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Módulo 10. ORGANELOS TRANSDUCTORES DE ENERGÍA:

CLOROPLASTOS Y FOTOSÍNTESIS

PLÁSTIDOS

Con este nombre se denomina genéricamente a un grupo de organelos que producen y/o almacenan diversos productos en algas y plantas. Todos los plástidos derivan de proplástidos, que son pequeños organelos presentes en los tejidos meristemáticos (tejidos en activa división). Los etioplastos son plástidos de hojas crecidas en ausencia de luz que cuando se exponen a la luz se transforman en cloroplastos, desarrollando una estructura mucho más compleja (ver figura). Los amiloplastos son plástidos especiales que reservan almidón en los tejidos no fotosintéticos y los cromoplastos almacenan pigmentos liposolubles.

Módulo 10. ORGANELOS TRANSDUCTORES DE ENERGÍA: CLOROPLASTOS Y FOTOSÍNTESIS PLÁSTIDOS Con este nombre se denomina genéricamente
Módulo 10. ORGANELOS TRANSDUCTORES DE ENERGÍA: CLOROPLASTOS Y FOTOSÍNTESIS PLÁSTIDOS Con este nombre se denomina genéricamente

Etapas de transformación de un etioplasto (a) cuando se expone a la luz. En el centro de la fotografía se observa una estructura (cuerpo prolamelar) que será el origen de los tilacoides. Luego de tan sólo un minuto de exposición a la luz el cuerpo prolamelar se organiza en laminillas (b). Al cabo de otro minuto de exposición (c) comienzan a distribuirse las laminillas. Luego de 24 horas de exposición a la luz (d) se observan los primeros grana (asociación de membranas tilacoidales). En (e) puede verse un granum totalmente desarrollado.

Los cloroplastos son el tipo más importante de plástidos: estos organelos contienen clorofila, un pigmento de color verde capaz de captar la energía que provee la luz solar para realizar la fotosíntesis. Hay varios tipos de clorofilas que difieren ligeramente entre sí: en las plantas terrestres las clorofilas más comunes son las clorofilas a y b, pero en las algas hay otros tipos. Los cloroplastos también contienen una variedad de pigmentos amarillos y naranjas llamados carotenoides que absorben radiaciones luminosas en zonas del espectro visible donde no absorben las clorofilas y por ello se denominan pigmentos fotosintéticos accesorios o auxiliares. Un alga unicelular puede contener sólo un gran cloroplasto, en tanto que la célula de una hoja puede tener entre 20 y 100. Es importante señalar que los cloroplastos no son solamente sitio de síntesis y almacenamiento de hidratos de carbono, pues el ATP y el poder reductor que producen son utilizado en diferentes compartimientos para la síntesis de otros compuestos químicos que la célula requiere para su funcionamiento. Los cloroplastos son organelos complejos, en forma típica de disco, delimitados por dos membranas, una interna y otra externa. El espacio delimitado por la membrana interna llamado estroma (que es análogo a la matriz mitocondrial) contiene las enzimas encargadas de sintetizar glucosa a partir de dióxido de carbono, agua y energía (ATP y poder reductor) obtenida de la luz solar; también posee ADN, ARN y ribosomas. Dentro del estroma existe un tercer sistema de membranas que delimita compartimientos en forma de sacos aplanados, de forma discoidal, interconectados unos con otros, llamados tilacoides. El interior de este compartimiento se denomina espacio intratilacoidal. Los tilacoides se agrupan formando pilas (granum, plural grana). Tales membranas, ricas en clorofila, se asemejan a la membrana interna de la mitocondria por el hecho de que ambas intervienen en la formación de ATP. La energía captada por las moléculas de clorofila a partir de la luz solar es utilizada para excitar electrones que se utilizarán en la formación de moléculas de ATP y de poder reductor (NADPH, equivalente al

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NADH). Esta energía química será luego utilizada en el estroma para obtener glucosa partir de dióxido de carbono y agua.

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 2 NADH). Esta energía química será luego utilizada

Transporte de proteínas hacia los cloroplastos

Como ya se ha mencionado en capítulos anteriores, casi todo el ADN de las células eucarióticas se encuentra en el núcleo, pero los cloroplastos (al igual que las mitocondrias) contienen moléculas de ADN en sus compartimientos internos, así como ribosomas, lo que les permite producir un pequeño número de las proteínas que se encuentran en estos organelos. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas de los cloroplastos son fabricadas en los ribosomas libres del citosol, que después son transportadas al sitio adecuado del organelo. Las proteínas codificadas por el genoma del cloroplasto son relativamente pocas y usualmente se ubican en la membrana tilacoidal de los cloroplastos; en muchos casos ser trata de subunidades de proteínas complejas que tienen que ensamblarse luego con otras subunidades codificadas en el genoma nuclear.

Al igual que lo que ocurre en las mitocondrias, las proteínas destinadas a los cloroplastos son orientadas hacia estos organelos por secuencias de señal específicas que tienen que ser reconocidas por una proteína de la membrana externa del cloroplasto. De acuerdo a su ubicación final, la proteína atraviesa una o las dos membranas y así llega al estroma o a los tilacoides de los grana. En las células vegetales capaces de realizar fotosíntesis, ambos organelos (mitocondrias y cloroplastos) están contenidos en la misma célula, por lo que las proteínas citosólicas destinadas a cada uno de ellos contienen diferentes secuencias de señal. Los cloroplastos plantean un problema adicional por poseer un tercer compartimiento (la membrana tilacoidal y el espacio intratilacoidal). Las proteínas que ingresan al cloroplasto y tienen como destino este tercer compartimiento presentan una primera secuencia de señal que será eliminada por una peptidasa de señal al entrar al estroma. Luego de hidrolizada la primera secuencia de señal queda expuesta una segunda secuencia de señal que indica que el destino final es intratilacoidal; dentro del tilacoide una segunda peptidasa de señal liberará la cadena polipeptídica definitiva, la que iniciará entonces su plegamiento.

