PRACTICA IV -Enterobacterias1.- Que bacterias pertenecen ellas?

Alishewanella Alterococcus Aquamonas Aranicola Arsenophonus Azotivirga Blochmannia Brenneria Buchnera Budvicia Buttiauxella Cedecea Citrobacter Dickeya Edwardsiella Enterobacter Erwinia a la familia de las Enterobacterias enumere cada una de Escherichia Ewingella Grimontella Hafnia Klebsiella Kluyvera Leclercia Leminorella Moellerella Morganella Obesumbacterium Pantoea Paracolobactrum Pectobacterium Phlomobacter Photorhabdus Plesiomonas Pragia Proteus Providencia Rahnella Raoultella Salmonella Samsonia Serratia Shigella Sodalis Tatumella Trabulsiella Wigglesworthia Xenorhabdus Yersinia Yokenella

2.- Cuales son las Enterobacterias de importancia industrial? Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentacin cida mixta butanodilica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3butanodiol. Como paso intermedio de la ruta se produce acetona que puede servir para la identificacin de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reaccin de VogesProskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter. 3.- Dentro de las Enterobacterias cules son las de inters clnico? Salmonella Escherichia Yersinia (Peste) 4.- Escriba las caractersticas de cada una de las Enterobacterias. Grupo I Escherichia Escherichia coli es la especie ms aislada y ms conocida pero se compone de otras 5 especies. Son un conjunto heterogneo de cepas de las cuales la mayora no son patgenas, sin embargo, existen patgenos oportunistas que producen como enfermedades ms habituales:

gastroenteritis infecciones del tracto urinario En menor medido tambin pueden producir un tipo de meningitis muy grave pero poco frecuente en recin nacidos y septicemias en inmunodeprimidos. Gastroenteritis Existen distintos tipos de cepas:

E. colienterotoxignica (ECET) Genera toxinas. Produce una diarrea parecida al clera pero mucho menos grave, es la conocida como diarrea del viajero. Tambin causa gastroenteritis en nios pequeos que puede ser grave siendo causa de muerte en nios del Tercer Mundo. Se produce por beber agua contaminada. E. colienteroinvasiva (ECEI) Provoca una gastroenteritis con fiebre, retortijones, heces con sangre. Invaden el epitelio intestinal destruyndolo. Para su identificacin qumica se realiza la prueba de Sereny, por la cual se inocula el ojo de una cobaya y si desarrolla conjuntivitis quiere decir que es esta cepa. E. colienteropatognica (ECEP) Histricamente es muy importante, provoca diarrea infantil que en los pases subdesarrollados es causa de muerte. Se adhiere a las fibras intestinales y se cargan las microvellosidades, son bacterias enteroadherentes. E. colienterohemorrgica (ECEH) Producen una toxina parecida a Shiga y se llama verotoxina. Puede provocar desde diarreas leves hasta colitis hemorrgicas, incluyendo el sndrome hemoltico urmico (HUS) consistente en insuficiencia renal y anemia severa. ste es provocado por una cepa emergente aislada a principios de los aos 80 llamada O157:H7 siendo una de las causas de brotes epidmicos de gastroenteritis en pases desarrollados. Se puede contraer por tomar carne de ternera contaminada poco hecha, leche sin pasteurizar y en general, alimentos crudos. Tambin se puede contraer por beber o nadar en aguas contaminadas. Esta cepa fue responsable de la crisis del pepino que produjo en Alemania ms de 30 muertos y que finalmente no se hallaba en el pepino espaol sino en brotes de soja plantados en Alemania o gramneas procedentes de Egipto. Infecciones del Tracto Urinario Son cepas de E. coliuroptogenas que por lo general son virulentas porque poseen adhesinas que les permite fijarse en el tracto urinario y llegar al rin causando pielonefritis que puede ser muy grave ya que pueden derivar en septicemias. Tambin es causa de UTIs mal tratadas que son muy frecuentes en mujeres de edad frtil. Salmonella Es un gnero muy relacionado con Escherichia ya que comparten alrededor del 50% de la secuencia de ADN pero son casi todas patgenas de humanos y animales de sangre caliente. Salmonella enterica

