Artigo

TRANSFERNCIA DE MTODO HPLC PARA U-HPLC DE MAIOR RESOLUO E RAPIDEZ

Resumo
A necessidade de analisar um nmero crescente de amostras em um pequeno intervalo de tempo vem impulsionando desenvolvimentos tecnolgicos na rea de instrumentao analtica para laboratrio. Colunas preenchidas com partculas de tamanho pequeno (sub-2 m) foram desenvolvidas para aplicao em anlises de HPLC. O emprego de partculas pequenas nas separaes cromatogrficas resulta em maior eficincia, o que possibilita a reduo dos tempos de anlise. Este trabalho apresenta uma metodologia simples para transferir as condies cromatogrficas de uma anlise convencional de HPLC, para uma anlise rpida de U-HPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography), levando em conta o tamanho da partcula, o dimetro interno da coluna e seu comprimento. A anlise por HPLC do ibuprofeno e substncias relacionadas, segundo a Farmacopia Europia, foi transferida para U-HPLC, com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e manter a resoluo cromatogrfica. Foi alcanada uma reduo de oito vezes no tempo de anlise, enquanto que a resoluo crtica entre um par de impurezas foi mantida e o consumo de solvente foi reduzido em quatorze vezes. Palavras-chave: U-HPLC, cromatografia a lquido de ultra-alto desempenho, converso de mtodo, tamanho de partcula sub-2-micra, ibuprofeno
Luisa Pereira* Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK *Correspondncia: Nova Analtica Imp. Exp. Ltda. R. Assungui, 432 CEP: 04131-000 So Paulo. SP Fone: (11) 2162-8080 Fax: (11) 2162-8081 E-mail: analitica@novanalitica.com.br

Summary
The needs to analyze an increasingly number of samples in a short time period have been stimulating technological developments in the analytical instrumentation area. Columns packed with sub-2-micron particles have been developed to be used in HPLC analysis. Small particles provide very high efficiencies which enable very fast run times. This paper presents a practical guideline on scaling down separations by taking into account particle size, column ID, and column length. The European Pharmacopoeia (EP) HPLC method for ibuprofen and related substances was transferred to U-HPLC to reduce analysis time while maintaining chromatographic integrity. The analysis time was reduced by eight fold, resolution of a critical pair of impurities is maintained and solvent consumption was reduced by fourteen fold. Keywords: u-hplc method conversion, ultra high performance liquid chromatography, sub2-micron particle size, ibuprofen

Introduo
A cromatografia a lquido de alto desempenho (HPLC) tem-se afirmado nas ltimas dcadas como uma tcnica altamente vantajosa na quantificao de diversos compostos, em diferentes matrizes. Compostos de alta ou baixa massa mole68

cular, polmeros ou biopolmeros (protenas) podem ser analisados por HPLC, devido ao grande nmero de combinaes possveis entre a fase mvel e a fase estacionria. Entretanto, os tempos das anlises por HPLC convencional normalmente
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so superiores a 10 min. Colunas empacotadas com partculas de dimetro sub-2 m oferecem vantagens sobre as colunas tradicionais com partculas de 3 e 5 m, como menor tempo de anlise, maior resoluo e maior capacidade de picos (1). Conforme j demonstrado por Knox e outros autores (2-5), partculas pequenas induzem um aumento da eficincia, da velocidade tima da fase mvel e da transferncia de massa. Assim, separaes eficientes podem ser alcanadas em menores tempos de anlise, quando so empregadas colunas com partculas de dimetro sub-2 m. As partculas sub-2 m podem ser empregadas com duas finalidades: realizar anlises rpidas e ultra-rpidas, uma vez que uma boa eficincia pode ser mantida, mesmo com colunas curtas e alta velocidade linear da fase mvel, e resolues mais altas podem ser alcanadas com colunas mais longas e velocidade da fase mvel prxima aos valores timos. A transferncia de um mtodo com coluna convencional para coluna com partculas de dimetro sub-2 m pode levar em conta as diferentes necessidades analticas. Se as dimenses da coluna so mantidas e somente o tamanho da partcula reduzido, melhorias na eficincia, na resoluo e na capacidade de picos so obtidas. Se alm da reduo no tamanho da partcula, as dimenses da coluna tambm forem reduzidas, o tempo de anlise tambm ser menor. Em ambos os casos, a vazo, o perfil do gradiente e o volume de amostra injetado devem ser ajustados adequadamente. Este trabalho apresenta orientaes prticas de como transferir um mtodo de HPLC convencional para HPLC com partculas sub-2 m, levando em conta o tamanho da partcula, o dimetro interno da coluna e o comprimento da coluna. A amostra empregada para demonstrar o procedimento de transferncia de mtodo foi ibuprofeno e seis impurezas. Ibuprofeno um frmaco do grupo dos antiinflamatrios no esterides, utilizado como analgsico e antitrmico. O mtodo HPLC de anlise do ibuprofeno, com coluna de 150x4,6 mm, 5 m, foi adaptado a partir do mtodo oficial da Farmacopia Europia, e rotinas de clculos simplificadas foram empregadas para transferir as condies convencionais para colunas de 100x2,1 mm e 50x2,1 mm, empacotadas com partculas de 1,9 m. Tambm apresentada neste trabalho uma otimizao do mtodo, para alcanar menores tempos de anlise.