Los genomas de los cloroplastos

Como ya se ha dicho, la mayoría de las proteínas presentes en los cloroplastos son codificadas por el ADN nuclear, pero parte de las mismas son sintetizadas en los propios organelos. Tal como se mencionó al tratar las mitocondrias, el tráfico de proteínas está dirigido solamente desde el citosol hacia los cloroplastos; no se conoce que se exporten proteínas desde el cloroplasto hacia el citosol. Del mismo modo que lo que ocurre con las mitocondrias, los cloroplastos no se originan de novo:

siempre provienen de la división de cloroplastos preexistentes. Para que las células hijas posean una cantidad de cloroplastos equivalente a la que tenía la célula madre sus cloroplastos deben dividirse antes de producirse la división celular. La división de los cloroplastos ocurre por fisión binaria, como en las bacterias y la división de su ADN se realiza del mismo modo que hemos visto para este tipo de

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organismos. El ADN cloroplástico es bastante simple y, salvo en algunas algas, es de tipo circular y no parece contener histonas asociadas, al igual que en las bacterias. Por su parte la maquinaria de síntesis proteica se parece más a la de las bacterias que a la de células eucariotas: los ribosomas son similares a los de Escherichia coli, tanto en su estructura como en la sensibilidad a los antibióticos; la síntesis de péptidos empieza con N-formilmetionina y no con metionina y el ADN cloroplástico puede ser transcripto por la ARN polimerasa de la E. coli para producir ARNm cloroplástico y fabricar proteínas cloroplásticas. Como ya ha sido expresado antes, la existencia de una molécula propia de ADN circular en los cloroplastos, junto con otras características semejantes a las de células procarióticas, han sido las causas de que se proponga que estos organelos evolucionaron a partir de organismos procarióticos que originalmente vivieron dentro de células de mayor tamaño y que a lo largo de la evolución se han adaptado de manera que dejaron de ser organismos autónomos. Esta idea se ha incorporado como un elemento importante de la teoría endosimbiótica que se refiere al origen de las células eucarióticas 1 .

Los cloroplastos constituyen el lugar en donde se lleva a cabo la fotosíntesis

Las plantas, las algas y algunas bacterias son productores, es decir que son los únicos organismos capaces de transformar la energía solar en energía química mediante el proceso de la fotosíntesis. Cada año estos destacados organismos producen más de 200 mil millones de toneladas de nutrientes que pueden ser asimilados por los heterótrofos para obtener energía química, poder reductor y moléculas sencillas para sintetizar sus propios componentes. De este modo, la energía química almacenada por los autótrofos sirve de combustible para las reacciones metabólicas que mantienen la vida en la tierra. Los productores son organismos autótrofos (que se nutren a sí mismos: del griego autos que significa "a uno mismo" y trophos que significa "nutrición"), es decir que se trata de organismos que fabrican sus propios alimentos a partir de materias primas inorgánicas y por lo tanto no dependen para su nutrición de otros organismos. Algunas bacterias son autótrofos quimiosintéticos: son productores que fabrican sus compuestos orgánicos mediante la oxidación de sustancias inorgánicas simples como el azufre y el amoníaco. Los autótrofos quimiosintéticos no requieren de luz como fuente de energía para realizar estas reacciones. La mayor parte de los productores son autótrofos fotosintéticos:

organismos que utilizan la luz como fuente de energía para la fabricación de compuestos orgánicos a partir de dióxido de carbono y agua. Cuando se examina al microscopio una pequeña porción de la hoja de una planta, se puede

comprobar que el color verde debido a la clorofila no se encuentra disuelto en el citoplasma sino que se encuentra confinado en los cloroplastos, localizados principalmente en las células del mesófilo, tejido que se ubica en el interior de la hoja. Si se utiliza el microscopio electrónico puede comprobarse que los cloroplastos, al igual que las mitocondrias, poseen una membrana interna y otra externa. La membrana interna encierra una zona llena de líquido, denominada estroma, que contiene la mayor parte de las enzimas necesarias para aquellas reacciones de la fotosíntesis que no requieren de luz (las reacciones que convierten el dióxido de carbono en glucosa). Como ya se ha mencionado, la membrana interna de los cloroplastos encierra un tercer sistema de membranas que forman un conjunto de sacos discoidales, aplanados e interconectados entre sí, llamados tilacoides. Estas membranas tilacoides forman un tercer compartimiento en los cloroplastos, llamado espacio tilacoideo o intratilacoidal. En algunas zonas estos sacos se organizan en columnas llamadas grana. Cada granum se parece a una pila de monedas, en donde cada moneda corresponde a un tilacoide. Algunas membranas tilacoidales se extienden de un granum a otro, conformando un sistema interconectado. Los procariotes fotosintéticos como las cianobacterias carecen de cloroplastos, pero poseen estructuras similares a los tilacoides que son extensiones de la membrana celular y se ubican en la periferia de la célula. La clorofila, los pigmentos fotosintéticos y las enzimas necesarias para las reacciones de la fotosíntesis que requieren luz se encuentran asociados a las membranas tilacoidales. Estas membranas, al igual que la membrana interna de las mitocondrias, intervienen en la síntesis de ATP.

1 Christian de Duve, “The birth of complex cells, Scientific American, 274:(4): 38-45, April 1996

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FOTOSÍNTESIS: CAPTACIÓN DE ENERGÍA LUMINOSA

Los organismos fotosintetizadores capturan la luz solar para formar ATP y NADPH (un análogo fosforilado del NADH), moléculas que son luego utilizados como fuente de energía para fabricar glúcidos a partir de CO 2 y H 2 O. Los organismos heterótrofos aeróbicos usan el O 2 para degradar los productos orgánicos ricos en energía producidos en la fotosíntesis a CO 2 y H 2 O, generando ATP y poder reductor para sus propias actividades. El CO 2 formado regresa a la atmósfera para volver a ser utilizado por los organismos fotosintetizadores. De este modo la energía solar proporciona la fuerza motriz para la ciclación continua del CO 2 y O 2 atmosféricos. La ecuación global de la fotosíntesis describe una reacción de óxido-reducción en la que el H 2 O provee el hidrógeno necesario para la reducción del CO 2 y su transformación a glúcidos (CH 2 O), con liberación de oxígeno molecular:

luz

H 2 O + CO 2

(CH 2 O) + O 2

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 4 FOTOSÍNTESIS: CAPTACIÓN DE ENERGÍA LUMINOSA Los organismos

La fotosíntesis abarca dos procesos: las reacciones luminosas (fotodependientes), que sólo tienen lugar cuando se iluminan las plantas, y las reacciones de fijación de carbono, mal llamadas reacciones oscuras, ya que tienen lugar tanto en presencia de la luz como en la oscuridad (sería más correcto denominarlas reacciones fotoindependientes). En las reacciones luminosas de la clorofila y otros

pigmentos absorben energía luminosa la que se conserva en forma de energía química en dos productos ricos en energía: ATP y NADPH. En las reacciones de fijación de carbono se utilizan el ATP y el NADPH para reducir el CO 2 a glucosa. El ATP y el NADPH producidos durante la fotosíntesis también pueden ser utilizados para la síntesis de otros compuestos orgánicos. ¿De qué manera transducen (transforman) las moléculas de pigmentos de las membranas tilacoides la energía luminosa en energía química? La clave la dio un descubrimiento realizado en 1937 por Robert Hill, que demostró que cuando se exponen a la luz extractos de hoja que contienen cloroplastos en presencia de un aceptor de hidrógeno (A) se desprende oxígeno, al tiempo que tiene lugar la reducción simultánea del aceptor de hidrógeno, según una ecuación actualmente conocida como

reacción de Hill.

