Aula terica n 12 de Microbiologia Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Bactrias Anaerbias Parte I

Aspectos gerais das infeces por bactrias anaerbias. Diagnstico laboratorial das infeces por bactrias anaerbias. Aula dada por: Prof. Accio Rodrigues. 7 de Novembro de 2006

Bactrias: - Aerbias obrigatrias: exigem O2 como aceitador terminal de electres - Aerbias facultativas: crescem em aerobiose e so capazes de obter energia pela fermentao de compostos orgnicos. Existe todo um espectro contnuo de capacidades de tolerar O2 que vai desde o extremo do aerbio obrigatrio at ao anaerbio estrito. - Anaerbias obrigatrias/estritas: no so capazes de fixar O2 e este francamente inibidor do seu crescimento. Podem ser classificadas em: - extremamente sensveis: as verdadeiras anaerbias estritas, porque no toleram concentraes de O2 > 0,5% por mais que uns minutos - moderadamente sensveis: toleram concentrao de O2 at 2-8%. Podem no se conseguir multiplicar na presena de O2, mas, pelo menos, no morrem. Toleram estes nveis cerca de 15 a 20 minutos.

(No entanto, o professor no faz grande questo nesta distino. No exame podemos considerlas a todas como anaerbias obrigatrias/estritas.)

Os tais anaerbios obrigatrios estritos, os extremamente sensveis, so tipicamente membros das nossas populaes microbianas normais isto um aspecto muito importante. Os moderadamente sensveis so os principais agentes de infeces humanas, o que lgico: tm uma maior capacidade de adaptao, tolerando por um certo perodo de tempo eventuais concentraes de O2 que estejam presentes.

E porque motivo o O2 txico para estas bactrias? O O2 txico para qualquer clula viva, quer seja procaritica ou eucaritica. Por exemplo, se se ventilar um pulmo humano a uma concentrao de O2 de 100% durante algumas horas, durante alguns dias, ele ficar totalmente fibrosado. Porqu? O O2 gera radicais que so extremamente deletrios. Um radical ao qual se d grande importncia o anio super-xido O22-: porque capaz de quebrar DNA, inactiva muitas enzimas bacterianas e extremamente txico para os lpidos da membrana. O que se sabe que as bactrias aerbias produzem determinadas enzimas que so capazes de quebrar estes radicais livres: catlase, peroxdase, dismutase do super-xido.

O que fazem: O22- + H2 (Dismutase do super-xido) H2O2 (que tambm txico) (Catlase/Peroxidase) O2 + H20

Quando se comearam a cultivar e a estudar bactrias anaerbias surgiu a noo, um pouco emprica, de que o O2 lhes seria nocivo, porque no teriam estas enzimas. E 1971, McCord diz que as bactrias anaerbias geralmente no produzem catlase e nunca produzem dismutase do super-xido. Isto uma daquelas verdades que no o a 100%, mas vulgarmente aceite. um conceito bastante arreigado, no produz problemas clnicos, nem causa de erros de tratamento, mas, ainda assim, no totalmente verdade. E porqu? Em relao a: - Catlase: demonstrada a produo de catlase em espcies de Bacterides, Peptoestreptococcus e Propionibacterium (que so anaerbias estritas); no se correlaciona com a tolerncia ao O2 - Peroxidase: no foi definitivamente demonstrada a produo significativa de peroxidase em bactrias anaerbias estritas. - Dismutase super-xido: Produo induzida por exposio ao O2 (ex. Bacteroides): est reprimida, mas quando a bactria entra em contacto com o O2, ao fim da 2 ou 3 gerao, as clulas filha j so capazes de a exprimir Eubacterium limosum e Clostridium oroticum (por curiosidade, porque ningum vos vai perguntar isto no exame) produzem quantidades significativas desta enzima, mas so incapazes de sobreviverem em aerobiose.