Mtodo original Coluna Fase mvel Gradiente Vazo Volume injetado Temperatura Deteco 150x4,6 mm, 5 m A: 0,05% H3PO4 em H2O / ACN (66:34) B: ACN 0 a 25 min 0% B, 55 min 85% B, 85% B por 15 min 1 mL/min 10 L 30C UV em 214 nm (Ibuprofeno e impurezas): 1. Impureza K; 2. Impureza D; 3. Impureza C; 4. Ibuprofeno; 5. Impureza A; 6. Impureza B; 7. Impureza E.

Amostra

Transferncia de mtodo Para transferir o mtodo para a coluna de geometria menor, empacotada com partculas de 1,9 m (colunas II e III) e garantir a equivalncia cromatogrfica, necessrio diminuir proporcionalmente a vazo, o volume injetado e o gradiente: Etapa 1. Ajuste da vazo (a velocidade linear deve ser mantida a mesma nos dois mtodos, o original e o novo):

F1 = vazo original (mL/min) F2 = nova vazo (mL/min) dc1 = dimetro interno da coluna original (mm) dc2 = novo dimetro interno da coluna (mm) dp1 = tamanho da partcula (m) dp2 = novo tamanho da partcula (m) Etapa 2. Ajuste do volume de injeo

Parte Experimental
Colunas empregadas Coluna I: Hypersil GOLD de 150x4,6 mm, 5 m; Coluna II: Hypersil GOLD de 100x2,1 mm, 1,9 m; Coluna III: Hypersil GOLD de 50x2,1 mm, 1,9 m (Thermo Scientific). O sistema de HPLC rpida (U-HPLC) empregado foi o Accela High Speed LC (Thermo Scientific).
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Vi1 = volume original de injeo (L) Vi2 = novo volume de injeo (L) dc1 = dimetro interno da coluna original (mm) dc2 = novo dimetro interno da coluna (mm) L1 = comprimento original da coluna (mm) L2 = novo comprimento da coluna (mm)
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Etapa 3. Ajuste do perfil do gradiente O mtodo original (coluna 150x4,6 mm, 5 m) tem trs segmentos, um isocrtico com 100% de A por 25 min, seguido por um gradiente linear at 85% de B durante 30 min e um segmento final isocrtico de 15 min com 85% de B. Para transferir estas condies para as colunas II e III, necessrio calcular a razo entre o volume de fase mvel e o volume da coluna em cada segmento do mtodo original: Clculo do volume de fase mvel, a partir da vazo e da durao de cada segmento: Para o segmento 1 Volume de fase mvel = vazo x durao do segmento Volume de fase mvel = 1 mL/min x 25 min = 25 mL Clculo do volume da coluna do mtodo original. Vc = 0,68 x x r2 x L onde: Vc = volume da coluna em mL L = comprimento da coluna (cm) r = raio da coluna (cm) valor 0,68 = fator que corrige o volume da coluna, levando em conta seu volume morto (void volume) Vc1 = 0,68 x 3,14 x 0,23 x 15 = 1,7 mL Clculo da razo (R) entre os volumes de Fase mvel e da coluna R = 25 mL / 1,7 mL = 14,7 No mtodo com coluna 100x2,1 mm, 1,9 m , os segmentos precisam ter a mesma razo R para manter a integridade cromatogrfica: A partir da razo R (calculada acima) e do volume da coluna 100x2,1 mm, o volume de fase mvel em cada segmento da