Es una especie de la que existen ms de 1500 serotipos distintos, en clnica se llaman con el nombre del serotipo pues cada serotipo genera una enfermedad diferente. Se encuentra en todos los animales: aves, reptiles, vacas, animales domsticos El reservorio de Salmonella se mantiene por contacto entre animales y por consumo de piensos contaminados. Salmonella typhi y Salmonella paratyphi Se transmiten por ingestin de alimentos o aguas manipulados por gente contaminada (higene). Para el resto de las especies se contrae infeccin por agua o alimentos contaminadas y en nios pequeos por contaminacin oral-fecal. La mayor parte de los casos son nios en la estacin clida o que han ingerido alimentos que hayan estado al aire libre. Los huevos, carne de ave y por productos lcteos. Se dan ms casos por el consumo de huevos crudos o poco cocidos porque Salmonella se encuentra en el intestino de las gallinas. En USA se dan 50.000 casos todos los aos. Los ms graves se refieren a nios pequeos y a ancianos. Para que se desarrolle la enfermedad es necesario ingerir una gran cantidad de Salmonella, del orden de 108 individuos aunque en el caso de nios, ancianos, inmunodeprimidos y personas con menor acidez en el estmago se necesita una menor dosis. En los meses clidos se da una mayor incidencia porque permiten la reproduccin de las bacterias con mayor facilidad. El tratamiento mejora con antibiticos. Enfermedades Salmonellosis Enteritis: Se produce de 6 a 48 horas despus de consumir el alimento, provoca dolor de cabeza, fiebre, diarrea y vmitos. Su duracin es de una semana y desaparece por s misma pues no responde a antibiticos sino que el tratamiento es sintomtico. El problema es que puede derivar en septicemia y puede darse en nios y ancianos. Fiebres tifoideas (S. tiphy) y paratficas (S. paratyphi): son graves y su mortalidad es del 20% si no se tratan. Se contraen por ingerir alimentos contaminados por personas. Los sntomas aparecen despus de 10-14 das. Las bacterias penetran en el intestino liberando LPS que provoca picos de fiebre. Es muy importante en el Tercer Mundo. Puede ocurrir que sean mantenidas en portadores humanos por colonizacin asintomtica en el 1 a 5% de los casos y puede durar hasta un ao o mucho ms. El rgano donde se acantonan es en la vescula. Existen muchas Salmonellas resistentes a antibiticos porque a las aves de granja se les suelen proporcionar en gran cantidad. Shigella Es otro gnero muy relacionado con E. coli. Existen varias cepas al igual que en el caso de Salmonella. Son responsables de casos de disentera bacteriana: diarrea con sangre y mucosidad. Es muy frecuente en pases del Tercer Mundo por ingestin de agua contaminada. La dosis infectiva es muy baja, con 200 bacterias ya es posible contraer la infeccin. Son muy resistentes al paso por el estmago. Es un peligro en el hielo de pases subdesarrollados. En pases desarrollados es bsicamente una enfermedad peditrica de las guarderas por contaminacin oral-fecal. En adultos es autolimitada pero en nios y ancianos es muy

grave porque provoca HUS y complicaciones neurolgicas que pueden conducir a la muerte. Esta bacteria coloniza el intestino grueso y no hace nunca septicemias. Es patgena porque es intracelular y puede pasar de una clula a otra sin pasar por el medio extracelular debido a las toxinas invasivas y la toxina shiga que est relacionada con el HUS y no con la disentera normal. GRUPO II Estas bacterias realizan la fermentacin butanodilica. Enterobacter En suelos y aguas y, a veces, en el intestino. Relacionadas con estas bacterias son Klebsiella que fija N2 y cuya especie K. pneumoniae provoca neumona. Serratia Produce prodigiosinas que son pgimentos y son pirroles que estn en clorofilas y hemoglobinas pero no se sabe muy bien cul es su funcin. Erwinia Son patgenos de plantas. GRUPO III Proteus-Providencia La mayora son de vida libre aunque hay algn Proteus patgeno. Es ureasa + lo que quiere decir que hidroliza urea. En caso de ser patgenas provoca infecciones del tracto urinario y del rin. Son muy rpidas movindose y crece en oleadas (en placa de cultivo se puede ver como crculos concntricos). GRUPO IV Yergsinia Es un grupo con siete especies de las cuales tres son patgenos muy importantes de humanos y animales. Y. pseudotuberculosis Provoca una enfermedad parecida en animales. Y. enterocolitica Provoca enterocolitis, se da especialmente en Escandinavia y en las zonas fras de Amrica. Y. pestis Es la responsable de la peste negra. Su reservorio se mantiene en poblaciones de roedores especialmente las ratas de las ciudades. Se transmite por las picaduras de las pulgas, en sta se ubican en el intestino parando la digestin, aumentando la sensacin de hambre y por tanto que piquen ms. En el siglo XIV fue muy grave debido a que Europa estaba en muy malas condiciones higinicas. En la actualidad no est erradicada pues se encuentra en otros hospedadores salvajes como ardillas, conejos, perrillos de las praderas En general provoca dos tipos de infecciones: peste bubnica y la peste neumnica. El sistema inmunitario de las personas se activa, y al estar las clulas en cpsulas se disemina con mayor facilidad. Peste bubnica