De um modo geral, o teor da dismutase do super-xido maior em bactrias gram- que gram+. E da existir uma correlao com o grau de tolerncia ao O2 nas anaerbias obrigatrias moderadas esta uma verdade clnica, que no totalmente verdade, mas que serve para calar as nossas conscincias clnicas. Uma coisa muito importante o Potencial de oxi-reduo do meio, que tem a ver com a electro-negatividade do meio. P.ex.: se o meio for muito electro-negativo, ou seja, bastante reduzido, possvel fazer-se crescer anaerbias estritas num meio de cultura lquido onde est diludo O2 (como aquelas pedras difusoras de aqurio), ou seja, esto expostas ao O2 e conseguem crescer. evidente que este meio electro-negativo difcil de atingir num meio de cultura convencional em laboratrio e quase impossvel existir in vivo, mas algo que contribui e pode explicar porque que as anaerbias estritas mais sensveis so capazes de sobreviver em locais onde esto expostas ao O2, como, por exemplo, no suco gengival das superfcies dentrias porque estes meios sero mais electro-negativos.

Distribuio de bactrias anaerbias no corpo humano

Elas existem em quase todos os locais em que existem populaes microbianas autctones, ou seja, em quase todo o lado. Na boca: na superfcie dentria existe 1 bactria anaerbia para 1 aerbia (1:1), enquanto no suco gengival, a proporo de 1000:1, o que semelhante, deste ponto de vista, ao clon ( horrvel dizer isto desta maneira, mas verdade). O estmago tem poucas bactrias devido ao seu pH cido, mas o seu nmero vai aumentando medida que se vai progredindo no intestino. No aparelho genital feminino existe uma razo elevada de anaerbias em relao s aerbias (3 a 5: 1).

Incidncia de diferentes estirpes anaerbias nas populaes microbianas autctones

Aqui esto enunciados alguns dos principais gneros de anaerbias, usando-se um sistema de classificao de 0 a 2 da sua localizao por sistemas. Existe uma grande quantidade de gneros, quer gram+ e gram-, no aparelho respiratrio e no intestino, no aparelho genital e at na pele, p.ex. a Propionibacterium (a P. acnes est muitas vezes envolvida na patognese do acne).

Fazendo uma smula: as bactrias anaerbias predominam francamente em relao s bactrias aerbias (tanto obrigatrias como facultativas). Logo, a maioria das infeces por anaerbias tm origem endgena, so verdadeiros cavalos de Tria (patogneos oportunistas): estas bactrias produzem infeco quando se espalham do seu local normal para locais usualmente estreis. Isto implica que, se partida soubermos quais os organismos que fazem parte das populaes microbianas autctones, conseguiremos prever qual a entidade dos agentes responsveis pela infeco, em funo dos locais onde eles surgem ou dos locais adjacentes. Isto

pe ento de parte a teoria da muralha da China, pois os microorganismos j esto dentro de ns.

E quais as doenas que provocam? A lista no para saber de cor, mas nela temos a percentagem de casos da doena provocados por bactrias anaerbias. Por exemplo, o abcesso cerebral provocado em 89% dos casos por bactrias anaerbias.

tpico

das

bactrias

anaerbias

produzir infeces necrotizantes, com abcessos. P.ex. uma meningite, que uma infeco que no envolve

formao de abcesso, raramente provocada bacteriemia sangunea), por anaerbias. da Uma

(infeco s numa

corrente

percentagem

significativamente mais baixa que provocada por anaerbias (5 a 20%) e, quando o faz, em 20% dos casos porque secundrio a infeces que j existem, p.ex., secundria a um abcesso pulmonar. As infeces do aparelho urinrio so menos que 1%.

Isto faz-nos perceber pistas para uma infeco por bactrias anaerbias: odor ptrido da leso ou descarga, porque as anaerbias produzem aminas biognicas (putrescina ou cadaverina que d o cheiro aos cadveres)

 localizao do foco infeccioso prximo a superfcie mucosa: as anaerbias fazem parte das populaes das superfcies mucosas e imaginemos que esta foi invadida, devido a uma leso perfurante e introduziu directamente as anaerbias nos tecidos profundos, que tm menos quantidade de O2, logo, elas vo ter ptimas condies para proliferarem necrose tecidular formao de abcesso infeco secundria a mordedura humana ou animal - se calhar vm, por dia, ao Hospital de So Joo, mais casos de mordeduras humanas que animais gs nos tecidos ou no exsudado sensao de crepitao tromboflebite sptica