U-HPLC deve ser calculado: Para o segmento 1 Volume de fase mvel = R x volume da coluna 100x2,1 mm Volume de fase mvel = 14,7 x 0,23 mL Volume de fase mvel = 3,38 mL A partir do volume de fase mvel em cada segmento e da vazo (calculado na etapa 1), a durao de cada segmento da U-HPLC deve ser calculada em unidade de tempo. Para o segmento 1 Durao do segmento = Volume de Fase mvel / vazo Durao do segmento = 3,38 mL / 0,55 mL/min = 6,1 min A Tabela 1 apresenta os clculos de transferncia do mtodo original com coluna de 150x4,6 mm, 5 m, para os mtodos rpidos com colunas de 100x2,1 mm, 1,9 m e 50x2,1 mm, 1,9 m. Com o emprego de colunas pequenas e gradientes rpidos, o volume morto (dwell volume) passa a ser bastante significativo e a afetar o tempo gasto para o gradiente alcanar o topo da coluna. No considerar o volume morto na transferncia de mtodo com gradiente pode resultar em discrepncia na composio da fase mvel, o que pode levar a diferenas na seletividade, principalmente para os picos com tempos de reteno menores. Um calculador automtico, disponvel no endereo eletrnico http:// www.hplctransfer.com, calcula automaticamente um ajuste de tempo para o perodo isocrtico inicial do novo mtodo.

Resultados
O perfil cromatogrfico do mtodo original e dos mtodos de U-HPLC rpida, ajustados proporcionalmente para as colunas menores e empacotadas com partculas de

Mtodo original Coluna I: 150 x 4,6 mm, 5 m Vazo: 1 mL/min Volume da coluna: 1,7 mL Volume injetado: 10 L Razo: Volume FM/Volume coluna 0 14,7 32,4 41,2 %B 0 0 85 85 Volume de Fase Mvel (mL) 0 25 55 70 Tempo de Gradiente (min) 0 25 55 70

U-HPLC Coluna II: 100 x 2,1 mm, 1,9 m Vazo: 0,55 mL/min Volume da coluna: 0,23 mL Volume injetado: 1,4 L Volume de Fase Mvel (mL) 0 3,5 7,8 9,9 Tempo de Gradiente (min) 0 6,1 14,1 17,9 %B 0 0 85 85

U-HPLC Coluna III: 50 x 2,1 mm, 1,9 m Vazo: 0,55 mL/min Volume da coluna: 0,12 mL Volume injetado: 0,7 L Volume de Fase Mvel (mL) 0 1,8 3,9 4,9 Tempo de Gradiente (min) 0 3,2 7,1 8,9 %B 0 0 85 85

Tabela 1. Condies cromatogrficas para transferncia do mtodo HPLC para U-HPLC. Os parmetros nas colunas verdes so mantidos constantes

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Figura 1. Cromatogramas obtidos com o mtodo HPLC original e com os mtodos transferidos proporcionalmente para U-HPLC. Comparao entre os tempos de anlise, resoluo USP e presso

Pico 1 2 3 4 5 6 7

Tempo de Reteno (min) Mdia RSD 0,526 0,0006 1,275 0,0004 2,829 0,0010 5,098 0,0011 5,266 0,0011 5,358 0,0007 6,499 0,0026

% RSD 0,116 0,030 0,035 0,021 0,020 0,014 0,039

rea do pico Mdia 311247 366600 763573 643375 383064 761428 457633

RSD 6001 8037 14055 10063 8240 12686 8570

% RSD 1,93 2,19 1,84 1,56 2,15 1,67 1,87

Tabela 2. Dados de repetibilidade para 10 injees com o mtodo U-HPLC, na coluna 50x2,1 mm x 1,9 m

