fusin de varias vesculas. Ms de la mitad del volumen de una clula vegetal la ocupa una gran vacuola central que contiene nutrientes, sales, pigmentos y productos de desecho. Las plantas carecen de un sistema para desalojar los productos de desecho txico; tales productos se agregan y forman pequeos cristales dentro de la vacuola, los cuales hacen que la vacuola parezca casi "vaca" cuando se la observa con el microscopio electrnico. En las clulas vegetales la vacuola tambin sirve de compartimiento para almacenar compuestos inorgnicos y hasta macromolculas, como las protenas de reserva en las semillas. En las vacuolas tambin se almacenan, como mecanismo de defensa, algunos compuestos nocivos para los depredadores. Finalmente, la vacuola puede funcionar como eficiente compartimiento homeosttico, regulando por ej. el pH celular: si el pH del citosol tiende a disminuir, se produce un flujo de protones hacia el interior de la vacuola. Las vacuolas desempean otras muchas funciones y de hecho se encuentran en algunas clulas animales, sobre todo en los protistas unicelulares. Casi todos los protozoarios presentan vacuolas de alimentos o vacuolas digestivas que contienen nutrientes en digestin. Tambin pueden tener vacuolas contrctiles que desalojan el exceso de agua de la clula. MICROCUERPOS Los microcuerpos son organelos delimitados por una membrana ; contienen una gran variedad de enzimas encargados de diversas reacciones metablicas: en algunas, como en la degradacin de lpidos, se produce perxido de hidrgeno (H2O2), que es una sustancia txica para la clula. RH2 + O2 R + H2O2 El peroxisoma, microcuerpo en donde ocurren estas reacciones, contiene una enzima, la catalasa, que utiliza el perxido de hidrgeno para oxidar otros sustratos, incluidos fenoles, formaldehido y alcohol: RH2 + H2O2 R + 2 H2O Los peroxisomas de las clulas de hgado y rin tienen gran importancia en la desintoxicacin de algunos compuestos como etanol (componente de las bebidas alcohlicas). Las clulas vegetales contienen dos tipos principales de microcuerpos. Una variedad de peroxisoma se encuentra en las hojas e interviene en la fotosntesis en el proceso denominado fotorrespiracin y el otro tipo de microcuerpo es el llamado glioxisoma. Este contiene enzimas que convierten los lpidos, almacenados en la semilla de las plantas, en azcares . Estos azcares son los que utilizan las plantas jvenes como fuente de energa y como un componente para sintetizar otros compuestos. Las clulas animales carecen de glioxisomas y por tanto no pueden convertir lpidos en azcares. SNTESIS DE PROTENAS Las protenas son los productos finales de la mayora de las rutas informativas. Una clula necesita miles de protenas diferentes en cualquier instante. Estas protenas deben sintetizarse en

