Formato Informe Tecnico

CDIGO: IN-F-06 INVESTIGACIN VERSION 0 FORMATO INFORME TCNICO FINAL
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CORPORACION COLOMBIANA DE INVESTIGACION AGROPECUARIA CORPOICA INFORME TECNICO FINAL
INSTITUCIONES PARTICIPANTES: Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria-CORPOICA Universidad Nacional de Colombia Asociacin Ganaderos Facatativ
FINANCIADO POR: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Ttulo del Proyecto: Evaluacin de sistemas de alimentacin en vacas Holstein y su efecto sobre la productividad animal, la emisin de metano y de xido nitroso y la captura de carbono en la Sabana de Bogot.
Lder: Olga Luca Mayorga Mogolln C.I. / E.E: Centro de Biotecnologa y Bioindustria-CBB Fecha: 15 de septiembre de 2011

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Datos bsicos del proyecto. Entidad financiadora: MADR Entidad (es) ejecutora (s): CORPOICA, Universidad Nacional-Sede Bogot, UNAL y Asociacin de Ganaderos de Facatativa Cdigo de Agenda:1492 Nmero del convenio: Nmero de Contrato: 1547 Lder del proyecto: Olga Luca Mayorga Mogolln Centro de investigacin y sede del lder: Centro de Biotecnologa y Bioindustria-CBB Fecha de Iniciacin: 15 de julio de 2008 Fecha de Finalizacin: 16 de julio de 2011 Equipo ejecutor del proyecto: Germn Afanador, MVZ, M.Sc., Ph.D. Bioqumica, Nutricin Animal, C. I. Tibaitat y UNAL Miguel ngel Ayarza M., Agrnomo, M.Sc., Ph.D. Ciencias de Suelo, C. I. Tibaitat Carlos Eduardo Lascano A., Ph.D., Nutricin de Rumiantes, C. I. Tibaitat y UNAL. Pedro Medina, Zootecnista, M.Sc., Nutricin Animal, C. I. Tibaitat Edgar Alberto Crdenas, MVZ., M.Sc. Medio Ambiente y Desarrollo, Produccin Animal Juan E. Carulla, M.Sc., Ph.D., Nutricin de Rumiantes, Fisiologa y Nutricin Animal Carlos Manrique, Zootecnista, M.Sc. Estadstica, Ph.D. Gentica Cuantitativa Erika Angarita Amaya, Zootecnista, estudiante M.Sc., Nutricin Animal, C. I. CBB William Rondn, Ingeniero qumico, Estudiante M.Sc., ingeniera Ambiental, C. I. CBB (se retiro en el segundo ao del proyecto) Juan de Jesus Vargas, Zootecnista, estudiante M.Sc., Nutricin Animal, UNAL Alexandra Salinas, Zootecnista, estudiante M.Sc.,, C. I. Tibaitat, U distrital Karen Malagon, Qumica, Joven Investigadora, C. I. CBB Carlos Ospina, Bilogo, Joven Investigador, C. I. CBB Diana Parra, Zootecnista, Nutricin Animal, C. I. CBB Mauricio Avila, Zootecnista, Nutricin Animal, C. I. CBB Ney Urrego, Zootecnista, Nutricin Animal, C. I. CBB Lizardo Vargas, Auxiliar de campo, CBB

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RESUMEN ................................................................................................................................... 6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 7 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................. 8 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................................... 8 Capitulo 1: Evaluacin del efecto de pasturas con y sin leguminosa sobre produccin y calidad composicional de la leche y capacidad de reducir emisiones de CH4 ............................ 9 1.1. 1.2. Introduccin ................................................................................................................... 9 Materiales y Mtodos ................................................................................................... 11
1.2.1 Establecimiento de las pasturas .................................................................................... 11 1.2.2. Efecto de los forrajes Lotus uliginosus, Pennisetum clandestinum y su mezcla sobre la produccin de gas total, produccin de metano y degradabilidad in vitro de la materia seca .. 12 1.2.2.1 Material experimental y tratamientos..................................................................... 13 1.2.2.2 Anlisis de composicin qumica .......................................................................... 13 1.2.2.3 Fermentaciones in vitro ......................................................................................... 13 1.2.2.4. Anlisis estadstico............................................................................................... 14 1.2.3 Ajuste de la tcnica SF6 para medir emisiones de metano en animales en pastoreo. ...... 15 1.2.3.1. Animales experimentales ..................................................................................... 17 1.2.3.2 Identificacin de poblaciones de microorganismos en el rumen y parmetros de fermentacin ruminal........................................................................................................ 18 1.2.3.3 Diseo estadstico ................................................................................................ 22 1.3 Resultados.......................................................................................................................... 22 1.3.1 Establecimiento de las pasturas ........................................................................................ 22 1.3.2 Produccin de gas, produccin de metano y degradabilidad in vitro. ............................ 26 1.3.3 Establecimiento de la tcnica de SF6 ............................................................................ 28 1.3.4 Determinacin de metano entrico en vacas Holstein pastoreando tres tratamientos de dieta alimenticia. .................................................................................................................. 34 1.3.4.1 Produccin de biomasa y composicin de las pasturas evaluadas ........................... 34 3