Se forman bubones (o bubas) que son los ganglios inflamados muy dolorosos que provocan hemorragias subcutneas provocando la piel negra. La tasa de mortalidad es del 60% si no hay tratamiento en 3-5 das. Peste neumnica Se pasa de persona a persona por los aerosoles. Asol Europa pues su tasa de mortalidad es del 90%. Actualmente es tratable y curable con estreptomicina y tetraciclina. 5.- Cmo hara la identificacin en el laboratorio de la familia de las Enterobacterias? La identificacin requiere la realizacin de pruebas bioqumicas y de serotipificacin, de distinta complejidad, dependiendo de la capacidad del laboratorio. Es conveniente que los laboratorios con menores disponibilidades enven las cepas aisladas a laboratorios de nivel intermedio (provinciales y/o regionales), para completar las pruebas bioqumicas y realizar pruebas de serotipificacin. A su vez el Laboratorio Nacional de Referencia realiza las pruebas bioqumicas de mayor complejidad y pruebas de serotipificacin complementarias. Para el aislamiento se utilizan medios diferenciales y selectivos como: agar MacConkey (MC),agar Eosina Azul de Metileno (EMB), agar Salmonella Shigella (SS), agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),agar Hektoen (HE), agar verde brillante (BG). Las placas se incuban a 37C durante 18 a 24 horas y se observan colonias, de 2 mm de dimetro, con las caractersticas indicadas en la Tabla 1.

6.- Que son las pruebas primarias y en qu consisten.

Para la identificacin de las bacterias en el laboratorio es importante conocer sus caractersticas morfolgicas, la reaccin a la tincin de Gram, agrupacin, propiedades, morfologa colonial, reacciones metablicas como produccin de enzimas y reacciones de xido-fermentacin. La identificacin bacteriana primaria se basa en los siguientes puntos: Tincin de Gram: Revela la forma de la bacteria, agrupacin y grupo taxonmico al que pertenece: Gram positivo o Gram negativo. Tincin de Ziehl Neelsen: Las bacterias Alcohol-cido resistentes (BAAR), son difciles de cultivar, tal vez y en un agar sangre muestre algo de crecimiento, por eso es til esta tincin de identificacin primaria. Tincin de esporas: La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los gneros Bacillus y Clostridium.

Prueba de catalasa: La catalasa es una enzima que descompone al perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al gnero Streptococcus y algunos otros la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo. El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia. Ejemplos: Catalasa (+): Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp. Catalasa (-): Streptococcus spp.

Prueba de oxidasa: Bsicamente es la deteccin de la enzima oxidasa, muy til en la identificacin de bacterias Gram (-). La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxgeno molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de electrones.

El sistema de citocromos est generalmente presente en organismos aerbicos. Un resultado positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente autooxidable del sistema de citocromo es al final catalizado. Utilizando un tubo capilar con tetrametil-pphenylendiamina al 1%, se adiciona una pequea cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones: una reaccin positiva (presencia de oxidasa) se indica por la apariencia de un color prpura obscuro en el papel, en menos de 10 segundos; al contrario una reaccin negativa, que consiste en una ausencia de color prpura, indica segn los ejemplos: Oxidasa (+): Pasteurella multocida Oxidasa (-): Escherichia coli

cido de la Glucosa: La mayora de las bacterias de inters mdico usan la glucosa como fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo cido y/o gas a partir de dicho carbohidrato. En un tubo con agua peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitacin teniendo cuidado de no mover el tubo de Durham e incubndolo 24 horas y 37C se obtienen los siguientes resultados.