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respuesta a las necesidades celulares del momento, ser transportadas a la localizacin celular adecuada y degradarse cuando ya ha pasado la necesidad de su presencia. En las clulas eucariticas la sntesis proteica requiere la participacin de ms de 70 protenas ribosmicas diferentes, 20 o ms enzimas para activar los aminocidos precursores, una docena o ms de enzimas auxiliares y otros factores especficos para el inicio, elongacin y terminacin de polipptidos, quizs unas 100 enzimas adicionales para la modificacin de las diferentes clases de protenas y 40 o ms clases de ARN. De este modo han de cooperar casi 300 macromolculas diferentes para sintetizar un polipptido. La sntesis consume hasta el 90% de la energa qumica utilizada por la clula en todas las reacciones biosintticas. Cuando se suman los 20.0000 ribosomas, los 100.000 factores proteicos y enzimas relacionadas y los 200.000 ARNt presentes en una clula bacteriana tpica (con un volumen de 100 nm3) ellos representan ms del 35% del peso celular seco. A pesar de esta gran complejidad, las protenas se fabrican a velocidades vertiginosas. Una cadena polipeptdica completa de 100 residuos se sintetiza en una clula de Escherichia coli a 37C en aproximadamente 5 segundos. SNTESIS PROTEICA Y CDIGO GENTICO Tres descubrimientos importantes en la dcada del 50 prepararon el escenario para el conocimiento que actualmente se posee del proceso de sntesis de protenas. El primero fue tratar de responder a la pregunta en qu lugar se sintetizan las protenas?. Experiencias con aminocidos radioactivos determinaron que se realizaba en una fraccin celular de naturaleza ribonucleoproteica, los ribosomas. El segundo descubrimiento trascendente fue el descubrir que los aminocidos eran activados en presencia de ATP antes de incorporarse al polipptido que estaba por sintetizarse , unindose a una forma de ARN termoestable, el ARNt (cido ribonucleico de transferencia), formando el complejo aminoacil-ARNt, proceso llevado a cabo por enzimas especficas denominadas aminoacil-ARNtsintetasas. El tercer descubrimiento importante tuvo lugar cuando Francis Crick se pregunt de qu modo se traduce el cdigo de cuatro letras representado por las cuatro bases. La respuesta se obtuvo al comprobar que el ARNt traduce la secuencia nucleotdica de un ARNm a la secuencia de aminocidos de un polipptido. El proceso global de sntesis de protenas guiada por el ARNm es conocido como traduccin. Dado que existen tan slo cuatro bases diferentes en el ARNm (A, U, C y G), es obvio que hace falta una combinacin de ellas para poder expresar a los veinte diferentes aminocidos que forman parte de las protenas. Las 4 bases agrupadas de a dos slo pueden dar 16 combinaciones diferentes (4 2), cantidad insuficiente para los 20 aminocidos proteicos. Obviamente, las bases deberan estar combinadas en grupos de a tres, lo que ofrece 64 posibilidades (4 3), ms del triple de las necesarias. Cada triplete de bases o codn representa a un aminocido o indica el final de la cadena. Por otra parte los codones no estn separados, sino que son contiguos, por lo que la secuencia de una protena est definida por una secuencia lineal de codones contiguos. El primer codn de la secuencia establece el marco de lectura, en el que empieza un nuevo codn cada tres residuos nucleotdicos. En este esquema existen tres marcos de lectura posibles para cualquier secuencia de bases que contenga el ARNm (y, obviamente, el ADN):
AAUCCGGACUUACGUUAACGGUACAGUAC (primer marco) AAUCCGGACUUACGUUAACGGUACAGUAC (segundo marco) AAUCCGGACUUACGUUAACGGUACAGUAC (tercer marco)

De acuerdo al primer marco de lectura AAU corresponde al primer aminocido, CCG al segundo y GAC al tercero, que al ser traducido generara la secuencia de aminocidos asparagina-prolina-asprtico; el segundo marco de lectura indica que el primer aminocido es AUC, el segundo CGG y el tercero ACU, con lo que la secuencia inicial de la protena sera isoleucina-arginina-treonina; la traduccin del tercer marco (UCC-GGA-CUU) dara la secuencia serina-glicina-leucina.

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Pero aunque pareca lgico que slo uno de los tres marcos de lectura posibles contena probablemente la informacin requerida para una protena dada 2, quedaba por resolver cules eran las palabras codificantes de tres letras para los diferentes aminocidos. Las experiencias que permitieron conocerlo pasaron por la sntesis de oligonuclotidos monobsicos [poli(U), poli(A), poli(C), poli(G)], con lo que se comprob que un poli(U) produca un polipptido integrado exclusivamente por fenilalanina, que el poli (A) produca polilisina, que el poli (C) produca poliprolina y que el poli (G) produca poliglicina. De donde result que el codn UUU codifica fenilalanina, el AAA lisina, el CCC prolina y el GGG glicina. Con estos y otros mtodos se logr asignar 61 de los 64 codones posibles a los diferentes aminocidos. Los otros tres se identificaron como codones de terminacin de cadena.
Aminocido Acido Asprtico Acido Glutmico Arginina Lisina Asparagina Histidina Glutamina Serina Treonina Alanina Glicina Valina Prolina Leucina Fenilalanina Tirosina Isoleucina Metionina Triptofano Cistena Terminacin Abreviatura (3 letras) Asp Glu Arg Lys Asn His Gln Ser Thr Ala Gly Val Pro Leu Phe Tyr Ile Met Trp Cys Abreviatura (1letra) D E R K N H Q S T A G V P L F Y I M W C Codones GAC GAU GAA GAG CGA CGC CGG CGU AGA AGG AAA AAG AAC AAU CAC CAU CAA CAG UCA UCC UCG UCU AGC AGU ACA ACC ACG ACU GCA GCC GCG GCU GGA GGC GGG GGU GUA GUC GUG GUU CCA CCC CCG CCU CUA CUC CUG CUU UUA UUG UUC UUU UAC UAU AUA AUC AUU AUG UGG UGC UGU UAA UAG UGA