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2 H 2 O + 2 A

2 AH 2 + O 2

El aceptor de hidrógeno utilizado por Hill fue el diclorofenolindofenol (DPIP), que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incolora. Cuando se iluminaba el recipiente conteniendo la mezcla de reacción, el colorante se decoloraba y se formaban burbujas de oxígeno. En la oscuridad no había reacción. Hill también demostró que la presencia de CO 2 no es necesaria para que la reacción tenga lugar y que si está presente no participa en la reacción, concluyendo que la producción de oxígeno podía disociarse de la reducción del CO 2 . Algunos años más tarde se encontró que el aceptor universal de hidrógeno en las plantas es el NADP +.

2 H 2 O + 2 NADP +

2 NADPH + 2 H + + O 2

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Observemos que en la fotosíntesis, los electrones fluyen desde el agua hacia el NADP + , en tanto que en la fosforilación oxidativa que ocurre en la cadena respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias sucede lo contrario: los electrones pasan del NADH al O 2 , con formación de agua. Puesto que el flujo electrónico inducido por la luz va “cuesta arriba” no puede transcurrir sin aporte de energía. Esta energía proviene de la luz.

La absorción de luz excita las moléculas La luz es una pequeña parte de un gran espectro de radiación, el espectro electromagnético. Todas las radiaciones de dicho espectro viajan a través de ondas. Se denomina longitud de onda a la distancia que existe entre la cresta de una onda y la de la siguiente. En un extremo del espectro se encuentran los rayos gamma, cuya longitud de onda es muy corta (menor de un nanómetro). En otro extremo del espectro se encuentran las ondas de radiación de baja frecuencia, cuya longitud de onda es tan grande que puede medirse en kilómetros. Los diferentes colores de la luz (distintas regiones del espectro de luz) se identifican mediante sus longitudes de onda. Dentro del espectro de la luz visible el color violeta corresponde a la longitud de onda más corta y el rojo a la longitud de onda más larga. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda aún más pequeña y el infrarrojo una longitud de onda incluso mayor. La luz no sólo se comporta como una onda, sino también como una partícula. Está constituida por pequeños paquetes de energía llamados fotones. La luz visible es radiación electromagnética de longitud de onda entre 400 y 700 nm. La energía de un fotón (cuanto de luz) es mayor cuanto menor sea la longitud de onda y va de 300 kJ (radiación violeta de 400 nm de longitud de onda) a 170 kJ (radiación roja de 700 nm de longitud de onda). En otras palabras, la energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda.

Color

Rango de longitud de onda (nm)

Energía (KJ/mol)

Ultravioleta

<400

471

Violeta

400-425

292

Azul

425-490

260

Verde

490-560

230

Amarillo

560-585

210

Anaranjado

585-640

193

Rojo

640-740

176

Infrarrojo

>740

85

La capacidad de una molécula para absorber luz depende del ordenamiento de sus electrones alrededor de los núcleos atómicos en su estructura. Cuando se absorbe un fotón se eleva un electrón a un nivel energético superior, pero el proceso ocurre según un sistema de todo o nada: para ser absorbido el fotón ha de contener una cantidad de energía (un cuanto) que iguale exactamente la energía de la transición electrónica. Una molécula que ha absorbido un fotón se encuentra en estado excitado que, en general, es inestable. Los electrones elevados a orbitales de energía superior usualmente vuelven rápidamente a sus orbitales normales (estado basal), dejando ir el cuanto de energía en forma de luz (fluorescencia) y/o calor. La radiación fluorescente es siempre de mayor longitud de onda (menor energía) que la luz absorbida.

Pigmentos fotosintéticos

Los más importantes son las clorofilas, pigmentos verdes con estructuras policíclicas que se parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, excepto que la posición central está ocupada por Mg 2+ en lugar de Fe 2+ . La molécula está compuesta de un sistema de anillos heterocíclicos (cuatro anillos pirrólicos sustituidos y un quinto anillo no pirrólico). Además contiene una larga cadena hidrofóbica de un alcohol, el fitol, esterificando a un ácido sustituyente de uno de los pirroles. El sistema de anillos heterocíclicos tiene una estructura con alternancia de enlaces sencillos y dobles (conjugados) que constituyen el grupo

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cromóforo 2 responsable de la absorción de luz. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre dos tipos de clorofila. Una es invariablemente la clorofila a, mientras que la segunda es la clorofila b, que sólo difiere de la clorofila a en que tiene un grupo aldehído en lugar de un grupo metilo en el anillo II. La mayoría de las plantas superiores contienen aproximadamente el doble de clorofila a que de clorofila b. En organismos fotosintetizadores inferiores existen otras clorofilas con pequeñas diferencias químicas. Además de las clorofilas, las membranas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que también absorben la luz, llamados conjuntamente

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 6 cromóforo responsable de la absorción de luz.

pigmentos accesorios. Entre ellos se encuentran

los carotenoides que incluyen a los carotenos, no oxigenados, y a las xantofilas, de colores rojo al amarillo y las ficobilinas que son pigmentos tetrapirrólicos pero no cíclicos, presentes en algas rojas y en cianobacterias e incluyen a la ficocianina (azul) y a la ficoeritrina (roja).