Aspectos mais clnicos: quadro clssico gangrena gasosa: d-se uma ferida perfurante e rapidamente comea a haver um foco infeccioso, que progride em poucas horas. Tem tambm sinais de crepitao e em 100% dos casos causado por anaerbias teraputica com aminoglicosdeos / antimicrobianos de largo espectro alteram profundamente as populaes microbianas normais: as razes entre anaerbias e aerbias (normalmente de 1:1) desequilibram-se, pois as aerbias morrem, logo as anaerbias comeam a proliferar imenso e causam infeco fluorescncia avermelhada com luz U.V. (Bacteroides ou Porphyromonas) presena de gros de enxofre (amarelados) no exsudado (Actinomyces) culturas negativas em aerobiose, quando houve prvia observao de microrganismos (ex.: em esfregao)

Diagnstico Laboratorial
1. Procedimentos recomendados para a colheita de amostras Regras gerais: - por aspirao com agulha e seringa principalmente quando se trata de abcesso - amostra de tecido por bipsia ex.: tecido necrosado (O ideal que fosse sempre assim)

- Zaragatoas: devem ser, sempre que possvel, rejeitadas (h quem diga que as zaragatoas no deviam entrar num laboratrio de microbiologia, mas devo-vos dizer que se fosse assim se calhar o laboratrio no fazia mais do que 50% dos diagnsticos de infeces por anaerbios so um mal necessrio). Porque devem ser rejeitadas: so mais susceptveis de serem contaminadas: ao passar a zaragatoa posso contamin-la com membros da populao microbiana normal de reas adjacentes

 ficam mais expostas ao O2 ambiente e dissecao colhem um pequeno volume de produto para amostra ( difcil recolher o produto a partir da zaragatoa). Alm disso, a zaragatoa no consegue penetrar num abcesso, logo, h que drenar o abcesso, o que o expe ao ar e, alm disso, se o exsudado purulento escorrer sobre outros tecidos, a amostra est a ser contaminada por microorganismos desse local. Ao ser mergulhada no exsudado, a zaragatoa vai absorver uma quantidade muito menor do que o que seria aspirado por uma seringa. no permitem a preparao de um bom esfregao

Os livros tradicionalmente dizem que so amostras inaceitveis por parte de um laboratrio, principalmente aquelas que vem de locais intensamente habitados por anaerbias: - Zaragatoas nasais ou da orofaringe - Zaragatoas gengivais - Expectorao expectorada (o meio mais habitual de recolha para diagnstico) - Expectorao colhida por aspirao oro- ou nasotraqueal contamina-se ao passar na via area superior - Expectorao colhida por broncoscopia, quando o cateter no tem a ponta protegida o broncoscpio que, ao descer, antes de chegar aos bronquolos, contaminado nas vias areas superiores. O broncoscpio de ponta protegida consiste em: recoberto na ponta por uma cpsula de gelatina (material biodegradvel e inofensivo), que ejectada quando est no local onde se recolhe as secrees e rapidamente degradada (no obstrui brnquios, no causando atelectasias) s neste caso possvel aceitar a amostra. A alternativa a puno transtorcica guiada por ecografia at ao stio onde est o abcesso ou a necrose pulmonar. - Contedo gstrico ou do intestino delgado (excepto no sndrome em ansa cega em que o intestino est ocludo nas duas extremidades) - Contedo intestino grosso, de ileostomias, de colostomias ou fezes (excepto suspeita de C. difficile ou C. botulinum agentes especficos de diarreia por anaerbios) - Urina colhida por mico ou por sonda de Folley (algaliao) tem que ser feita puno suprapbica - Zaragatoas vaginais ou cervicais - Amostras colhidas da superfcie de lceras de decbito, de feridas, escaras ou fstulas muito contaminadas e muito expostas ao O2 - Amostras colhidas em zonas adjacentes pele ou a membranas mucosas que no tenham sido devidamente descontaminadas