Varios codones tienen funciones especiales. El codn de inicio AUG seala el principio de las cadenas polipeptdicas, tanto en procariotas como en eucariotas, pero tambin es el codn que codifica Metionina en posiciones internas en los pptidos . De los 64 codones posibles, tres de ellos (UAA, UAG y UGA) no codifican para ningn aminocido, sino que son codones de terminacin (stop). Cuando en un marco de lectura hay un codn de terminacin por cada 50 o ms codones, se dice que es un marco de lectura abierto. Un gen no interrumpido que codifique una protena con una masa molecular tpica de 60 kDa (alrededor de 500 aminocidos) requerira un marco de lectura abierto de 500 o ms codones. Quizs el rasgo ms notorio del cdigo es que es degenerado, es decir que un aminocido puede resultar especificado por ms de un codn. Como puede verse en el cuadro, los aminocidos Leucina, Serina y Arginina estn representados por 6 codones, en tanto que Valina, Prolina, Treonina, Alanina y Glicina poseen 4 codones; Isoleucina es la nica que tiene 3 codones, en tanto que con 2 codones figuran Fenilalanina, Tirosina, Histidina, Glutamina, Asparagina, Lisina, Asprtico, Glutmico y Cistena; Metionina y Triptofano se identifican por un solo codn y existen 3 codones que indican el fin de la secuencia. Si se observa con atencin el cuadro, puede comprobarse que cuando un aminocido tiene mltiples codones, la diferencia generalmente se encuentra en la tercera base (en el extremo 3), por lo que las dos primeras letras de cada codn son, por lo tanto, determinantes de especificidad. Esto quizs requiere un anlisis ms detallado.
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Una vez establecido el marco de lectura, los codones se traducen ordenadamente sin solapamiento ni puntuacin hasta que se encuentra un codn de terminacin. Los otros dos marcos de lectura posibles dentro de un gen normalmente no contienen informacin gentica til, pero hay excepciones. En algunos virus la misma secuencia produce dos protenas distintas al utilizar diferentes marcos de lectura.