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1.3.4.2 Produccin y calidad composicional de la leche .................................................... 36 1.4 Conclusiones y Recomendaciones ...................................................................................... 37 Captulo 2: Determinar la capacidad de pasturas con y sin leguminosa de almacenar agua como medida de adaptacin y de secuestrar carbono, reducir emisiones de N2O y de CH4 como medida de mitigacin. ...................................................................................................... 39 2.1 Introduccin ....................................................................................................................... 39 2.2 Materiales y Mtodos ......................................................................................................... 41 2.2.1 Determinacin del flujo de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Kikuyo (pennisetum clandestinum ), Lotus (lotus uliginosus) y la pastura asociada Lotus-Kikuyo ..... 41 2.2.1.1 Condiciones cromatogrficas para cuantificar las concentraciones de metano y xido nitroso. ............................................................................................................................. 41 2.2.1.2 Evaluacin de los flujos de metano y xido nitroso en los suelos .......................... 41 2.2.1.3 Anlisis Estadstico ............................................................................................... 43 2.2.2 Almacenamiento de carbono en suelo de pasturas pura y asociada de Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus ............................................................................................... 43 2.2.2.1 rea de estudio .................................................................................................... 43 2.2. 2.2 Etapas metodolgicas ........................................................................................... 45 2.2.2.3 Anlisis Estadstico ............................................................................................... 50 2.3 Resultados.......................................................................................................................... 51 2.3.1 Determinacin del flujo de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Kikuyo (pennisetum clandestinum ), Lotus (lotus uliginosus) y la pastura asociada Lotus-Kikuyo ..... 51 2.3.1.1 Condiciones cromatogrficas para cuantificar las concentraciones de metano y xido nitroso. ............................................................................................................................. 51 2.3.1.2 Evaluacin de los flujos de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Lotus, Kikuyo y su asociacin. .................................................................................................... 53 2.3.2 Almacenamiento de carbono en suelo de pasturas pura y asociada de Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus ........................................................................................... 56 2.3.2.1 Acumulacin de carbono en suelo ......................................................................... 56 4

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2.3.2.2 Abundancias isotpicas de carbono ....................................................................... 57 2.3.2.3 Emisiones de Dixido de carbono ......................................................................... 59 2.4 Perspectivas del trabajo ...................................................................................................... 61 2.5 Conclusiones ...................................................................................................................... 62 Captulo 3: Formar una masa crtica de alto nivel en agricultura y cambio climtico a travs de la socializacin de resultados con el sector productivo y ambiental. ................................... 63 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................................... 65 RESULTADOS ESPERADOS, RESULTADOS OBTENIDOS E INDICADORES ............... 73 PRODUCTOS Y/O PROCESOS GENERADOS E IMPACTOS............................................. 74