1,9 m esto apresentados na Figura 1. A resoluo (USP) entre os picos 5 e 6 foi aumentada de 1,6 no mtodo HPLC, para 2,8 no mtodo de U-HPLC rpida com coluna 100x2,1 mm, 1,9 m. Quando o mtodo foi transferido para a coluna de 50x2,1 mm, 1,9 m, a resoluo entre os picos 5 e 6 foi mantida, enquanto que o tempo de anlise
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foi reduzido por aproximadamente sete vezes. Os dados de repetibilidade esto apresentados na Tabela 2. A economia de tempo e de solvente que pode ser alcanada pela transferncia de um mtodo HPLC para UHPLC est ilustrada na Tabela 3. Redues de oito vezes no tempo de anlise e de 14 vezes no consumo de solRevista Analytica Abril/Maio 2008 N34

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Coluna Fase Mvel

Gradiente Vazo Volume injetado Temperatura Deteco

Figura 2. Anlise mais rpida, em menos de trs minutos. Vazo de 1 mL/min e gradiente otimizado

Hypersil GOLD 1,9 m, 502,1 mm A: 0,05% H3PO4 em H2O / ACN (66:34) B: ACN Tempo (min) %B 0 0 0,5 0 3 85 1,0 mL/min 0,7 L 30C UV em 214 nm (0.1 s rise time; 20 Hz).

Durao do cromatograma (min) Durao do cromatograma + re-equilbrio (min) Economia de tempo Solvente gasto por anlise (mL) Economia de solvente

HPLC 70 87 87 -

U-HPLC 18 22 4 vezes 12 7 vezes

U-HPLC 9 11 8 vezes 6 14 vezes

Tabela 3. Economia de tempo e de solvente com o mtodo U-HPLC

vente foram observadas nas anlises apresentadas neste trabalho. O mtodo com a coluna de 50x2,1 mm, 1,9 m foi otimizado quanto ao tempo de anlise, pelo aumento da vazo para 1 mL/min, reduo do perodo isocrtico no incio da anlise e gradiente mais rpido (Figura 2).

de at quatorze vezes, tambm foi observada com o mtodo U-HPLC. Uma otimizao ulterior do mtodo U-HPLC possibilitou a separao do ibuprofeno e de seis impurezas, em menos de trs minutos.

Concluso
O mtodo HPLC da Farmacopia Europia para ibuprofeno e substncias relacionadas foi transferido com sucesso para U-HPLC no sistema Accela com colunas Hypersil GOLD de dimetro de partcula 1.9 m. A transferncia do mtodo foi realizada pela reduo proporcional da vazo, do volume injetado e do tempo de gradiente. O tempo de anlise foi reduzido quatro vezes, com uma melhoria de 75% na resoluo de um par de impurezas com separao crtica. Com o emprego de uma coluna ainda mais curta, o tempo de anlise foi reduzido em oito vezes, com resoluo constante entre o mesmo par de impurezas. O mtodo U-HPLC apresentou boa repetibilidade dos tempos de reteno (% RSD <0,2) e das reas dos picos (% RSD <2,2). Uma economia considervel de solvente,
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Referncias
1. NGUYEN, DAO T.-T., GUILLARME; DAVY; RUDAZ; SERGE; VEUTHEY; JEAN-LUC. Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure - J. Sep. Sci. 2006, 29, 1836 1848. 2. KNOX, J. H.; SALEEM, M. Kinetic conditions for optimum speed and resolution in column chromatography. J. Chromatog. Science 1969, 7, 614 622. 3. KNOX, J.H. Practical aspects of LC theory. J. Chromatog. Science1977, 15, 352 364. 4. POPPE, H. Some reflections on speed and efficiency of modern chromatographic methods. J. Chromatogr. A 778 (1997) 3 21. 5. NGUYEN, DAO T.-T.; GUILLARME; DAVY; RUDAZ; SERGE; VEUTHEY; JEAN-LUC. Chromatographic behaviour and comparison of column packed with sub-2 m stationary phases in liquid chromatography. J. Chromatogr. A 1128 (2006) 105 113.

Artigo traduzido por Silvana Pisani (silvana.pisani@novanalitica.com.br) e Fernando Lins (fernando.lins@novanalitica.com.br)

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