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(a) En la tabla puede verse que 5 aminocidos (Thr, Ala, Gly, Val y Pro) estn representados por cuatro codones, en los cuales las dos primeras bases son iguales ( AC en Thr, GC en Ala, GG en Gly, GU en Val y CC en Pro); la tercera base es irrelevante. (b) Tres aminocidos (Arg, Ser y Leu) tienen 6 codones, de los cuales 4 responden al mismo esquema anterior: CG en Arg, UC en Ser y CU en Leu. Sin embargo, los otros dos podran dar lugar a confusin si no se tiene en cuenta la tercera base: as, tanto en Arg como en Ser hay dos codones que empiezan con AG, pero en este caso la tercera base es de tipo purnico en Arg (AG A y AGG), en tanto que en Ser es de tipo piperidnico (AG C y AGU). Es decir que cuando dos aminocidos diferentes comparten las mismas dos bases iniciales, se diferencian porque la tercera base es purnica o pirimdica (es decir que lo que priva es el tamao molecular, que es mayor en las bases pricas que en las pirimdicas). Los ARNt reconocen codones mediante apareamiento de bases entre el codn del ARNm y una secuencia de tres bases de ARNt denominada anticodn. Los dos ARN se aparean de forma antiparalela, aparendose la primera base del codn (siempre leda en direccin 5 3) con la tercera base del anticodn. An cuando existen 61 codones diferentes que codifican aminocidos, dado que muchos de ellos estn definidos por las dos primeras bases, no existen 61 ARNt, sino solamente 32. El cdigo gentico es casi universal . Con la misteriosa excepcin de unas pocas variaciones encontradas en mitocondrias, algunas bacterias y eucariotas unicelulares 3, los codones para los aminocidos son idnticos en todas las especies examinadas. Las escasas variantes del cdigo refuerzan el principio de que toda la vida en este planeta ha evolucionado de un cdigo gentico nico. ESTRUCTURA DE LOS RIBOSOMAS Cada clula de Escherichia coli tiene 15.000 o ms ribosomas (casi parte del peso seco de la clula) y cada ribosoma contiene un 65% de ARN y un 35% de protenas, con un dimetro de 18 nm y un coeficiente de sedimentacin de 70S (S = unidades Svedberg, unidades de sedimentacin donde influyen el tamao y la forma). Los ribosomas bacterianos estn formados por dos subunidades: una mayor (50S) y una menor (30S). La subunidad 50S contiene una molcula de ARNr 5S, una de ARNr de 23S y 34 protenas, en tanto que la subunidad 30S contiene una molcula de ARNr de 16S y 21 protenas. Las dos subunidades encajan de tal forma que se forma una hendidura a travs de la cual pasa el ARNm a medida que el ribosoma se desplaza a lo largo del mismo durante el proceso de traduccin y del que emerge la cadena polipeptdica recin formada. Los ribosomas de clulas eucariotas tienen tamaos ligeramente mayores, pero estn igualmente constituidos por dos subunidades. Su dimetro es de 23 nm y estn formados por una subunidad 60S (con tres ARNr: 5S, 5,8S y 28S) y una unidad menor 40S (con un ARNr de 18S) y en conjunto tiene alrededor de 80 distintas protenas. Caractersticas de los ARN de transferencia (ARNt) Los ARNt son pequeos y consisten en una sola hebra de ARN plegada en una estructura tridimensional precisa (en forma de hoja de trbol). En bacterias y en el citosol de los eucariotas, los ARNt tienen entre 73 y 93 residuos nucleotdicos, lo que corresponde a masas moleculares de entre 24 y 31 kDa (los de las mitocondrias son algo menores). Hay al menos una clase de ARNt para cada aminocido, pero para algunos aminocidos se requiere ms de uno y en general con 32 ARNt diferentes alcanza para reconocer todos los aminocidos. Otro aspecto distintivo es que como mnimo cada ARNt tiene ocho bases modificadas, muchas de las cuales son derivados metilados de las bases
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La mayor parte de las variaciones del cdigo aparecen en la mitocondria, cuyo genoma codifica de 10 a 20 protenas. Los cambios ms comunes observados en las mitocondrias y los nicos observados en los genomas celulares tienen que ver con los codones de terminacin.

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principales. La mayora tienen un extremo guanilato (G) en el extremo 5y todos tienen la secuencia CCA en el extremo 3, que es el extremo donde se unir el aminocido. En el extremo opuesto donde se une el aminocido se encuentra el anticodn, la secuencia de tres bases que reconoce el sitio adecuado en el ARNm. Activacin de los aminocidos. Rol de las aminoacil-ARNt sintetasas En la primera etapa de la sntesis de protenas, que tiene lugar en el citosol, cada uno de los 20 aminocidos se esterifican con sus correspondientes ARNt por medio de enzimas especficas ( aminoacilARNt sintetasas), cada una de las cuales especifica para un aminocido y uno o ms ARNt correspondientes. En la mayora de los casos hay una aminoacil-ARNt sintetasa para cada ARNt. En el ribosoma no se comprueba la identidad del aminocido que est unido al ARNt . Por este motivo la unin del aminocido correcto a cada ARNt es esencial para la fidelidad de la sntesis proteica en su conjunto. Una aminoacil-ARNt sintetasa no slo ha de ser especfica para un nico aminocido sino tambin para un ARNt determinado (debe reconocer tanto al aminocido como al ARNt correspondiente). A la interaccin entre las distintas aminoacil-ARNt sintetasas y sus correspondientes ARNt se la ha denominado segundo cdigo gentico para reflejar este hecho, que es crtico para el mantenimiento de la precisin de la sntesis de protenas. Las reglas de codificacin del segundo cdigo son, aparentemente, ms complejas que las del primer cdigo. En algunos casos intervienen diez o ms nucletidos especficos en el reconocimiento de un ARNt por su aminoacil-ARNt sintetasa especfica. Inicio de la sntesis polipeptdica La sntesis de polipptidos empieza siempre en el extremo amino (NH 2) y progresa en el sentido de la sntesis hacia el extremo carboxilo (CO.OH). Este patrn se ha confirmado en numerosos experimentos y es vlido para todas las sntesis en todas las clulas. En bacterias, el residuo aminoacdico que constituye el inicio de la cadena es la N-formil metionina y en eucariotas el aminocido inicial es la metionina. En mitocondrias y cloroplastos existe un mecanismo similar al descripto en bacterias, hecho que confirma la idea de que ambos organelos se originaron a partir de antepasados bacterianos incorporados simbiticamente a precursores de clulas eucariotas.