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RESUMEN Para cubrir la demanda nacional y producir excedentes para los mercados externos de leche, el pas debe incrementar los ndices de productividad y de calidad e inocuidad de la leche, sin afectar en forma significativa el medio ambiente. Para lograr estas metas es imperativo que se desarrollen/adapten sistemas de alimentacin que contribuyan a aumentar la produccin de leche pero que simultneamente reduzcan las emisiones de metano. Adicionalmente, es necesario desarrollar sistemas de pasturas que reduzcan las emisiones de xido nitroso mediante un uso ms eficiente de la fertilizacin nitrogenada. En este proyecto se evalu el efecto de pasturas con y sin leguminosas sobre la produccin y calidad composicional de la leche y sobre emisiones de gases de efecto de invernadero. Para lograr estos objetivos se medi la produccin/calidad composicional de la leche junto con emisiones de metano bajo condiciones controladas (estacin experimental) con vacas en pasturas de Pennistum clandestinum (Kikuyo) + N, Penisetum clandestinum + Lotus uliginosus y de solo Lotus uliginosus. Por otra parte, en una finca de la Sabana de Bogot se medi produccin y calidad composicional de leche, secuestro de carbono y emisiones de N 2O en pasturas de Pennisetum clandestinium (kikuyo) + N (400 kg N/ha/ao) y de Kikuyo + 70-80% de Lotus uliginosus. Como medidas complementarias se evalu el efecto de las diferentes pasturas sobre micro-organismos del rumen, sobre la produccin de cidos grasos voltiles y las emisiones de metano (CH4) usando el gas marcador hexafloruro de azufre (SF6) en vacas en pastoreo en la Sabana de Bogot (C. I. Tibaitat). En los ensayos de pastoreo en la estacin experimental, se emple un diseo Cuadrado Latino 3 x 3 de recambio con 6 repeticiones. Con los resultados de proyecto se contribuy a generar un modelo de alimentacin a base de pasturas que aument la produccin y calidad composicional de la leche a la vez que mitig la emisin de gases efecto invernadero en sistemas de produccin de leche especializada en Colombia. Por otro lado, los flujos de gases efecto invernadero en los suelos cultivados con estas pasturas fueron evaluados en tres lotes de 2 hectreas y fueron medidos usando la tcnica de Cmara Cerrada Esttica. En el experimento se utilizaron 10 cmaras por lote, cerradas a nivel de suelo y distribuidas de forma homognea, obteniendo muestras de gas acumulado en las cmaras a tres diferentes tiempos (0, 15 y 30 minutos), se determin el flujo de CH4 de cada una de la pasturas usando la ecuacin Jgas = gas (V/A)(C/t)(273/(273+T). Los flujos de CH4 entre las praderas evaluadas presentaron diferencias significativa (P <0,05). El suelo cultivado con Kikuyo se mostr como emisor, con un flujo constante de 0,2549 g m-2min -1 y los otros dos lotes evaluados Lotus y la asociacin Lotus + Kikuyo son sumideros de CH4 con flujos entre (-0.1908 g m-2min -1) y (-0.1177 g m-2min -1) y entre (-0.0076 g m-2min -1) y (-0.1239 g m-2min -1), respectivamente. En trminos de carbono, los resultados calculados mostraron diferencias en cuanto a perodos diurnos sobre nocturnos representados por 73.438 mg CO2/m2 y 13.166 mg CO2/ m2, respectivamente; siendo escasas las diferencias entre especies utilizadas como Lotus uliginosus y Pennisetum clandestinum; relacionados estos resultados con variables climticas, biolgicas y de manejo. Indicando, que el tipo de pastura usada como forraje de alimentacin podra disminuir el impacto negativo de la ganadera en las emisiones de metano a el ambiente.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El sector ganadero en Colombia enfrenta dos grandes retos para atender de forma competitiva y sostenible las oportunidades de satisfacer la creciente demanda por carne y leche en mercados locales, regionales y globales. Por un lado, es necesario elevar los ndices de produccin e intensificar los sistemas de produccin al tiempo que se mejora la calidad e inocuidad de los productos crnicos y lcteos. Por otro lado, el sector ganadero debe prepararse para enfrentar los efectos adversos que tendr el cambio climtico cuyos efectos ya estn comenzando a sentirse en trminos de incrementos graduales de la temperatura, una creciente variabilidad en los regmenes de lluvias y una mayor frecuencia de eventos extremos tales como inundaciones y sequas. De acuerdo a las informaciones ms recientes del IPCC (Panel on Climate Change [Bogner y col., 2008]) se prevee que la temperatura global en los prximos 10 aos se incrementar en 3 grados en promedio como resultado del incremento de las emisiones de gases de efecto invernadero (Cox y col., 2000). De otra parte, informacin reciente del segundo inventario de gases preparado por el IDEAM indican que la fermentacin entrica provocada por los bovinos genera el 61% de las emisiones anuales de metano y la agricultura el 94% de las emisiones de N2O debido especialmente al uso de fertilizantes nitrogenados (IDEAM, 2008). Estas emisiones comparadas en trminos de CO2 equivalente son 7% mayores que las emisiones que genera el sector de transportes y solo 9% menores que las que genera el sector energtico (Informe IDEAM, 2008). Esta alta contribucin de gases de invernadero del sector ganadero puede tener repercusiones negativas en la bsqueda de mercados internacionales para carne y leche en la medida en que los compradores empiecen a exigir producciones en sistemas "limpios" y "amigables" con el medio ambiente. El Ministerio de Agricultura y los ganaderos representados por FEDEGAN estn haciendo esfuerzos importantes para que el sector ganadero mejore sus ndices de productividad y calidad de carne y leche apoyando el uso de tecnologas de mejoramiento gentico, sistemas de alimentacin y nutricin mejorados y tecnologas de procesamiento ms eficientes y ms limpias. Sin embargo, los esfuerzos para mejorar la capacidad de los sistemas de produccin de adaptarse a cambios climticos extremos y de reducir las emisiones de gases de efecto invernadero son todava incipientes y necesitan ser atendidos en forma prioritaria. Uno de los problemas ms generalizados que afronta la ganadera en el pas es la degradacin de las pasturas lo cual est asociada principalmente con la compactacin de los suelos haciendo que estos sistemas sean ms vulnerables a variaciones climticas extremas. La compactacin reduce la capacidad del suelo para almacenar agua que puede ser aprovechable para las pocas secas y genera prdidas por escorrenta en pocas de lluvias. Adems las pasturas degradadas contribuyen a una alta emisin de metano y tienen poca capacidad de secuestrar carbono. Por otra parte, existe inters por parte de gremios y productores de intensificar la produccin por unidad de superficie mediante manejos intensivos de pastoreo y uso de fertilizacin nitrogenada. Algunos de estos sistemas intensivos se encuentran en la zona cafetera (p. e. Estrella + N), Valle del Sin (Angleton y Guinea + N) y Sabana de Bogot (kikuyo - rye grass +N). La implementacin de estos sistemas puede resultar en efectos ambientales adversos relacionados con emisiones de N2O asociado con el proceso de nitrificacin. Todo lo anterior indica que para que los sistemas ganaderos del pas sean "amigables" con el medio 7