Espectro de acción de la fotosíntesis

El espectrofotómetro es un instrumento para medir la cantidad de luz que absorbe una sustancia, por lo que determina la capacidad de los distintos pigmentos para absorber radiaciones luminosas de diferentes longitudes de onda. Sin embargo, un espectro de absorción no indica cuáles son las longitudes de onda más efectivas para la fotosíntesis, pues los pigmentos no se encuentran libres sino formando parte de la membrana. La efectividad relativa de las diferentes longitudes de onda en la fotosíntesis está dada por el espectro de acción de la fotosíntesis, que fue determinado en un experimento biológico clásico llevado a cabo en 1833 por el biólogo alemán T.W. Engelmann, aprovechando la forma del cloroplasto en la Spirogyra, un alga que se encuentra en forma de filamentos delgados en estanques de agua fresca. Cada una de las células de Spirogyra contiene un cloroplasto verde esmeralda en forma de espiral embebido en el citoplasma. Engelmann supuso que si dichos cloroplastos se expusieran a un espectro luminoso producido por un prisma, la fotosíntesis se llevaría a cabo con mayor rapidez en aquellos puntos en los que el cloroplasto fuera iluminado por los colores que la clorofila absorbe más rápidamente, si la clorofila fuese responsable de la fotosíntesis. ¿Cómo medir la fotosíntesis en aquellos días de tecnología tan elemental? Engelmann sabía que durante la fotosíntesis se producía oxígeno, y que algunas bacterias

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 6 cromóforo responsable de la absorción de luz.

2 del griego cromos = color, foros = llevar, grupo responsable del color de la molécula

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tenían especial atracción por áreas de alta concentración de oxígeno. Por tanto, determinó el espectro de acción observando hacia cuáles células de Spirogyra se dirigían estas bacterias y encontró que se concentraban en las localizadas en las regiones azul y roja del espectro. El hecho de que las bacterias no se dirigiesen hacia esas zonas en ausencia de la Spirogyra, demostró que dichas bacterias no eran atraídas simplemente por la luz roja o azul, sino por la presencia del oxígeno liberado durante la fotosíntesis. Sin embargo, el espectro de acción de la fotosíntesis difiere un poco del espectro de absorción de la clorofila pura. Esto se explica por dos razones: la primera es que los cloroplastos contienen además de clorofila pigmentos accesorios en cantidades importantes, como carotenoides (en las plantas) o ficobilinas (en algas rojas y de cianobacterias) y que absorben luz que la clorofila reflejaría y estos pigmentos accesorios transfieren luego por resonancia su energía de excitación a las moléculas de clorofila; la segunda, como ya hemos dicho, es que los pigmentos al estar insertos en la membrana tilacoidal varían el espectro de luz que pueden absorber respecto a los pigmentos en solución. La presencia de pigmentos accesorios permite a las algas utilizar con mayor eficacia la luz verde del espectro, en comparación, por ejemplo, con los crisantemos. Esto constituye un importante mecanismo de adaptación, ya que permite que las algas vivan en hábitats acuáticos profundos, en donde la luz roja, tan efectiva para la fotosíntesis en otros habitats, ha sido absorbida durante el paso de la luz a través del agua.

La clorofila canaliza la energía absorbida a centros de reacción fotoquímicos

Los pigmentos de las membranas tilacoidales que absorben luz están ordenados en conjuntos o dispositivos funcionales denominados fotosistemas. En los cloroplastos de espinaca cada fotosistema contiene unas 200 moléculas de clorofilas y unas 50 de carotenoides. Todas las moléculas de pigmentos pueden absorber fotones, pero sólo unas pocas pueden transducir la energía luminosa a energía química. Un complejo transductor consiste en varias moléculas de clorofila combinadas con un complejo proteico que también contiene quinonas fuertemente unidas; este complejo se denomina centro de reacción fotoquímico. Las otras moléculas del fotosistema se denominan moléculas recolectoras de luz o antenas. Su función es absorber energía lumínica y transmitirla a velocidad muy elevada al centro de reacción en donde tienen lugar las reacciones fotoquímicas que se describirán más adelante. Las moléculas de clorofila en las membranas tilacoidales están ligadas a proteínas integrales de membrana (fijadoras de clorofila a o b, o proteínas CAB 3 ) que orientan a la clorofila con respecto al plano de la membrana y le confieren propiedades para la absorción de la luz ligeramente diferentes de las de la clorofila libre. Cuando una molécula de clorofila (o un pigmento accesorio) absorbe un fotón se excita y

en lugar de emitir fluorescencia transfiere la energía por resonancia a una molécula de clorofila vecina y retorna a su estado basal. El proceso se repite varias veces hasta que se excita la clorofila del centro de reacción, donde se promueve el pasaje de un electrón a un orbital de energía superior, de donde finalmente es cedido a un aceptor electrónico vecino que forma parte de la cadena de transportadores de electrones y que darán como resultado final la generación de ATP y de NADPH. Las membranas tilacoides tienen dos tipos de fotosistemas, cada uno de ellos con su centro de reacción y su conjunto de moléculas antena. Los dos fotosistemas tienen funciones distintas y complementarias. El fotosistema I tiene un centro de reacción denominado P700 y una elevada proporción de clorofila a en relación con la clorofila b. El fotosistema II, con su centro de reacción P680, contiene cantidades aproximadamente iguales de ambas clorofilas y puede tener también clorofila c. Todas las plantas superiores, algas y cianobacterias tienen ambos fotosistemas, pero las bacterias fotosintéticas, que no desprenden oxígeno, sólo tienen el fotosistema I, ya que no utilizan el agua como dador de átomos de hidrógeno sino al sulfuro de hidrógeno (SH 2 ) o directamente al hidrógeno molecular.

La absorción de luz por el fotosistema II inicia el proceso

Cuando la energía de excitación llega al centro de reacción del fotosistema II, se genera una molécula de potencial de reducción muy negativo, el P680* (P680 excitado), que finalmente cede su electrón a una serie de quinonas (plastoquinona y otras), que son capaces de tomar protones del medio.

3 CAB = chlorophyll a/b binding proteins

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Para poder continuar con el proceso, el P680 + debe adquirir un electrón para volver a su estado basal. Ese electrón podría provenir de un gran número de compuestos orgánicos o inorgánicos, pero el gran salto evolutivo lo dieron los antecesores de las cianobacterias, que adaptaron el fotosistema II para aprovechar los electrones de agua, el producto más abundante que existía. Para ello crearon un complejo de escisión del agua, que contiene cuatro iones manganeso. La absorción secuencial de cuatro fotones, cada uno de los cuales produce la pérdida de un electrón del centro de Mn, produce un agente oxidante que está en condiciones de tomar cuatro electrones del agua, generando cuatro protones y una molécula de oxígeno, proceso denominado fotólisis del agua (ruptura de la molécula de agua por efecto de la luz).