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El inicio de la sntesis comienza con la fijacin de un factor de inicio a la subunidad ribosmica menor, lo que impide que las dos subunidades ribosmicas se combinen prematuramente. A continuacin tiene lugar la fijacin del ARNm a la subunidad menor, de tal forma que el codn de inicio (AUG) se une en un lugar preciso. Esto se debe a que del lado 5 del ARNm, a una distancia de unos 8 a 13 pares de bases hay una secuencia constituida por 4 a 9 residuos purnicos que se unir con la secuencia complementaria del ARNr de la subunidad ribosmica menor. Una vez logrado este ensamble, se fija la subunidad ribosmica mayor. Los ribosomas tienen dos sitios en los que se fijan aminoacil-ARNt: el sitio peptidilo o sitio P y el sitio aminoacilo o sitio A. El ARNt iniciador (que trae la metionina o la N-formilmetionina, segn se trate de eucariotas o procariotas) se ubica en el sitio P, en tanto que todos los dems ARNt que transportan los dems aminocidos que constituyen la cadena se fijan en el sitio A. Elongacin de la cadena polipeptdica La tercera fase de la sntesis peptdica (las dos anteriores fueron la activacin de los aminocidos y el proceso de inicio de la sntesis) es la elongacin, es decir la incorporacin de sucesivos aminocidos a la cadena, en el orden previsto por la secuencia establecida en los sucesivos codones del ARNm. En el primer paso del ciclo de elongacin el siguiente aminoacil-ARNt que transporta el segundo aminocido se ubica seguidamente en el sitio A del complejo ribosmico. A continuacin se forma el primer enlace peptdico entre la N-formilmetionina (unida al sitio P) y el aminocido incorporado al sitio A. Esta reaccin produce un dipeptidil-ARNt en el sitio A y un ARNt descargado en el sitio P. La actividad enzimtica que cataliza la formacin de un enlace peptdico se ha conocido histricamente como peptidiltransferasa y fue atribuida a una enzima especfica que no haba podido ser aislada. En 1992 Noller y colaboradores demostraron que esta actividad estaba a cargo del ARNr ms grande de la subunidad mayor, aadiendo una nuevo ejemplo de ribozima. El siguiente paso se denomina translocacin y consiste en que el ribosoma se desplaza la distancia de un codn hacia el extremo 3 terminal del ARNm. Debido a que el dipeptidil-ARNt est unido al sitio A, esto provoca su traslado al sitio P, dejando el sitio A libre para la ubicacin del siguiente aminocido de la cadena. Simultneamente el ARNt desacilado (el que estaba unido a la Nformilmetionina) se desprende del sitio P, volviendo al citosol. La cadena polipeptdica siempre contina unida al ARNt del ltimo aminocido incorporado . Este ARNt representa la nica unin entre el polipptido en crecimiento y la informacin del ARNm. Terminacin de la sntesis peptdica La cuarta fase de la sntesis peptdica est determinada por la presencia de uno de los tres codones de terminacin del ARNm (UAA, UAG o UGA), que desencadenan los siguientes procesos sucesivos: (1) la hidrlisis del enlace peptidil-ARN terminal, (2) la liberacin del polipptido terminado y (3) la disociacin de las dos subunidades ribosmicas, preparando la iniciacin de un nuevo ciclo de sntesis polipeptdica. La fidelidad en la sntesis de protenas es energticamente cara . Aun cuando no se produzca ningn error en la formacin de la cadena, para la activacin de cada aminocido (formacin de aminoacilARNt) se requieren dos uniones fosfato aportadas por el ATP; durante el primer paso de la elongacin se requiere una molcula de GTP (equivalente al ATP) y finalmente se necesita otro GTP en el paso de traslocacin. Por lo tanto, para la formacin de cada enlace peptdico de la cadena polipeptdica completa se requiere al menos de la ruptura de cuatro enlaces fosfato de alta energa, lo que puede parecer un derroche energtico. Pero debe tenerse en cuenta que no se trata simplemente de la formacin de un enlace peptdico cualquiera, sino de la formacin de un enlace peptdico entre aminocidos especficos , que contribuirn a la formacin de una molcula proteica, es decir de un polmero que es depositario final de la informacin originalmente contenida en el ADN. Los polisomas permiten la traduccin rpida de un mensaje determinado