Si la bacteria usa la glucosa producir cido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observar rosa, si produce gas, se observar una burbuja en el tubo de Durham. Ejemplos: cido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli Negativo a produccin de gas: Proteus stuartii.

Prueba de O/F: para realizar esta prueba se usa el medio bsico de Hugh y Leisfon con un pH de 7.1. Es un medio semislido de color verde que se inocula por picadura, contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro con acetie o vaselina sellndolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37C por 24 horas, obtenindose: TUBO ABIERTO TUBO SELLADO INTEPRETACIN

Amarillo

Verde

Oxidacin (aerobio)

Amarillo (anaerobio facultativo) Amarillo

Fermentacin

Verde (anaerobio estricto)

Amarillo

Fermentacin

Verde

Verde

Negativo (NH3)

Prueba de Motilidad: Llamada tambin de la gota suspendida. Algunas bacterias son mviles por presentar flagelo, los flagelos son encontrados principalmente en las formas bacilares y pueden presentarse en nmero y posicin variados(monotricos, peritricos, etc.). La base de esta prueba es determinar si la bacteria es mvil o inmvil. Con un asa de inoculacin se le coloca a un cubreobjetos un poco de muestra y se le agrega una gota de agua destilada. Se coloca sobre un portaobjetos y se observa al microscopio. Podremos observar si las bacterias tienen movimientos rectilneos o curvos y en todas direcciones. Ejemplos: Motilidad (+): como en Pseudomonas auruginosa. Motilidad (-): como en Pasteurella multocida.

7.- Cuales son las pruebas secundarias y en qu consisten cada una de ellas.
La identificacin se fundamenta en la comparacin del microganismo que deseamos identificar con los microorganismos de identidad conocida. La exactitud de la identificacin depende de la eficacia del trabajo preparatorio as como su grado. Estas pruebas se clasifican de la siguiente manera: Simples: Citrato, Malonato, MR-VP, Nitrato y Leche Tornasol. Mltiples: TSI, LIA y SIM. Especiales: Coagulasa, Hialuronidasa y Acriflavina

8.- Dentro de la identificacin cual considera usted que de manera rpida le servira a usted para hacer la identificacin de una bacteria. Yo utilizara tincin de Gram, ya que las enterobacterias se caracterizan por ser Gram negativas 9.- Si le enviarn a usted una muestra para analizar a el laboratorio cul sera la metodologa que seguira usted para hacer la identificacin y el aislamiento. METODO EXPERIMENTAL
Cepa bacteriana

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

Gram

1.- bioqumicas primarias EMB MC SS XLD SB 2.- bioqumicas secundarias Comparar la morfologa colonial en estos medios Identificacin con tablas

1 OF, catalasa, oxidasa y motilidad 2 NO3, indol, MR-VP, citratos, TSI, malonatos, H2S ,Urea, descarboxilacin de lisina, ornitina, arginina 10.- Cual es material que se utilizara para realizar esta prctica. Medios de cultivo y bioqumicas: 1 placa de AST o BHI 1 placa de Bilis Rojo Violeta (BRV) 1 placa de MacConkey (MC) 2 tubos de OF 1 placa de Eosina Azul de 1 tubo con Nitratos Metileno (EMB) 1 tubo con SIM 1 placa de Sulfito Bismuto (SB) 1 tubo con MR VP 1 placa de Xilosa Lisina 1 tubo con Citratos Desoxicolato (XLD) 1 tubo con Urea 1 placa de Salmonella Shigella (SS) 1 tubo con Malonatos 1 placa de Desoxicolato Citrato 1 tubo con TSI (DC)

 1 tubo con MIO 1 tubo con caldo arginina Material Biolgico Antisueros VS enterobacterias E. Coli Salmonella Shigella Otros Mechero Microscopio Asa bacteriolgica Agua destilada estril Cubre objetos Portaobjetos REACTIVOS Perxido de hidrogeno 30% Tiras reactivas (oxidasa) Aceite mineral Reactivo de Kovack o Erlichs Rojo de metilo KOH 40% Alfa-naftol Alfa-naftilamina Ac. Sulfanilico Colorantes de Gram

1 tubo con LIA