2 H 2 0 4 H + + 4 e + O 2
2 H 2 0
4 H + + 4 e + O 2

La absorción de luz por el fotosistema I crea un poderoso agente reductor Los procesos fotoquímicos que ocurren en el fotosistema I son similares a los que se han indicado para el fotosistema II. La captura de un fotón por una de las moléculas antena y su traslado hasta el P700 origina una molécula excitada (P700*) que transfiere su electrón a una serie de aceptores entre quienes se encuentran una proteína hierro-sulfurada (Fe-S), la ferredoxina (Fd) y finalmente la ferredoxina-NADP + oxidorreductasa, que transfiere los electrones al NADP + para formar NADPH. Como consecuencia de la cesión de un electrón, la molécula de P700 ha quedado con déficit electrónico (P700 + ), el que es satisfecho porque una proteína soluble que contiene cobre y que pertenece al fotosistema II (plastocianina) le cede sus electrones.

El complejo de los citocromos une los fotosistemas II y I

Los electrones almacenados en las quinonas del fotosistema II se transportan al P700 del fotosistema I a través del complejo de los citocromos y de la plastocianina. El complejo de los citocromos es muy similar al complejo III de la cadena respiratoria: recibe electrones de una quinona y se los cede a una proteína soluble (la plastocianina, en el cloroplasto, en lugar del citocromo c de las mitocondrias). Al igual que en la mitocondria, también se bombean protones, pero en este caso desde el estroma hacia el

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interior del espacio tilacoidal. Dado que este espacio es pequeño, la entrada de un número reducido de protones tiene un efecto pronunciado, que alcanza a 3 unidades de pH (pH 8 en el estroma y pH 5 en el espacio tilacoidal), con lo que la concentración de protones interna es 3000 veces superior a la del estroma, generando una importante fuerza motriz para la síntesis de ATP.

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 9 interior del espacio tilacoidal. Dado que este

Acoplamiento de la síntesis de ATP al flujo de electrones impulsado por la luz En 1954 Arnon descubrió que si se añadían ADP y fosfato inorgánico a la reacción de Hill, se generaba ATP, proceso al que se denominó fosforilación fotosintética, o simplemente fotofosforilación, para distinguirla de la fosforilación oxidativa que se produce durante la respiración mitocondrial. A diferencia de lo que ocurre con respiración mitocondrial, no está bien establecida la estequiometría del proceso, pero se estima que por cada par de electrones transportados se forman una o dos moléculas de ATP. La enzima responsable de la síntesis de ATP en los cloroplastos es un complejo muy similar al que opera en las mitocondrias: una proteína transmembrana homóloga a la mitocondrial que permite el pasaje de protones y un complejo de proteína periférica también homóloga a la de las mitocondrias, ubicada hacia el espacio estromático, que permite la síntesis de ATP a expensas de ADP + Pi, con lo que tanto la orientación de la ATP sintasa como el sentido de paso de los protones son opuestos a los de las mitocondrias.

Síntesis fotosintética de glúcidos Las plantas verdes contienen en sus cloroplastos una maquinaria enzimática única para catalizar la conversión del CO 2 en compuestos orgánicos sencillos (reducidos), proceso que se denomina fijación del CO 2 o fijación del carbono. Las reacciones que dan lugar a la fijación y reducción del dióxido de carbono forman parte de una ruta cíclica elucidada a principios de la década del ‘50 por Melvin Calvin y a menudo se la denomina ciclo de Calvin 4 . La fijación del CO 2 tiene lugar en tres fases:

1. Fijación del CO 2 en una unión orgánica, lograda a través de la condensación de seis moléculas de dióxido de carbono con otras tantas de una pentosa, la ribulosa-difosfato, formando seis moléculas de un intermediario inestable que se descompone en 12 moléculas de 3-fosfoglicerato

  • 4 Melvin Calvin (1918-1997) recibió el Premio Nobel en 1961 por su aporte al conocimiento de la fotosíntesis de hidratos de carbono

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  • 2. Reducción del 3-fosfoglicerato a gliceraldehído-3-fosfato. El poder reductor (NADPH) generado en las reacciones luminosas se utiliza para reducir las 12 moléculas de 3-fosfoglicerato a gliceraldehído-3- fosfato. De ellas, dos moléculas se utilizan en la síntesis de una molécula de glucosa-fosfato que podrán utilizarse luego en la síntesis de almidón.

  • 3. Regeneración de la pentosa difosfatada. Diez de las doce moléculas de gliceraldehído-3-fosfato se utilizan para la regeneración de las 6 moléculas de ribulosa-difosfato. De este modo el proceso cíclico permite la conversión continua de CO 2 en triosas y hexosas fosfato.

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 10 2. Reducción del 3-fosfoglicerato a gliceraldehído-3-fosfato .

Fase 1. Fijación del CO 2 y conversión en 3-fosfoglicerato. La enzima que cataliza la incorporación del CO 2 en forma orgánica es la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxidasa (rubisco). Está constituida por ocho subunidades grandes (56 kDa c/u) y ocho subunidades pequeñas (14 kDa c/u), lo que hace un total de 560 kDa. Está localizada en el estroma del cloroplasto, donde constituye alrededor del 50% de la proteína total del cloroplasto. Es la enzima más abundante de la biosfera. La enzima cataliza la incorporación del CO 2 a la ribulosa-1,5-bisfostato y la rotura del intermedio inestable de seis carbonos que se forma, generando dos moléculas de 3- fosfoglicerato.

Fase 2. Conversión de 3-fosfoglicerato en gliceraldehído-3-fosfato

Ocurre en dos pasos que básicamente significa el proceso inverso de la glucólisis. La diferencia estriba en que el cofactor necesario para la reducción es el NADPH y no el NADH. En el primer paso el 3- fosfoglicerato es convertido a 1,3-bisfosfoglicerato por la quinasa correspondiente a expensas del ATP; en

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el segundo la deshidrogenasa que requiere NADPH reduce al 1,3-bisfosfoglicerato a gliceraldehido-3- fosfato con producción de fosfato inorgánico. El destino del fosfoglicerato es variado: a) la mayor parte de él se recicla para regenerar la pentosa fosfato que da inicio al proceso, b) puede convertirse en hexosa

fosfato y dar lugar a la síntesis de almidón, que como almidón primario se conserva en el cloroplasto y c) puede abandonar el cloroplasto y dar lugar a la formación de sacarosa o degradarse mediante la vía glicolítica con producción de energía.