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Tanto a partir de clulas procariticas como eucariticas se pueden aislar grandes agrupamientos de 10 a 100 ribosomas unidos a la misma molcula de ARNm. Tales agrupamientos, denominados polisomas o polirribosomas, representan diferentes estadios de la traduccin de la seal contenida en el ARNm, que es traducida simultneamente por muchos ribosomas prximos unos a otros, lo que permite una utilizacin muy eficiente del ARNm. En bacterias el proceso es an ms eficiente, ya que a medida que le ARNm se va sintetizando comienza casi de inmediato la sntesis de protenas, con lo que la traduccin comienza antes de finalizada la transcripcin.

Plegamiento y modificacin de las cadenas polipeptdicas En la quinta y ltima fase de la sntesis de protenas, la cadena polipeptdica naciente se pliega y modifica hasta obtener su forma biolgicamente activa, hecho que puede comenzar durante la sntesis o luego de producida sta. No obstante, algunas protenas no obtienen su conformacin biolgica activa hasta despus de haber sufrido una o ms reacciones de modificacin o maduracin, denominadas modificaciones post-traduccionales. Entre ellas pueden consignarse: (1) Modificaciones amino- y carboxilo terminales . Inicialmente todos los polipptidos empiezan con un residuo N-formilmetionina (en procariotas) o metionina (en eucariotas), pero en la mayora de los casos son eliminados por reacciones post-traduccin, por lo que no aparecen en la protena final. Un 50% de las protenas eucariticas tienen el extremo N-terminal acetilado. Los residuos C-terminales son tambin a menudo modificados. (2) Prdida de secuencias seal. Son pptidos cortos de 15 a 30 aminocidos que dirigen a la protena hacia su destino final. Son eliminados por proteasas durante la sntesis en el RER. (3) Modificacin de aminocidos. Los grupos hidroxilo de serina, treonina y tirosina pueden ser fosforilados (la casena de la leche contiene muchos grupos fosfoserina, que fijan calcio). Los grupos