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ambiente y competitivos es necesario desarrollar estrategias de adaptacin al cambio climtico y de mitigacin de la produccin de gases de efecto invernadero. Hay evidencias experimentales que muestran que pasturas en donde se integran rboles o se utilizan gramneas con alta capacidad de produccin de races se mejora la capacidad de infiltrar y retener agua en el suelo, de secuestrar C y de reducir las emisiones de gases de efecto invernadero (CIAT, 2002). Adems, se conoce que algunas especies de gramneas tienen la capacidad de reducir en forma significativa las emisiones de N2O a travs de mecanismos biolgicos de inhibicin de la nitrificacin (Subbarao y col., 2005). Tambin existe evidencia que mediante prcticas mejoradas de alimentacin o mediante el uso de especies de leguminosas con taninos es posible reducir emisiones de metano en rumiantes por unidad de producto (carne o leche) o emisiones por animal (Woodward y col., 2004).
OBJETIVO GENERAL Evaluar la capacidad de un sistema de produccin de leche especializada para adaptarse a variabilidad climtica severa y mitigar gases de efecto de invernadero.
OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Evaluar el efecto de pasturas con y sin leguminosa sobre produccin y calidad composicional de la leche y capacidad de reducir emisiones de CH4. 2. Determinar la capacidad de pasturas con y sin leguminosa de almacenar agua como medida de adaptacin y de secuestrar carbono, reducir emisiones de N 2O y de CH4 como medida de mitigacin. 3. Formar una masa crtica de alto nivel en agricultura y cambio climtico a travs de la socializacin de resultados con el sector productivo y ambiental.

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Capitulo 1: Evaluacin del efecto de pasturas con y sin leguminosa sobre produccin y calidad composicional de la leche y capacidad de reducir emisiones de CH4
1.1.
Introduccin
El efecto invernadero es un mecanismo clave en la regulacin de la temperatura de la tierra, ya que permite que su valor promedio no sea de -6 C sino de 15 C. La tierra retorna la energa recibida del sol al espacio por reflexin de luz y por emisin de calor. No obstante, una parte del calor es absorbido por efecto de los gases de efecto invernadero, siendo los ms importantes en este proceso, el dixido de carbono, el metano, el xido nitroso y los fluorocarbonados. Desde el comienzo del periodo industrial, las emisiones antropognicas han originado un incremento de las concentraciones de estos gases en la atmsfera, resultando en el calentamiento global. El promedio de temperatura de la superficie de la tierra, ha incrementado 0.6 C desde el ao de 1800. Recientes proyecciones sugieren que esta podra incrementar de 1.4 a 5.8 0 C para el 2100. An en el escenario ms optimista, el incremento de la temperatura promedio ser mayor que en los ltimos 10000 aos del presente periodo interglacial (UNFCCC, 2005). El CH4 y el N2O provienen de los diferentes ciclos, el CH4 es usualmente producido despus de la degradacin del carbono (C) durante la digestin del alimento y de las heces, mientras que el N 2O est relacionado al ciclo del nitrgeno (N) con los fertilizantes de sntesis y los estircoles como las mayores fuentes (Wahlen 1993; Monteny et al. 2006). El dixido de carbono es producido por la biota del suelo, las plantas y la respiracin de herbvoros (y fermentacin digestiva), a la vez es consumida va asimilacin por las plantas. El CH4 es principalmente producido por la fermentacin entrica de los rumiantes y es consumida en pequeas proporciones por la oxidacin microbial en el suelo. El N2O es producido por la nitrificacin y denitrificacin microbial y es tambin consumida durante la denitrificacin. La magnitud de esos intercambios es desconocida, pero puede estar influenciada por un amplio rango de sistemas de manejo de pasturas y por condiciones ambientales (Wahlen 1993; Pinares et al.2007). Colombia produce el 0,35% de las emisiones anuales netas de CO2 en el mundo. Sin embargo, a nivel nacional, la agricultura junto con los cambios en uso del suelo emite 15% ms de CO 2 que otros sectores como la industria y el transporte. Se estima que, en promedio, un 8% de la energa bruta que consume un bovino se pierde como metano (gas que tiene 21 veces ms potencial de calentamiento global que el CO2) a travs de los procesos de digestin ruminal. El estado de crecimiento del animal y su condicin gentica, tambin tienen un efecto en la produccin de metano. Existen estrategias para manipular la produccin de metano por unidad de carne o leche producida mediante mejoras de la digestibilidad de la dieta, las cuales incluyen el aumento de carbohidratos no estructurales en la racin (azucares y almidones), el uso de ionoforos (i.e. monensina), de leguminosas forrajeras con taninos condensados y aceites. El aceite de coco ha mostrado un gran potencial para reducir el metano y se esperara un potencial similar en el de palmiste. Adicionalmente, se est investigando el uso de nitratos como alternativa para reducir metano entrico. Las emisiones de metano por unidad de producto tambin se pueden reducir al mejorar los ndices productivos (natalidad, edad a primer parto, intervalo entre partos, edad al 9