Fase 3. Regeneración de la ribulosa-1,5-bisfosfato a partir de triosas fosfato

Dado que la primera reacción de fijación del carbono consiste en la unión del dióxido de carbono a una pentosa difosfatada (la ribulosa-difosfato), se debe regenerar ésta constantemente para que el flujo de CO 2 a glúcidos sea continuo. Para ello se forman intermedios de 3, 4, 5, 6 y 7 carbonos en un proceso que convierte triosas (10 moléculas de gliceraldehído fosfato) en pentosas (6 moléculas de ribulosa 1,5- difosfato). Las 10 moléculas de gliceraldehído fosfato recorren el siguiente camino, hasta llegar a regenerar las 6 moléculas de ribulosa-difosfato:

  • a) 4 gliceraldehído fosfato (C 3 )

2 fructosa-fosfato (C 6 )

  • b) 2 gliceraldehído fosfato (C 3 ) + 2 fructosa-fosfato (C 6 )

2 eritrosa-fosfato (C 4 ) y 2 xilulosa-fosfato (C 5 ) 2 sedoheptulosa-fosfato (C 7 ) 2 xilulosa-fosfato (C 5 )+ 2 ribosa-fosfato (C 5 )

  • c) 2 gliceraldehído fosfato (C 3 ) + 2 eritrosa-fosfato (C 4 )

  • d) 2 gliceraldehído fosfato (C 3 ) + 2 sedoheptulosa-fosfato (C 7 )

De este modo se utilizaron las 10 moléculas de gliceraldehído-fosfato

para generar

las

6

moléculas de pentosa requeridas (las 4 xilulosas fosfato y las 2 ribosas fosfato son llevadas a 6 ribulosa

fosfato por isomerasas específicas)

Cada glucosa fosfato sintetizada a partir de CO 2 y H 2 O cuesta 12 NADPH y 18 ATP El resultado neto del ciclo de Calvin es la conversión de seis moléculas de dióxido de carbono y una de fosfato en una de glucosa-6-fosfato. Para ello será necesario que se condensen 6 de ribulosa-1,5- difosfato con otras tantas de CO 2 para dar un intermedio inestable (18 carbonos) que se descompone dando lugar a 12 moléculas de 3-fosfoglicerato. Estas 12 moléculas de 3-fosfoglicerato se reducen a 12 moléculas de 1,3-difosfoglicerato con el consumo de 12 ATP y luego se utilizan 12 NADPH para obtener finalmente 12 moléculas de gliceraldehído-3-fosfato. Dos de las doce moléculas de gliceraldehído-3-fosfato son el resultado neto del proceso; las otras diez se reordenan para formar 6 moléculas de ribulosa-5-fosfato. Falta ahora regenerar las seis moléculas iniciales, por lo que se consumen 6 ATP adicionales para pasar la ribulosa-5-fosfato a ribulosa- 1,5-difosfato. La fuente de ATP y NADPH son las reacciones luminosas ocurridas en el tilacoide. En la oscuridad cesa la producción de ATP y NADPH, por lo que también cesa la fijación del CO 2 (de allí el error de denominar “reacciones oscuras” a las reacciones de fijación del CO 2 ). La glucosa-6- fosfato producida es convertida por la fosfoglucomutasa en glucosa-1-fosfato, material de partida para la síntesis del almidón por las fosforilasas.

Fotorrespiración

La rubisco no es específica para el CO 2 , ya que el O 2 compite con éste por el sitio activo de la enzima. Aparentemente la evolución de la rubisco produjo un sitio activo incapaz de discriminar bien entre ambos sustratos, quizás debido a que gran parte de la evolución tuvo lugar antes de que el oxígeno fuese un componente importante de la atmósfera. El problema es que la condensación de la ribulosa--difosfato con el oxígeno no permite la

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fijación de carbono, sino que se forma un intermediario inestable oxigenado que se descompone en una molécula de 3-fosfoglicerato y otra de fosfoglicolato (de dos carbonos). A través de un proceso en el que intervienen tres organelos (el cloroplasto, el peroxisoma y la mitocondria, dos moléculas de glicolato (en total 4 carbonos) son reconvertidas en 3-fosfoglicerato y dióxido de carbono. En el proceso total se consume oxígeno en los tres compartimientos subcelulares (cloroplasto, peroxisoma y mitocondria) y se produce dióxido de carbono, como en la respiración (de ahí el nombre de fotorrespiración), pero el proceso es energéticamente desfavorable. Si bien la fijación del CO 2 es predominante en relación a la fijación del O 2 (alrededor de tres veces), la fotorrespiración es un derroche de energía y puede llegar a inhibir la producción de biomasa hasta en un 50%. Esto ha llevado a que muchas plantas, especialmente de climas cálidos, hayan desarrollado adaptaciones como las que se indican a continuación.

Algunas plantas tienen un mecanismo que impide la fotorrespiración. Plantas C 3 y C 4 Se dice que la mayor parte de las plantas son plantas C 3 , porque el principal producto de la fijación del dióxido de carbono es un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Algunas plantas, llamadas plantas C 4 , son capaces de fijar dióxido de carbono muy eficientemente mediante la formación intermedia de un compuesto de cuatro carbonos, el oxalacetato. De todos modos estas plantas utilizan el ciclo de Calvin para producir carbohidratos, pero primero incorporan el dióxido de carbono en el oxalacetato. Las plantas C 4 , que típicamente crecen en condiciones de altas intensidades luminosas y temperatura, tienen alta velocidad fotosintética, alta velocidad de crecimiento, baja o nula velocidad de fotorrespiración y baja velocidad de pérdida de agua. De hecho, una de las principales diferencias entre las plantas C 3 y C 4 es que estas últimas no se saturan, ni siquiera en presencia de las intensidades de luz más elevadas de la naturaleza. Para ello han modificado su estructura anatómica, en la que el mesófilo (tejido fotosintético) adopta una disposición “en corona” (de allí el nombre de estructura Kranz, “corona”, en alemán) que rodea a las células de la vaina del haz (que a su vez rodean al tejido conductor) y que a diferencia de lo que ocurre en las plantas C 3 son muy ricas en cloroplastos. El ciclo de Calvin se realiza en las células de estas vainas y las reacciones de la vía C 4 se llevan a cabo en las células del mesófilo, dando un claro significado funcional a la diferencia anatómica antes mencionada. La característica esencial de la ruta C 4 es que concentra el dióxido de carbono en la célula. El dióxido de carbono entra en la hoja a través de pequeños poros llamados estomas, los cuales se abren y cierran en respuesta a factores como el contenido de agua y la intensidad de la luz. Cuando los estomas se cierran, el abastecimiento de dióxido de carbono disminuye y en las plantas C 3 la fotosíntesis disminuye de modo considerable. Las reacciones de la vía C 4 incrementan la fijación de dióxido de carbono, de manera que aún en circunstancias adversas, la fotosíntesis, y por ende el crecimiento de la planta, se lleva a cabo con gran eficiencia. Entre las plantas agresivas y de crecimiento rápido que utilizan la vía C 4 se encuentran la caña de azúcar, el maíz, el sorgo y la gramilla. El rendimiento de los cultivos de plantas C 4 es dos o tres veces más alto que el de plantas C 3 . Si este mecanismo pudiera incorporarse por medios genéticos a otras