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asprtico y glutmico pueden recibir grupos amino extras y la lisina es frecuentemente metilada o hidroxilada, al igual que la prolina, como ocurre en la formacin del colgeno. (4) Unin de cadenas laterales glucdicas. Se unen covalentemente durante o despus de la sntesis a residuos asparagina (oligosacridos unidos por enlaces N) o a residuos de treonina o serina (oligosacridos unidos por enlaces O). Es frecuente en protenas extracelulares. (5) Adicin de grupos isoprenilo. Los grupos isoprenilo provienen de la biosntesis del colesterol. Las laminas (protenas de la lmina nuclear) estn modificadas de esta manera. (6) Adicin de grupos prostticos. Un ejemplo de la adicin covalente de un grupo prosttico luego de la sntesis es el grupo hemo del citocromo c y de la hemoglobina. (7) Modificacin proteoltica. La insulina, las proteasas tripsina y quimotripsina y el colgeno, entre otros ejemplos, se sintetizan como precursores inactivos (proinsulina, tripsingeno, quimotripsingeno y protocolgeno, respectivamente) que luego deben ser hidrolizados parcialmente para convertirse en productos biolgicamente activos. (8) Formacin de puentes disulfuro . Pueden ser intra- o intercatenarias y se supone que ayudan a las protenas que deben ser exportadas a mantener su estructura nativa. BIBLIOGRAFA ALBERTS, B., D. BRAY, A. JOHNSON, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTS Y P. WALTER (1998) Essential Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York & London. LEHNINGER, A.L., D.L. NELSON Y M.M. COX (1993) Principios de Bioqumica, Ediciones Omega, Barcelona, 2. edicin (traducido de la segunda edicin inglesa. 1993). LODISH, H., A. BERK, S.L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE & J. DARNELL. Biologa Celular y Molecular, Editorial Mdica Panamericana, 2002. PURVES, K.W., D. SADAVA, G.H. ORIANS & H.C. HELLER (2003) Vida. La Ciencia de la Biologa, 6. Edicin. Editorial Mdica Panameicana (traducido de la 6 edicin inglesa, 2001). COOPER, G.M. (2002). La Clula. 2 edicin. Marbn Libros, S.L., Espaa. (traducido de la 2 edicin inglesa, 2000). CUESTIONARIO TERICO 1. Qu tipo de organelos integran el sistema de membranas internas y cul es el mecanismo de comunicacin habitual entre ellas? 2. Cmo definira al retculo endoplsmico? Es una estructura nica o est compuesta de ms de un componente? Cules son sus funciones? 3. Existe alguna relacin entre el retculo endoplsmico y la sntesis de protenas y de lpidos? 4. Qu funcin cumple la secuencia de seal o pptido seal en una protena que comienza a ser sintetizada en el citosol? 5. Qu es el aparato de Golgi, cmo est formado y cules son sus funciones? 6. Cul es el sentido del recorrido de las vacuolas entre el retculo endoplsmico rugoso y el aparatode Golgi : RER Golgi Golgi RER? 7. Existe alguna diferencia en cunto a las funciones del aparato de Golgi en clulas animales y vegetales? 8. Qu son los lisosomas, cmo se forman y cul es la funcin que desempean? 9. Qu son los proteasomas y qu rol cumplen? En qu consiste el proceso denominado ubiquitinacin? 10.Existen los lisosomas en los vegetales? Cul es el papel de las vacuolas en las clulas vegetales? 11.Qu tipo de microcuerpos conoce y cules son las funciones que desempean en las clulas? 12.Qu es el cdigo gentico y con la sntesis de qu tipo de sustancias est relacionado? 13.Existe alguna relacin entre el cdigo gentico y el proceso denominado traduccin? 14.Qu es un codn y qu tipo de informacin contiene? Y un anticodn? 15.El cdigo gentico es universal o es exclusivo de los organismos ms evolucionados?

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16.Cuntos marcos de lectura pueden existir en un ARN mensajero? Son todos equivalentes en cuanto a la informacin codificada en ellos? 17.Qu es un codn de inicio y un codn de terminacin? 18.Los ribosomas que participan de la sntesis de una protena determinada pueden participar en la sntesis de otras protenas diferentes o son exclusivas de aqulla? 19.Cul es el rol de los ARN de transferencia (ARNt)? Por qu se habla de un segundo cdigo gentico en relacin a ellos? 20.Qu son los polisomas o polirribosomas? Existen diferencias en la sntesis proteica en procariotes y eucariotes? 21. En que consisten las modificaciones post-traduccionales que sufren algunas protenas?

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Mdulo 8. TRABAJO EXPERIMENTAL