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sacrificio). El suelo tiene la capacidad de secuestrar carbono en la materia orgnica y en las races de las plantas. Los sistemas de pasturas de gramneas + leguminosas y los sistemas silvopastoriles favorecen la acumulacin de carbono en el suelo y la biomasa. El xido nitroso (gas que tiene un potencial de calentamiento global 310 veces mayor que el CO 2), es una fuente importante de GEI. En los sistemas ganaderos, el xido nitroso proviene principalmente del uso de fertilizantes nitrogenados en pasturas y de los excrementos (orina y heces) de los animales. Los actuales sistemas de alimentacin de vacas lecheras en explotaciones de lechera especializada de la Sabana de Bogot se basan en pasturas de Penisetum clandestinum solo o Penisetum clandestinum + Lolium (ryegrass) con altos niveles de N (400 Kg/ha/ao), lo cual contribuye a una alta emisin de oxido nitroso (N2O) asociado con el proceso de nitrificacin en el suelo (de Klein et al. 2003). Por otra parte, en la poca seca la cantidad y calidad de forraje disponible en las pasturas se reduce significativamente, lo cual resulta en una reduccin en produccin de leche y a un incremento en las emisiones de metano (CH4) por las vacas. Por otra, parte existe en fincas lecheras de la Sabana de Bogot una alta proporcin de pasturas en suelos en diferentes estados de compactacin, lo cual contribuye a que estas pasturas tengan baja capacidad de secuestrar carbono dadas las limitaciones para el desarrollo del sistema radicular de las gramneas que se utilizan en pastoreo. La asociacin de estas gramneas con leguminosas como el Lotus ha resultado en mayor produccin y calidad composicional de la leche (mas protena) y en una disminucin en la dependencia de la fertilizacin nitrogenada (Crdenas y Panizo, 2005, Castro et al., 2007), lo cual debe repercutir en menores emisiones de N2O. Por otra parte, investigaciones realizadas en Nueva Zelanda han mostrado que con la inclusin en la dieta de bovinos de leguminosas tanferas como Lotus corniculatus y Lotus uliginosus se reducen las emisiones de metano por unidad de MO digerida y litro de leche producido (Waghorn, 2007). Esta propiedad de especies de Lotus no ha sido confirmada en sistemas lecheros en Colombia. Es necesario entonces considerar, de manera integral, las entradas y salidas de gases (balance) de los sistemas en las fincas, incluyendo no slo la produccin de metano y xido nitroso sino la capacidad de las pasturas bien manejadas para acumular carbono en suelo y la biomasa. Existen metodologas in vitro e in vivo para medir el efecto de diferentes dietas sobre la produccin de metano en rumiantes y su utilidad depende del propsito de las mediciones. Entre las tcnicas para mediciones in vivo la tcnica conocida como poli-tnel es apropiada para medir metano entrico de animales estabulados alimentados con diferentes dietas. El uso de la tcnica de la cmara cerrada esttica es una metodologa sencilla para cuantificar emisiones de metano y xido nitroso del suelo y de las excreciones animales en sistemas ganaderos. Los inventarios de produccin de metano por rumiantes, sugeridos por el IPCC (1996) (Tier 1) estn basados en cantidades de datos medidos con animales en cmaras (Blaxter y Clapperton 1965). El Tier 2 propone estimar la produccin de metano conociendo los tipos de animales, el consumo, la calidad del alimento, y la interaccin con el ambiente. As, una tcnica promisoria es la conocida como SF6 (hexafloruro de azufre), en la cual ste, se utiliza como marcador del metano. Sin embargo, su aplicacin se puede ver limitada debido a altos costos de su implementacin, pero su mayor ventaja es la obtencin de medidas en tiempo real, la cuantificacin total del gas producido, se pueden emplear las dietas que se requieran y las repeticiones que se deseen. La tcnica elimina la necesidad de mantener el animal encerrado y 10