2. Transporte da amostra fundamental para qualquer diagnstico microbiolgico

Deve ser rpido e adequado, de forma a preservar a viabilidade das bactrias e as propores relativas das populaes bacterianas nos produtos, pois destes depende o sucesso do isolamento correcto dos anaerbios presentes na amostra. Regras gerais: - As amostras, durante o transporte at ao laboratrio, devem ser mantidas a 37C - Evitar a refrigerao das amostras existe diminuio do n de microrganismos viveis Ex.: a urina tolera algumas horas em refrigerao a 4C (na porta do frigorfico) isto um conceito arreigado nos cuidados de sade, mas o problema que se expe diferentes produtos ao mesmo tipo de refrigerao, o que no bom, porque nenhuma bactria gosta de ser refrigerada. As bactrias da urina esto num meio de cultura de rico, logo conseguem resistir mais tempo, mas os anaerbios so extremamente sensveis ao frio. Logo, nunca se devem refrigerar amostras

Em condies ideais, a amostra ser enviada ao laboratrio numa atmosfera anaerbia, hmida e temperatura ambiente. Recorre-se a um dispositivo e/ou meio de transporte, quando se prev um atraso superior a 15-20 minutos entre a colheita e o processamento ou quando se utilizou uma zaragatoa. So geralmente constitudos por um meio semi-slido pr-reduzido e esterilizado em recipiente prprio, com uma atmosfera sem oxignio e que contm um indicador de oxidaoreduo. O problema que estes esto desenhados (por parte dos fabricantes) para o transporte de zaragatoas, logo acaba por ser mais fcil e mais prtico recolher amostras e transport-las com zaragatoas.

Na prtica diria um volume de 2 ml ou mais, em seringa com agulha ocluida, tolera 1 ou 2 horas temperatura ambiente, mas: tal depende do agente implicado e existe o risco de picada acidental quando o tcnico oclui a seringa com uma rolha de borracha. Alm disso, no se deve dobrar agulhas (entra na mesma O2 para a amostra) uma grande amostra de tecido (ex.: perna amputada) mantm os microrganismos viveis durante algumas horas, mas deve-se: - Recorrer a dispositivos e meios de transporte no entanto * muitos so incompatveis com certas amostras, principalmente bipsias * a maioria foi concebido para transporte de zaragatoas mas nestas no ser possvel ver a fluorescncia, tpica dos anaerbios, que vem nos livros.

Passos Intralaboratoriais
3. Exame directo da amostra

3.1 Exame macroscpico Normalmente quem o faz o clnico: recebe a zaragatoa (que normalmente diz pouco), mas pode encontrar pistas sobre a natureza e a qualidade da amostra Sugerem a presena de bactrias anaerbias as mesmas coisas que existem nos locais de leso: - purulncia - odor ptrido - tecidos necrosados - ps com gros de enxofre Mas muitas vezes difcil identificar estas caractersticas, porque a zaragatoa j est mais seca e perde parte do cheiro. Pode-se tambm fazer: - Exame com luz U.V. (360 nm): pesquisa de fluorescncia - Vermelho tijolo: Bacteroides pigmentados A seguir devemos passar ao

3.2 - Exame microscpico - Esfregao corado pelo gram: em conjuno com os dados clnicos, o exame laboratorial mais til: Imaginem que aparece ao microbiologista um administrador de hospital que fosse muito minimalista em termos de custos e lhe dissesse: O senhor s pode fazer um nico teste de diagnstico, para quem tem experincia em identificar anaerbios isto parece uma aberrao, mas responderia assim: A nica coisa que eu quero ento poder preparar um esfregao e corlo pelo Gram. Quero ver tambm o que se passa com o doente, qual o aspecto da leso, dos exsudados, da bipsia Eu considero isto uma atitude muito fundamentalista, tpica de um microbiologista que trabalhou muito com anaerbios, que tem muita experincia, mas que pertence 2 gerao de bacteriologistas, ou seja: um de 1 gerao j ficava contente em saber que se encontrava diante de anaerbios, o de 2 gerao, usando os mtodos culturais clssicos, era j capaz de chegar a uma identificao definitiva, mas j ficaria contente se chegasse identificao de anaerbios. O de 3 gerao usa j mtodos de biologia molecular, no culturais. Embora as anaerbias, tal como as aerbias, sejam bacilos e cocos e corem de mais ou menos rosa, azul ou arroxeado, elas tm um aspecto um pouco diferente, o qual, para quem tem sensibilidade, consegue identific-las como sendo anaerbias. Da que se consiga observar a morfologia tpica de muitas bactrias, como: Bacteroides: bacilo gram-, plido, pleomrfico Fusobacterium: bacilo fino, gram-, fusiforme Veillonella: diplococo pequeno, gram- (costumo dizer que so a verso anaerbia da Neysseria) Actinomyces: bacilo gram+ (no coram muito), em grupos, ramificaes

Existem bactrias Gram variveis: so bactrias filhas da mesma clula, ou seja, so da mesma colnia, tm a mesma estrutura (contedo de peptidoglicano da parede), mas coram de maneira diferente: umas Gram+ e outras Gram-. Tal no se deve a serem mais velhas ou a terem condies de cultura diferentes. Estas bactrias so sempre anaerbias, da que o esfregao de Gram tenha importncia na sua identificao.

