FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE INTRODUCCIN: La enterobactericeas o tambin llamadas coliformes son un vasto grupo heterogneo de bacilos gram negativos cuyo

hbitat natural es el intestino de humanos y animales .Esta familia incluye muchos gneros (p.ej. Escherichia, Shiguella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus y otros).Algunos microorganismos entricos, como Escherichia coli, forman parte de la flora normal e incidentalmente causan enfermedades; en tanto que otros, salmonellas y shguelas, con gran frecuencia son patgenas para humanos. Las enterobactericeas son microorganismos aerobios, fermentan una amplia variedad de carbohidratos, poseen una estructura antignica compleja y producen varias toxinas y otros factores de virulencia. La taxonoma de las enterobacterias es compleja y ha cambiado con rapidez desde la introduccin de tcnicas que miden la distancia evolutiva, como hibridacin y secuenciacin de DNA. Se han definido ms de 25 gneros y 110 especies o grupos; sin embargo, las enterobactericeas clnicamente significativas comprenden 20 a 25 especies. La familia Enterobacteriaceae muestra las siguientes caractersticas: son bacilos gram negativos, dotados de movilidad por flagelos pertricos o carentes de motilidad; crecen sobre peptona o medios con extracto de carne sin adicin de cloruro de sodio ni otros complementos; crecen bien en agar Mac Conkey; crecen en condiciones aerbicas y anaerbicas (son anaerobios facultativos); fermentan la glucosa en vez de oxidarla y con frecuencia producen gas; son catalasas positivos, oxidasa negativo y reducen el nitrato a nitrito.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES: 1. Agar Mac Conkey: Composicin del medio (gr/L): Peptona de casena Peptona de carne Cloruro de sodio Lactosa Mezcla de sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar agar 17g 3,0g 5,0g 10g 1,5g 0,03g 0,001g 3,5g

Procedimiento: Se sembr una muestra de heces lquida (N 04) por estrias en el agar Mac Conkey, en placa. Llevando incubacin por 24 h. a a 37 C

Resultados: AGAR MAC CONKEY

Interpretacin: LACTOSA COLOR BACTERIAS PROBABLES EN MUESTRAS DE HECES (N 04) Lactosa positiva Lactosa negativa Colonias rojas Colonias amarillas E. coli Shigella Proteus Slamonella

Fundamento: El agar Mac Conkey es un medio empleado frecuentemente para separar las bacterias fermentadoras de lactosa de aquellas que no la fermentan, provenientes de aguas, alimentos y muestras clnicas. Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben a las bacterias garm positivas y algunas gram negativas que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Contiene lactosa, nico carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH, cuyo mbito de viraje est entre pH8,0(amarillo) y pH 6,8(rojo).La bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias que varan en el tono rojo: rojas, rojas fucsia o incoloras con el centro rosado ,depende de la cantidad de acido producido y las no fermentadoras de lactosa producen colonias incoloras .En este caso ,el medio adquiere un ligero tono amarillo ,pues las bacterias utilizan las peptonas y alcalinizan el medio de cultivo.

2. Agar Salmonella - Shiguella Composicin del medio (gr/L): Extracto de carne Peptona Lactosa Bilis Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Agar Verde brillante Rojo neutro 5,0g 5,0g 10g 8,5g 8,5g 8,5g 1,0g 13,5g 0,33mg 0,025g

Procedimiento:

Se sembr la muestra de heces N 5 por estrias, que crecio previamente en un caldo selenito, en placa.

Llevando a incubacin a 37 C por 24 h. * Caldo selenito le da un enriquecimiento selectivo a la muestra, esto porque algunas cepas de Shiguellas pueden ser inhibidas.

Resultados:

MEDIO SALMONELLA

Lactosa (-)

Lactosa (+)

Interpretacin: AGAR SALMONELLA COLOR SHIGELLA (SS) BACTERIAS PROBABLES EN MUESTRAS DE HECES (N 05)

Lactosa positiva Lactosa negativa

Colonias rojas Colonias amarillas

Shigella Salmonella

Fundamento:

El agar SS es una medio altamente selectiva y diferencial, diseada para el aislamiento de Salmonella y Shiguella .La inhibicin de las bacterias del grupo coliforme (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella) as como de gram positivas, se logra con la mezcla de sales biliares (que estn en mayor concentracin que en el Mac Conkey), citrato de sodio y Tiosulfato de sodio y verde brillante. Salmonella y Shiguella no fermentan la lactosa y forman colonias translucidas e incoloras; las bacterias fermentadoras de lactosa que logren crecer en el medio, forman colonias rojizas y generalmente mucoides .Este medio tambin contiene sales de hierro como indicador para detectar la produccin de sulfuro de hidrogeno; las bacterias que lo produzcan forman colonias con un centro negro debido a la precipitacin de sulfuro frrico.