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permite el movimiento y el pastoreo del animal. Tambin, no es necesario muestrear directamente desde el rumen del animal porque el uso del trazador representa cambios en la dilucin asociados con el movimiento de cabeza o el aire. Sin embargo, la mayora del metano es eructado y respirado en animales rumiantes, colectado alrededor de la nariz y la boca resultando en una estimacin de la produccin por el animal. La mayora del metano producido en el rumen es absorbido por el torrente sanguneo y respirado, adems, la tcnica del SF6 podra medirlo tambin. 1.2. Materiales y Mtodos
1.2.1 Establecimiento de las pasturas En terrenos de la Empresa comercial Agronegocios de Corpoica en Tibaitat (Ver distribucin en la Figura 1) y en la Finca de Megaleche en Facatativa se establecieron las pasturas : T1: Pastura de Pennisetum clandestinum (Kikuyo) (2 ha) + 400 kg de N (urea) T2: Pastura de Lotus (2 ha) sin N T3: Pastura de Penisetum clandestinum (Kikuyo) (60-70%) + Lotus (30-40%) (2 ha) sin N
Figura 1. Mapeo del lote 47 y distribucin de los lotes Para establecer estas pasturas se aplic una fertilizacin (Kg. elemento/ha) de: 25 P; 15 K; 15 Mg; 15 S y 500 kg de cal dolomita. El Penisetum clandestinum (Kikuyo) puro luego de cada pastoreo se 11

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realiz una fertilizacin de mantenimiento de 50 Kg. de N, mientras que las pasturas de Lotus puro y asociado con Penisetum clandestinum (Kikuyo) no tendrn fertilizacin nitrogenada de mantenimiento luego de cada pastoreo. Variables de respuesta: Disponibilidad y calidad de forraje: Al inicio del pastoreo de cada tratamiento, se tomaron al azar 12 marcos/ha de un metro cuadrado, de forraje a los cuales se les determinar peso verde, materia seca, PC (AOAC 7.033-7.037 1984), FDN, FDA, DIVMS y lignina (AOAC, 1996). Adicionalmente, para determinar la disponibilidad y calidad de las pasturas, se realizo un afore de las pasturas al final del cuarto trimestre del ao 2009 con diferentes das de rebrote de las pasturas: Lotus y Kikuyo + Lotus, rebrote de 70 das y del KIKUYO: 45 das. A estas muestras le fue determinado la composicin qumica en trminos de verde, materia seca, pared celular, fibra detergente neutra (FDN), fibra detergente acida (FDA), % de degradabilidad in vitro de la materia seca (DVMS) la produccin de gas usando la tcnica de Theodurou et al., 1994. Adicionalmente, se tomaron muestras de gases para evaluar la produccin de metanos y cidos grasos voltiles. Anlisis de resultados: Los resultados fueron analizados bajo el modelo sigmoideo de Gomperz y usando el software Curve Expert versin 1.4 (2009). 1.2.2. Efecto de los forrajes Lotus uliginosus, Pennisetum clandestinum y su mezcla sobre la produccin de gas total, produccin de metano y degradabilidad in vitro de la materia seca En una fermentacin in vitro de 94 horas, se determin el efecto de la leguminosa Lotus uliginosus (Lotus), la gramnea Pennisetum clandestinum (Kikuyo) y su mezcla en proporcin 50:50 sobre la produccin de gas, produccin de metano y degradabilidad in vitro de la materia seca. Los tratamientos fueron 100% de Kikuyo, 50% Kikuyo+50% Lotus y 100% Lotus, bajo un modelo completamente al azar, cuando se presentaron diferencias entre tratamientos para el anlisis de varianza, se utiliz la prueba de comparacin no planeada de Tukey, ambas con un nivel de significancia del 5%. La produccin de gas total en volumen expresada en trminos de ml/200 mg de materia seca (MS), fue mayor y significativa para los tratamientos de Kikuyo y la mezcla con 52 y 48.3 ml respectivamente con respecto al tratamiento Lotus (41.3 ml P <0.05), la variable produccin de metano en gramos/200 mg de MS no present diferencias entre los tratamientos (P=0.071), sin embargo se muestra una leve tendencia a disminuir la cantidad de metano para el tratamiento Lotus (3.62 g), seguido por el Kikuyo (4.08 g) y la mezcla presenta la mayor cantidad de metano (4.53 g), atribuyndolo a un posible efecto de aditividad en los forrajes. Finalmente el ms alto porcentaje de degradabilidad in vitro de la materia seca lo obtuvo el tratamiento Lotus en un 87.11% el cual no mostr diferencias con respecto al tratamiento Kikuyo pero si frente a la mezcla con porcentajes respectivos de 84.54 y 83.61 (P<0.05). La variable produccin de gas total no demostr una relacin directa con el porcentaje de degradabilidad de acuerdo con el principio de la tcnica de produccin de gas, sugiriendo que se requiere complementar estas tcnicas con la medicin de los cidos grasos voltiles como posible explicacin a la menor liberacin de gas y mayor prdida de peso en materia seca. Por otra parte, la produccin de metano reportada tericamente para estos forrajes presentaba diferencias, siendo menor para Lotus, lo cual no se reflej en este trabajo. Para futuros trabajos se recomienda cuantificar los niveles de taninos 12