Em alternativa, em meados dos anos 80 surgiu um mtodo muito promissor, que seria usar anticorpos monoclonais especficos contra determinada bactria directamente no esfregao, produzindo-se Imunofluorescncia. No entanto, estes anticorpos mostravam especificidade um pouco duvidosa, o que diminui a sensibilidade do mtodo. Actualmente, so s utilizados em laboratrios de referncia/investigao, pois tm custos elevados e no substituem a cultura (devido aos seus falsos positivos e negativos).

3.3 - Outros procedimentos

- Anlise directa cidos gordos cadeia curta por cromatografia gs-lquida (GLC) um dos mtodos de referncia para a identificao de isolados em meio de cultura. Contudo houve algum que se lembrou de us-lo directamente na amostra: no entanto, nunca obteve grandes resultados, pois as bactrias normalmente existem em pouca quantidade na amostra e existe uma grande mistura de bactrias. que, ao contrrio das infeces por aerbias, as infeces por anaerbias so tipicamente polimicrobianas, ou seja, existem vrias bactrias que actuam em conjugao para produzir a infeco: p.ex., numa infeco urinria por E.coli (aerbia facultativa), existe um predomnio claro (podem aparecer outras bactrias, arrastadas pela uretra, mas identifica-se claramente a E.coli como agente infeccioso), enquanto que quando algum tem um abcesso pulmonar, uma pneumonia necrotizante ou um abcesso cerebral, tem ali uma mistura de bactrias Gram + e -, cocos e bacilos e de vrios gneros, acabando por ser o conceito de a unio faz a fora que prevalece: populaes microbianas normais aproveitam um desequilbrio do sistema, ou foram introduzidas em locais com baixa tenso de O2, proliferando em conjugao uns com os outros. Da que toda esta variedade de bactrias, em conjunto com a existncia de material purulento, faz com que este mtodo seja pouco sensvel. Sendo tambm dispendioso, no utilizado no diagnstico de anaerbios. Contudo, tem algum valor nas infeces do Sangue, pois estas so normalmente monomicrobianas. Ainda assim, no utilizado por rotina, pois as infeces do sangue por anaerbios so raras.

- Sondas DNA/PCR mais recentemente comeam a ter alguma relevncia

No entanto, s esto disponveis para um n limitado de agentes e no existem sondas de PCR disponibilizadas comercialmente (tm que ser desenhadas pelo prprio laboratrio)

- Microscopia campo escuro/ contraste fase s tem interesse para deteco de um determinado grupo de bactrias, as Espiroquetas, mais precisamente o Treponema Pallidum, causador da sfilis, uma bactria anaerbia incultivvel. Tem pouco interesse prtico.

- Testes serolgicos pouco tm de serolgicos, pois so feitos directamente nos produtos biolgicos, para a deteco de antignios: Uso limitado; controverso. ex.: aglutinao latex (Clostridium difficile)

- EIA (mtodos imunoenzimticos) Deteco toxina A e B do C. difficile maior valor. Bactria que produz diarreia e que leva tempo a cultivar, logo a deteco da toxina torna a identificao da infeco muito mais rpida

Quanto ao exame directo da amostra, na maior parte dos laboratrios s se efectua mesmo o esfregao de Gram. Logo, tradicionalmente, deve-se passar para um exame cultural:

4. Processamento laboratorial das amostras Uma informao clnica completa (tipo de infeco, doenas subjacentes, teraputica

antimicrobiana) combinada com a informao obtida do exame macroscpico e microscpico, essencial, ao microbiologista, na escolha dos meios de cultura a utilizar para as sementeiras primrias: 4.1 - Seleco dos meios de cultura - A maioria das infeces so polimicrobianas: isto implica usarem-se meios selectivos e meios no selectivos. sempre difcil valorizar tudo aquilo que cresce, ou seja, h que diferenciar qual ou quais os agentes implicados na infeco daqueles que vieram por contaminao. - O grau de seleco vai depender do: tipo de amostra, volume da amostra e dos recursos econmicos do laboratrio

Como mnimo: - Meio no selectivo: fazem-se culturas em duplicado: incuba-se uma em anaerobiose e outra em aerobiose. No entanto h que perceber que se um organismo cresce em anaerobiose, isto no quer dizer que seja anaerbio obrigatrio, pois os aerbios facultativos tambm crescem em anaerobiose. Uma coisa que acontece muitas vezes que existem bacilos gram que s crescem em anaerobiose, mas 2 ou 3 gerao (ou repicagem) comeam a crescer em aerobiose

normalmente isto acontece com a E. coli. Este um daqueles fenmenos de represso enzimtica: esta E. coli (aerbia facultativa) viveu durante tanto tempo numa atmosfera de anaerobiose que reprimiu as enzimas que degradam os metabolitos txicos de O2, mas agora capaz de as voltar a sintetizar.

- Meio selectivo para microrganismos: como por ex. grupo do Bacteroides fragilis

Caracterstica dos Meios de Cultura: - As bactrias anaerbias so por via de regra nutricionalmente muito exigentes, requerendo meios de cultura com base de gelose sangue, suplementados com vitaminas, coenzimas e factores de crescimento. - Os meios devem ser frescos (preparados h poucas horas, ou seja, foram aquecidos a mais de 60C, logo libertaram o O2) ou terem sido pr-reduzidos (o meio de cultura deve ser mantido em anaerobiose, mesmo antes de ser semeado: o se isto no acontecer, durante a preparao do meio o O2 pode-se ir dissolvendo no meio de cultura e se este tiver O2, mesmo que a atmosfera em que ele seja posto a cultivar no tenha O2, este pode inibir o crescimento das anaerbias muito sensveis, estritas).

Os quatro meios de cultura mais utilizados para o isolamento de anaerbios ou as bases de meio de cultura (pois eles podiam ser enriquecidos com sangue, soro, factores de crescimento), eram considerados os 4 magnficos pois eram meios de cultura que por si s tambm j tinham agentes redutores, para manterem a menor quantidade possvel de O2 no meio. Estes eram Shedler e o tioglicolato em caldo ou em estolido mas pode-se perfeitamente cultivar anaerbios numa cultura que seja Columbia, Agar, Breyner-Agar ou caldo crescem perfeitamente.

4.2 - Preparao das amostras para a sementeira Deve-se extrair e concentrar os microorganismos presentes: - Grande volume lquido (ex.: 5 ml de exsudado purulento): concentrar por centrifugao; semear o sedimento - Zaragatoa: coloca-se um pequeno volume (0.5 a 1 ml) de caldo tioglicolato num tubo de ensaio e esfregar suavemente a zaragatoa nas paredes do tubo de ensaio, para extrair o material - Tecidos (ex.: bipsia): homogeneizao em 1 ml caldo tioglicolato; suave e rpida

Importante: evitar exposio prolongada ao ar!

4.3 - Incubao em anaerobiose - Temperatura habitual: 37C

- Pretende-se uma incubao em atmosfera sem O2 livre - Composio habitual: 5% H2, 5% CO2, 80% N2 todos gostariam que atmosfera tivesse um pouco mais de H2, mas no se pode ter porque seria demasiado explosiva

A escolha entre os diferentes sistemas de produo de anaerobiose condicionada por diversos parmetros: o principal os recursos econmicos. Qualquer um deles satisfatrio para o isolamento dos anaerbios mais frequentemente implicados em doena humana (mas pode no servir para todos):

- Jarra anaerobiose: fica fechada e tem um gerador prprio da mistura gasosa acima descrita (Sistema GAS PAK); ou ento usa-se o Sistema de evacuao-substituio: extrai-se a atmosfera normal (com 21% de O2) e introduz-se a mistura gasosa livre de O2 (anaerobiose no imediata, mas mais rpida e cara). Como desvantagens: anaerobiose relativamente lenta (principalmente se for feita com um gerador). Quando se fecha a jarra, o gerador comea a produzir a atmosfera sem O2, mas algum O2 ainda ficou l retido (no existe uma anaerobiose imediata): o H2 produzido pelo gerador combina-se com o O2 e forma gua (H2O) que se deposita no fundo da jarra, logo: empilham-se vrias placas de Petri na jarra, mas a placa do fundo fica vazia, para evitar a contaminao por bactrias que podem ser arrastadas pela gua.