1.Observacin de vacuolas digestivas en protozoarios ciliados Fundamento. Los ciliados son organismos unicelulares, que por intermedio del proceso de fagocitosis pueden digerir a las levaduras (hongos unicelulares). La vacuola digestiva (con las levaduras en su interior) se fusionan con los lisosomas y por la accin de las enzimas hidrolticas que se encuentran en su interior, las levaduras son digeridas Este proceso de digestin celular se pone de manifiesto por el cambio de color del colorante rojo congo. En las levaduras muertas el rojo congo presenta un color rojo (por encima de pH=5) pero cuando las vacuolas digestivas se fusionan con los lisosomas; que tienen pH ms cido; este vira al prpura y luego al azul a pH=3. Protocolo experimental. - Colocar en un tubo de ensayo 10 ml de agua de charco. - Concentrar los ciliados centrifugando a 2000 rpm durante 5 minutos. - Descartar la mayor parte del sobrenadante, dejando en el tubo aproximadamente 1 ml. - Resuspender el precipitado con agitacin. - Tomar del tubo dos gotas y colocarlas en un portaobjetos. - Tomar una pequea cantidad de una suspensin de levaduras coloreadas con rojo congo (30% de levaduras y 0,3%de colorante), sumergiendo el extremo de un palillo en dicha suspencin y mezclarla con las gotas del agua de charco hasta que adquiera un color rosa plido. - Colocar un cubreobjeto y observar al microscopio. Preparacin de levaduras teidas con rojo congo: A 3 g de levaduras agregarles 10 ml de agua destilada y 3 mg. de rojo congo. Calentar a bao mara durante 10 minutos para matar las levaduras. Si se evapora mucho el agua, llevar nuevamente con agua destilada hasta obtener una suspensin estimada del 30% de levaduras. Haga un esquema de la observacin microscpica dentro del crculo adjunto. Aumento utilizado: 2.Observaciones en preparaciones fijadas y coloreadas. Complejo de Golgi Observacin de clulas epiteliales de estmago de Amphiuma. Tincin de De Fano. Esquematizar. La anfiuma es una salamandra acutica de alrededor de 1 m de largo. Como todo anfibio, puede pasar etapas sobre la tierra, pero deposita los huevos (cerca de 200) en aguas poco profundas bajo restos vegetales, para esconderlos y protegerlos de los predadores. La eclosin de los huevos ocurre cinco meses despus de la deposicin. Aumento utilizado: 3. Observacin de microfotografas de preparaciones que muestran compomentes del sistema de endomembranas.

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Durante el prctico los alumnos debern observar microfotografas e identificar la ultraestructura de los distintos componentes presentes en diferentes tipos celulares. 3.ELECTROFORESIS DE PROTENAS SRICAS SOBRE TIRAS DE CELLOGEL Fundamento Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contiene una molcula con carga neta (+ o ), sta migrar a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamao y su forma. Esta tcnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de molculas cargadas (protenas, cidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidn o poliacrilamida). La movilidad electrofortica es la relacin de la velocidad de la molcula (v) y el potencial elctrico (E). Tambin es igual a la carga neta de la molcula (Z) dividida por el coeficiente friccional (f), que es la resistencia que el gel opone al movimiento de la partcula. =v/E=Z/f En la frmula puede verse que a mayor carga elctrica, mayor ser la movilidad de la molcula. Un parmetro importante a considerar en la electroforesis de aminocidos y protenas es su punto isolelctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la carga de la molcula. Cuando el pH es mayor que el pI la molcula tendr carga negativa; por el contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molcula ser positiva. De esta manera, de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la muestra se sembrar en uno u otro polo: si la molcula tiene carga negativa se sembrar cerca del polo negativo (ctodo), con lo que migrar hacia el polo positivo (nodo) y viceversa. Equipamiento: Cuba electrofortica y Fuente de poder
CUBA ELECTROFORTICA tapa tira de papel o cellogel

buffer

+
nodo

+
fuente de poder

ctodo

buffer

Reactivos: Buffer de corrida: Veronal - veronal sdico, pH 8,6. Colorante: Amidoschwarz 10B. Decolorante: cido actico al 5%. Deshidratante: metanol puro. Transparentizante: metanol/cido actico/glicerol. Tcnica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Sumergir en el buffer las tiras durante diez minutos y luego secarlas entre papeles de filtro Colocar el buffer en la cuba electrofortica Extender las tiras sobre el puente de la cuba, con la superficie permeable hacia arriba Sembrar la muestra a un centmetro del borde Conectar la fuente de poder de tal modo que el polo negativo quede en el lado de la siembra y correr durante 75 minutos Desconectar la fuente de poder Secar las tiras y sumergirlas en la solucin colorante durante cinco minutos Sumergir tres o cuatro veces en solucin decolorante Sumergir las tiras en el deshidratante durante treinta minutos

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10. Pasarlas a la solucin transparentizante durante un minuto 11. Colocarlas sobre una placa de vidrio adhirindolas bien y dejar en estufa durante unos minutos 12. Observar las bandas e interpretar los resultados.