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condensados (TC), para evaluar y comparar los resultados entre ensayos, con forrajes tanferos, con respecto a la cantidad presente de TC y no al porcentaje de inclusin del forraje, teniendo en cuenta que los TC son considerados como uno de los metabolitos secundarios con capacidad de suprimir la produccin de metano ruminal. 1.2.2.1 Material experimental y tratamientos Se colectaron 500 gramos de los forrajes Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus var. Maku en el centro de investigaciones de CORPOICA Tibaitat, ubicada en el Km 14 va Mosquera (Cundinamarca), con altitud de 2650 msnm y temperatura media de 14C. Las muestras se colectaron en el mes de Noviembre del 2009, que report una precipitacin de 70.5 mm mensuales. La edad de corte fue 45 das en un lote de 2 hectreas para cada forraje, el muestreo se hizo a lo largo del lote, cosechando nueve (9) sub-muestras de 500 gr cada una, se congelaron a -20C, liofilizaron, molieron a 1mm y mezclaron para obtener un pool de muestra para cada forraje. Los tratamientos evaluados fueron 100% de la gramnea Pennisetum clandestinum (Kikuyo), 100% de la leguminosa Lotus uliginosus var. Maku (Lotus) y una mezcla de los dos forrajes en proporcin 50:50 Kikuyo:Lotus. 1.2.2.2 Anlisis de composicin qumica Los forrajes fueron analizados para protena cruda con el mtodo Kjeldahl y la composicin de la pared celular, que comprende fibra detergente neutra (FDN), fibra detergente acido (FDA) segn Van Soest (1967), contenido de celulosa y lignina; todos anlisis se realizaron de acuerdo con los protocolos de la AOAC (1995). La protena se fraccion segn el protocolo desarrollado en la Universidad de Cornell, conocido como CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System) para estimar la fraccin soluble e insoluble de la muestra. La degradabilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) se determin por gravimetra modificando la metodologa de Tilley & Terry (1963) en el tiempo de fermentacin y no se realiz la degradacin con pepsina. 1.2.2.3 Fermentaciones in vitro De acuerdo con la metodologa descrita por Bryant (1962) y Hungate (1969), se realizaron las fermentaciones con tres repeticiones por tratamiento en botellas de vidrio transparentes con volumen de 50 ml. Se pesan 200 mg de forraje/botella y se sirve 16 ml de medio anaerobio segn el protocolo descrito por Goering and Van Soest (1970) este consta de: casena como fuente de protena, solucin buffer, solucin macromineral y micromineral, agua destilada, rezasurin como indicador del potencial redox y HCL cistena como agente quelante del oxgeno. El medio se prepara mezclando todos compuestos excepto la HCL cistena, se pre-reduce por calentamiento durante 15 minutos, calibrar el pH en 6.8 y gasificar por 10 minutos con CO2 finalmente se adiciona la HCL cistena. El inoculo utilizado fue fluido ruminal fresco y filtrado colectado de un novillo fistulado de raza Normando de 450 Kg peso vivo, alimentado a base de Kikuyo (Pennisetum clandestinum), sal mineralizada y agua a voluntad, el fluido se colect bajo condiciones de ayuno del animal. Las 13

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fermentaciones se desarrollaron en incubadora a 39C, con agitacin constante de 100 rpm por un periodo de 94 horas. Produccin de gas total in vitro a 94 horas de fermentacin: Para establecer la produccin de gas total se utiliz el Transductor de Presin Manual (TPM) segn el protocolo de Theodorou et al. (1994). A partir de las fermentaciones de los sustratos mencionadas anteriormente se obtuvo una muestra del volumen de gas en ml producido a las 94 horas post-incubacin empleando una jeringa de plstico graduada conectada al transductor (ver figura 2); el gas liberado en el espacio de cabeza de la jeringa se inyecta en botellas de vidrio de 10 ml selladas y al vaco; correspondiendo a la submuestra de gas para posterior anlisis de metano.
Figura 2. Transductor de presin manual Cuantificacin de produccin de metano total: La cantidad de metano en la muestra se determin por cromatografa de gases, en un cromatgrafo Shimadzu GC-14a equipado con detector de ionizacin de llama (FID) y detector de captura de electrones (ECD); las condiciones cromatogrficas fueron las siguientes: precolumna Porapak Q (80-100 mesh), 1 metro longitud y 2 mm dimetro interno, columna Porapak Q (80-100 mesh), 2 metro longitud y 2 mm dimetro interno, fase mvil: nitrgeno de alta pureza, flujo de 22 ml/min, temperatura del horno 70C y del inyector 80C, temperatura del detector (FID y ECD) 320C. El clculo en gramos de metano por 200 mg de materia seca se hizo a partir de la concentracin de metano de la muestra en mg/L (ppm) y el volumen de gas en ml producto de la fermentacin. Degradabilidad in vitro de la Materia Seca: El porcentaje de materia seca degradada se determin como la diferencia entre el peso inicial del sustrato y el peso final despus de 94 horas de fermentacin. 1.2.2.4. Anlisis estadstico El diseo del experimento corresponde a un modelo completamente al azar, con tres (3) repeticiones por cada tratamiento. El modelo se describe como: Yij = + j + ij. Donde Yij es la 14