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 12 fijación de carbono, sino que se forma

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especies vegetales, se podría incrementar de modo importante la producción de alimento en algunas regiones del mundo.

El cometido del ciclo C 4 es simplemente incrementar la concentración de dióxido de carbono dentro de las células de la vaina, de modo que el ciclo C 3 se verifique ahí. La operación del ciclo C 4 sirve para incrementar la concentración de dióxido de carbono dentro de las células de la vaina del haz unas 10 a 60 veces en comparación con la de las células de las plantas que sólo tienen la vía C 3 . BIBLIOGRAFIA

Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, D. Bray, K. Hopkin, K. Roberts y P. Walter (2003). “Essential Cell Biology”. Garland Science, Taylor & Francis Group, New York & London, 2 nd edition.

COOPER, G.M. (2002). La Célula. 2ª edición. Marbán Libros, S.L., España. (traducido de la 2ª edición inglesa, 2000).

LODISH, H., A. BERK, S.L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE & J. DARNELL. Biología Celular y Molecular, Editorial Médica Panamericana, 2002.

Nelson D.L. y M.M. Cox (2001) "Lehninger Principios de Bioquímica", Ediciones Omega S.A.

(versión española de la 3 a. edición inglesa, Worth Publishers, New York). PURVES, K.W., D. SADAVA, G.H. ORIANS & H.C. HELLER (2003) “Vida. La Ciencia de la Biología”, 6ª. Edición. Editorial Médica Panameicana (traducido de la 6ª edición inglesa, 2001).

CUESTIONARIO

  • 1. Las cianobacterias son procariotes y, en consecuencia, carecen de cloroplastos. ¿cómo es posible que se los considere organismos fotosintéticos?

  • 2. ¿El ADN que se encuentra dentro de los cloroplastos es realmente funcional o se trata de un resabio evolutivo?

  • 3. ¿El hecho de contar con un ADN circular y ribosomas del tipo procariote proporciona algún indicio sobre el origen de los cloroplastos?

  • 4. Cuando una célula fotosintética se divide ¿los cloroplastos existentes se reparten entre las células hijas? ¿se reduce el número de cloroplastos en cada división celular?

  • 5. ¿Cuál es la importancia de los pigmentos fotosintéticos? ¿Podría tener lugar la fotosíntesis sin ellos?

  • 6. ¿Qué es lo que se pretende indicar cuando se habla de “espectro de acción de la fotosíntesis”?

  • 7. Engelmann realizó una experiencia iluminando los filamentos del alga filamentosa Spirogyra con las diferentes radiaciones que componen el espectro visible, en presencia de bacterias aerobias. ¿Cuál fue el objetivo de la experiencia y cómo interpretó los resultados obtenidos?

  • 8. ¿Qué es lo que demuestra la experiencia de Hill?

  • 9. ¿Cuál es el resultado de las reacciones luminosas y en qué se utilizan los productos obtenidos?

    • 10. ¿Por qué se dice que es incorrecta la denominación “reacciones oscuras” para referirse a las reacciones de fijación del dióxido de carbono?

    • 11. ¿Qué analogía puede encontrar entre la cadena de transporte electrónico de la cadena respiratoria mitocondrial y los fotosistemas de los tilacoides cloroplásticos?

    • 12. ¿La fotorrespiración fue simultánea con la fotosíntesis o apareció posteriormente durante el curso de la evolución? Fundamente su respuesta

    • 13. ¿Existe alguna relación entre la fotorrespiración y la especificidad de sustrato de la rubisco (ribulosa- bis- fosfato carboxilasa oxidasa, enzima responsable de la fijación del dióxido de carbono)?

    • 14. ¿Cuál es la razón por la que las plantas “C4” son más eficientes que las plantas “C3”?

    • 15. ¿Existe alguna relación entre la estructura de las hojas de las plantas “C4” y el tipo de fotosíntesis que realizan?

    • 16. ¿Qué ocurre cuando se expone a la luz una suspensión de cloroplastos activos en presencia de diclorofenolindofenol (DPIP)? ¿Qué ocurre si en el mismo tubo se ha adicionado un inhibidor de la reacción de Hill?

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18. ¿Qué sustancias acumulan los amiloplastos?

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Módulo 10. TRABAJO EXPERIMENTAL

OBJETIVOS GENERALES

 

Que el alumno:

Verifique la existencia de reacciones fotodependientes (luminosas) en los cloroplastos.

Observe la morfología de cloroplastos y amiloplastos en células vegetales.

Efectúe la extracción y separación de pigmentos fotosintéticos de hojas.

I. OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

OBJETIVO

Las observaciones indicadas tienen como objetivo poder constatar diferencias en la morfología y

distribución de los plástidos según el material que se analice.

  • 1. Cloroplastos en forma de cinta en el alga verde filamentosa Spirogyra

  • 2. Cloroplastos en células del mesófilo adheridas a la epidermis foliar, observados en desgarrado de hojas de hiedra.

  • 3. Cloroplastos en corte transversal de hoja de pera.

  • 3. Amiloplastos de tubérculos de papa observados con y sin agregado de solución diluida de Lugol.