3. Agar xilosa lisina desoxicolato sdico(XLD) Composicin del medio (gr/L): D xilosa L lisina Lactosa Sacarosa NaCl Extracto de levadura Sodio desoxicolatado Citrato de amonio frrico Rojo de fenol Agar agar 3,5g 5,0g 7,5g 7,5g 5,0g 3,0g 6,8g 0,8g 0,8g 13,5g

Procedimiento: Se sembr la muestra4 (heces) por estrias, en placa. Llevando a incubacin a 37 C por 24 h.

Resultados:

MEDIO XILOSA LISINA

Lactosa (-)

Lactosa (+)

Interpretacin:

MEDIO LISINA

XILOSA COLOR -

BACTERIAS (N 05)

PROBABLES

EN MUESTRAS DE HECES

DESOXICOLATO XLD

Lactosa positiva Lactosa negativa

Colonias rojas Colonias amarillas

Shigella Salmonella

Fundamento: Se considera un medio de selectividad moderada recomendado para el aislamiento de patgenos entricos, especialmente para las especies de Shiguella (colonias transparentes no fermentadoras) y Salmonella (colonias transparentes y negras no fermentadoras).Las colonias negras se deben a la formacin de sulfuro de hierro a partir de Tiosulfato y citrato. El desoxicolato sdico acta como agente selectivo.

PREPARACIN DE AGAR TSI/LIA El agar con hierro dos azcares (LIA) y el agar con triple azcar y hierro (TSI) son medios de cultivo diferenciales en tubo que cumplen un doble propsito: a) La determinacin de fermentaciones de hidratos de carbono

b) La determinacin de la produccin de H2S Un microorganismo puede usar varios sustratos incorporados en el medio, el patrn de sustratos metabolizados se usa para diferenciar entre los diversos grupos, gneros o especies, principalmente entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae.

4. Agar-hierro-triple azcar(TSI) Composicin del medio (gr/L): Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Peptona proteasa Dextrosa Lactosa Sacarosa Sulfato ferroso Nacl Tiosulfato de sodio Agar agar Rojo de fenol Ph:7,4 0,2 a 25 C Procedimiento: Disolver en 1 L de agua destilada. Distribuir en tubos.

Esterilizar al autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posicin inclinada, de forma que sobre una columna de unos 3 cm de altura, se forme una superficie oblicua

Resultados: AGAR HIERRO - TRIPLE AZCAR (TSI)

Interpretacin: Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificar el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecer de color rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa y/o sacarosa, acidificar el medio en su superficie volvindolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo. Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento del tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

Fundamento: En el medio de cultivo, el extracto de carne y la peptona proteasa, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Al ocurrir la degradacin de cualquiera de los tres azcares presentes, se forman cidos que hacen virar el indicador rojo de fenol a un color amarillo (inicialmente el color del medio es rojizo), en caso de no ocurrir la degradacin de los azcares, se producir una alcalinizacin virando el color del indicador hacia un color rojo acentuado. La degradacin de la lactosa ocurre en la parte superior (pico de flauta) de la sacarosa en la parte intermedia y la glucosa es fermentada en la parte profunda y en condiciones anaerobias. El tiosulfato es reducido a hidrgeno sulfurado quien reacciona con la sal de hierro para dar formacin de sulfuro de hierro que es de color negro. La presencia de cavidades en el medio es debido a la formacin de gas ( CO2) producto de la fermentacin. 5. LIA Es un medio de diferenciacin bioqumica, es un medio que nos permite evidenciar la habilidad de los bacilos Gram negativos, para fermentar glucosa o lactosa, y produccin de acido sulfdrico

Composicin del medio (gr/L): Peptona de carne 5,0g

Extracto de levadura D(+) glucosa L-lisina monoclorohidratada Sodio Tiosulfato Amonio y hierro III citrato Purpura de bromocresol Agar agar

3,0g 1,0g 10g 0,04g 0,5g 0,02g 12,5g

Procedimiento: Disolver en 1 L de agua destilada. Distribuir en tubos. Esterilizar al autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar solidificar en posicin inclinada, de forma que sobre una columna de unos 3 cm de altura, se forme una superficie oblicua. Resultados:

Fundamento: Las reacciones de LIA se usan principalmente para identificar a los miembros de la familia Enterobacteriaceae, que por definicin son bacilos gramnegativos, catalasa positivos, todos los cuales fermentan la glucosa con produccin de cido. Asimismo existen muchos bacilos intestinales gran negativos no entricos cuya identificacin o separacin de la familia Enterobacteriaceae es facilitada por sus reacciones en el LIA .