- Saco de anaerobiose: verso clssica da Jarra. Formado por um plstico impermevel ao ar e com gerador da mistura gasosa sem O2. pequeno e mais barato que a jarra, logo mais conveniente para laboratrios que faam culturas de anaerbios mais esporadicamente. - S funciona com o sistema GAS PAK - Desvantagem: s pode utilizar 2 placas de Petri de cada vez

Quer com a Jarra, quer com o Saco, quando se abre o dispositivo para inspeccionar as culturas, ao coloc-las em cima da mesa de trabalho estamos a exp-las a um ambiente de aerobiose, logo o processamento tem de ser rpido: tem de ser uma pessoa com experincia, seno mesmo que se tenha cultivado em anaerobiose, se se expe as bactrias durante muito tempo ao O2, vai haver uma inibio do seu crescimento. Da que no se queiram nem Jarras nem Sacos muito grandes, porque s uma pessoa no consegue processar em tempo til (15 a 20 minutos) todas as placas. Logo foi necessrio criar a:

- Cmara de anaerobiose: aqui tudo se processa em anaerobiose: uma cmara fechada (como se fosse uma cmara de fluxo laminar), onde existe uma porta por onde se introduz os meios de cultura e na qual h a prpria estufa de incubao, ou seja, todo o processamento da amostra

feito anaerobiose. Funciona segundo um sistema de evacuao/substituio. Permite o uso das tcnicas de cultura convencionais. Desvantagens: preo muito elevado, ocupa muito espao, time consuming e manuteno difcil avarias.

- Roll tube/tubo Hungate: (s utilizado num laboratrio no mundo um centro de referncia para anaerbios e mesmo esse, recentemente, comprou vrias cmaras de anaerobiose) A tcnica muito bizarra: os tubos no esto numa cmara, mas antes esto sempre expostos a um jacto de gs inerte que no contm O2, logo afasta o O2 da atmosfera o que implica um grande gasto. Tem a vantagem terica de observar os tubos sem quebrar a anaerobiose, mas difcil isolar estirpes em cultura pura e fazer repicagens. Nunca foi usado para diagnstico clnico.

No entanto estes sistemas no so infalveis, logo deve-se fazer o Controlo de Anaerobiose por inicadores: - Qumicos - Biolgico: anaerbios estritos Fusobacterium Porphyromonas aerbios estritos Pseudomonas aeruginosa

5. Identificao de bactrias anaerbias Bastante complexa e demorada, sendo feita a dois nveis:

5.1 Identificao Presuntiva muito importante, pois a identificao definitiva em geral muito mais demorada nas bactrias anaerbias que nas aerbias facultativas os anaerbios tm necessidades nutricionais mais exigentes e crescem lentamente em cultura. feita normalmente por testes simples (semelhantes aos das bactrias aerbias): - Sensibilidade aos antimicrobianos da mesma maneira que se faz para outras bactrias. Permite dividir as bactrias dentro de grandes grupos, como sejam Cocos ou Bacilos. Usam-se: colistina, vancomicina, kanamicina, metronidazol - Provas bioqumicas: catalase, produo indol, reduo nitratos, polianetol sulfonato sdio, crescimento em meio com sais biliares, alanina peptidase, urease, lecitinase/ lipase - Testes cromognicos: existem kits de identificao rpida (4 a 24 h). Tambm se usam: glicosidase, galactosidase, alfa glicosidase, alfa fucosidase Usam-se vrios destes testes e utilizando os dados, pode-se presumir a que grupo pertence a bactria.

5.2 Identificao Definitiva A identificao das bactrias anaerbias vai continuar na prxima 6 feira leiam a aula desgravada seguinte :)

Boa sorte para Janeiro! Mariana Brando turma 3