II. FOTOSINTESIS. REACCION DE HILL

OBJETIVO

El objetivo de la experiencia es comprobar la generación de poder reductor durante la etapa lumínica de la fotosíntesis. Como aceptor final de los electrones de la fotólisis del agua se empleará un oxidante artificial (2,6-diclorofenolindofenol, DPIP). Se evaluará el efecto de diferentes factores (oscuridad,

inhibidor de la fotosíntesis y calor) sobre la reacción.

FUNDAMENTO

Se conoce como reacción de Hill a la reacción fotoquímica en la que los electrones provenientes de la fotólisis del agua producen la reducción de un oxidante natural (NADP + ) o artificial (2,6- diclorofenolindofenol, sales férricas, etc.). En el trabajo práctico se pondrá de manifiesto la reacción de Hill que tiene lugar en los cloroplastos. Para ello se utilizará DPIP como oxidante artificial, el que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incolora. Podrá observarse además la formación de burbujas como consecuencia del oxígeno liberado en la reacción.

2 DPIP + 2H 2 O

luz, cloroplastos

BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 15 Módulo 10. TRABAJO EXPERIMENTAL OBJETIVOS GENERALES Que

2 DPIPH 2 + O 2

METODOLOGÍA DEL ENSAYO

Aislamiento de cloroplastos:

Utilizar 8 hojas medianas de espinaca (deben estar bien verdes y turgentes), eliminar los pecíolos y la nervadura central y cortarlas en pequeños trozos. Este procedimiento, así como todos los demás pasos en los que se utilice la suspensión de cloroplastos, deben realizarse en baño de hielo y con soluciones frías para conservar la estructura de los organoides de interés.

En un mortero colocado en baño de hielo poner las hojas cortadas junto con una cucharadita de arena (previamente lavada) y 50 ml de solución fría de sacarosa 0,5 M. Triturar durante 2 a 3 minutos hasta lograr un extractivo de color verde oscuro.

Filtrar el triturado a través de gasa para eliminar restos vegetales groseros.

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Centrifugar el filtrado en 4 tubos durante 5 minutos a 2000 rpm para eliminar el material celulósico. La mayor parte de los cloroplastos quedarán en suspensión en el sobrenadante.

Colectar los sobrenadantes y centrifugarlos durante

10

minutos a 3000

rpm. Descartar

los

sobrenadantes y resuspender suavemente los sedimentos que contienen los cloroplastos en 3 ml de buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 frío, usando una pipeta Pasteur. Reunir las suspensiones de cloroplastos en un único tubo (suspensión A) mantenido en frío hasta el momento de usar.

Experiencias a realizar:

  • a) Colocar una gota de la suspensión A entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio.

  • b) Tomar 3 ml de suspensión A y calentar hasta ebullición durante 2 minutos (suspensión B)

  • c) Rotular cinco tubos (números 1 a 5), para ser utilizados de acuerdo al protocolo siguiente:

 

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3 (*)

Tubo 4

Tubo 5

Buffer fosfatos 0,1 M de pH 7

7ml

7ml

7ml

7ml

7ml

Inhibidor

-

-

-

+

-

Suspensión A

1ml

-

1ml

1ml

1ml

Suspensión B

-

1ml

-

-

-

DPIP

6 gotas

6 gotas

6 gotas

6 gotas

-

Luz

+

+

-

+

+

(*) El Tubo 3 debe estar recubierto con papel de aluminio antes de colocar los reactivos

  • d) Colocar cada uno de los reactivos en el orden listado, manteniendo los tubos en baño de hielo.

  • e) Mezclar bien el contenido de los tubos por inversión de los mismos 2 veces. Para tapar se puede emplear un trocito de polietileno.

  • f) Para exponer los tubos a la luz colocar la gradilla frente a una lámpara de 75 w durante 10 minutos.

  • g) Observar si se produjeron cambios de coloración.

III. EXTRACCION DE PIGMENTOS FOLIARES

OBJETIVO

Se trata de extraer, separar cromatográficamente y diferenciar distintos pigmentos fotosintéticos

liposolubles presentes en células vegetales.

FUNDAMENTO

La acetona permite la extracción de la totalidad de los pigmentos vegetales, tanto hidrosolubles como liposolubles. El agregado de hexano y luego agua al extractivo nos permite separar por partición los pigmentos liposolubles en la capa superior de hexano. Por cromatografía de adsorción en capa fina se logra la separación de las clorofilas (a y b) y los distintos tipos de pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), dado que cada una de estas sustancias presenta diferente polaridad.

METODOLOGÍA DEL ENSAYO

a) Extracción de pigmentos liposolubles

Colocar

en

un mortero

20

ml

de

acetona. Cortar en tiras finas una hoja mediana de espinaca,

colocando las tiras en acetona a medida que son cortadas.

Incorporar al mortero una cucharadita de arena lavada. Triturar y macerar con ayuda del pilón el material vegetal durante 5 minutos, reponiendo la acetona en caso en que se evapore en exceso.

Filtrar por papel el extracto resultante a un tubo de ensayo grande o probeta.

Agregar al extractivo acetónico obtenido 1 ml de hexano y mezclar bien.

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Adicionar 40 ml de agua a la mezcla hexano-acetona, mezclar con suavidad para no emulsionar y dejar separar las dos fases que se han formado.

Empleando una pipeta Pasteur con tetina separar la fase superior, la que se recibe en un tubo de Kahn, que constituye la muestra para las cromatografías. Esta muestra debe estar totalmente exenta de agua ( no opalescente) .

b) Cromatografía en capa fina

Solventes

hexano hexano-acetona (80:20) acetona

Siembra y desarrollo de la cromatografía

Colocar

2

ml

de

solvente

de

desarrollo

en

el frasco

tipo Borrel que

servirá de pequeña cuba

cromatográfica.

 

Colocar 3 gotas del extractivo en el punto de siembra, el que estará situado cerca del borde inferior

de la placa, pero a una altura tal que no quede sumergido al introducirlo en la cuba. El solvente debe evaporarse luego del agregado de cada gota.

Introducir la placa sembrada dentro de la cuba cromatográfica, taparla y dejar ascender el solvente hasta que el frente del mismo esté a 0,3 cm del borde superior.

Comparar los cromatogramas obtenidos con los distintos solventes de desarrollo a los efectos de seleccionar el que permita obtener una mejor resolución

Analizar los resultados obtenidos.

 

Nota: las placas deben activarse en estufa durante 1 hora a 110 o C y luego mantenerse en desecador antes de ser utilizadas.