El indicador Prpura de bromocresol en medio cido es amarillo y en medio alcalino es prpura, la degradacin de lactosa se lee en la parte inclinada, lo cual se manifiesta por el viraje del indicador a amarillo, la degradacin del disacrido lactosa es un proceso de oxidacin. La fermentacin de la glucosa se lee en la parte columnar (profundo) del medio y se evidencia por el color amarillo. La produccin de cido sulfidrico, a partir de tiosulfato se manifiesta al reaccionar el H2S producido, con los iones de fierro presentes en el medio y la formacin de un precipitado de color negro. Adems en este medio tambin se evidencia la produccin de indol a partir de la desaminacin del triptfano para esto se coloca una cinta de papel embebido con reactivo de Kovacs, si la cinta se colorea rojo significa que es indol (+).

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO: Caldo Selenito: Composicin del medio (gr/L): Peptona Lactosa Fosfato de sodio Selenito de sodio Ph:7,0 0,2

Procedimiento: Resultados: Se sembr la muestra5 (heces) por estrias, en placa. Llevando a incubacin a 37 C por 24 h.

Interpretacin:

COLONIAS El crecimiento se observa por el color anaranjado del medio, Muestra debido a la oxidacin del selenito a selenuro. Fundamento: heces

de

Se utiliza como medio de enriquecimiento selectivo para Salmonella y tambin para Proteus, Pseudomonas. El selenito sdico acta como agente toxico para otras bacterias entricas y, durante las primeras 8-12 horas de incubacin, inhibe mucho su crecimiento.

Agar Sulfito Bismuto: Composicin del medio (gr/L): Dextrosa Extracto de carne Na2 PO4

Verde Brillante Selenito de sodio Sulfito Bismuto Sulfuro ferroso Agar

Procedimiento:

Se sembr la muestra5 (heces) por estrias, en placa. Llevando a incubacin a 37 C por 24 h.

Resultados:

AGAR SULFITO BISMUTO

Colonias negras con halo metlico

COLONIAS BACTERIA Centro negro, borde claro, precipitado Salmonella negro con brillo metalico alrededor de las colonias (ojo de conejo, ojo de pez) Interpretacin:

Fundamento:

Medio altamente selectivo que se recomienda para el aislamiento de la salmonella tyhi paratyphi. su selectividad se manifiesta por la presencia del verde brillante, citrato de bismuto y sulfito de bismuto. la salmonella thypi ataca a la glucosa con rapidez, permite la reduccin del sulfito de sodio quien al combinarse con el con el bismuto, en presencia de verde brillante, suprimen el crecimiento de los coliformes. el color negro que presentan las colonias de salmonella es debido a la formacin de sulfuros de bismuto y de hierro. los fosfatos presentes sirven como tampn para regular la acidificacin del medio, por fermentacin de la glucosa. Las colonias de grmenes reductores presentan elevada presin de electrones en su interior, disminuyendo hacia afuera. por consiguiente en el centro de las mismas se reduce el sulfato hasta sulfuro. en los alrededores solamente se produce una reduccin de bismuto a bismuto metlico, dando lugar a la aparicin de un brillo metlico alrededor de las colonias.

BIBLIOGRAFIA:
*

PEDRO GARCA MARTOS, FERNANDO PAREDES SALIDO, MARA TERESA FERNNDEZ DEL BARRIO.1994. Microbiologa clnica practica.

* *

RAMN DAZ. 2005. Manual practico de microbiologa. EVELYN RODRGUEZ CAVALLINI .2005.Bacteriologia General: Principios y prcticas en el laboratorio.

JAWETZ E., MELNICK J., ADELBERG F. 1996. Microbiologa Mdica. 15 edicin. Edit. El Manual Moderno, S.A. Mxico. Pg. 313.