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respuesta i con el tratamiento j, es la media general, j efecto del tratamiento y ij el error experimental. Los parmetros produccin de gas total (ml), produccin de metano (g/200 mgMS) y % de DIVMS se analizaron por medio de un ANAVA (anlisis de varianza) con un nivel de significancia del 5%, cuando se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos se realiz una prueba no planeada de comparacin de medias con el test de Tukey, con un valor de P<0,05. La hiptesis experimental es Ho= 1= 2= 3 Hi= 1 2 3 donde Ho es la hiptesis nula y Hi la hiptesis alterna. Para la comprobar la validez del modelo, se realizaron las pruebas de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad del error experimental, con la hiptesis nula (Ho) que el error experimental se distribuye normalmente e hiptesis alterna (Hi) que el que el error experimental no se distribuye normalmente y la prueba de Levene para determinar la homogeneidad de las varianzas, con un valor de Zij calculado de: [Yij-promedio Y.j] plantea la Ho= 21 = 22 = 23 = 2 y la Hi= 21 22 23 2. Todas las pruebas se realizaron manualmente usando el programa Excel 2007 y el paquete estadstico SAS versin 9.2, excepto el test Shapiro-Wilk que se ejecut nicamente con el paquete SAS. 1.2.3 Ajuste de la tcnica SF6 para medir emisiones de metano en animales en pastoreo. El desarrollo, la validacin y la aplicacin de la tcnica de mediciones de CH 4 mediante la utilizacin de SF6 como trazador de referencia, implic un trabajo sistemtico que requiri la ejecucin de actividades interdependientes de laboratorio y de campo. Siendo el principio de la tcnica como sigue, la casi totalidad del CH4 emitido por los rumiantes se genera (junto con otros gases en proporciones menores) en el rumen, desde donde es liberado en forma discontinua a travs de repentinas contracciones (eructos). Si se colecta aire a pocos centmetros del ollar del animal durante un lapso largo (por ejemplo 24 hs), el efecto acumulativo de estas discontinuas liberaciones provenientes del rumen, conduce a que en la muestra recolectada la concentracin de CH 4 sea entre 1 y 2 rdenes de magnitud mayor que en una muestra de aire puro (los valores tpicos estn entre 10 y 50 ppmv, a comparar con el valor 1.7 ppmv para el aire recolectado lejos de fuentes concentradas importantes de CH4). Si fuese posible evaluar con razonable precisin que fraccin del gas emitido en los eructos es recolectada, la concentracin de CH 4 en la muestra permitira determinar la cantidad de CH4 liberada en el lapso de recoleccin. Pero esa fraccin depende de una multitud de factores incontrolables, de manera que debe a su vez ser contemporneamente medida o referenciada. La idea (Johnson, K. A. y Westberg, H. H., 2004) (Johnson, K. et al, 1994)1 es colocar en el rumen del animal en estudio una cpsula que emite un gas a una tasa constante y bien conocida, el cual tambin se acumula en el rumen y es liberado en los eructos junto con el CH 4. Este gas, debe actuar como trazador, es decir permitir referenciar el gas colectado con el tiempo de liberacin del mismo. Ello significa que si la cantidad total de trazador liberada en el lapso de muestra es conocida, multiplicando esta cantidad por la razn de las concentraciones CH4/trazador en la muestra recolectada se obtiene la emisin de CH4 en el mismo lapso. El trazador elegido debe cumplir con ciertos requisitos: no debe ser ni txico ni qumicamente reactivo, debe encontrarse en muy bajas concentraciones en la atmsfera pura y debe ser posible medir su concentracin hasta valores muy bajos, porque el volumen que se acumula en el rumen debe ser despreciable respecto al 15

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volumen de CH4. La eleccin adoptada es el SF6 (Maiss, M., 1996), gas muy inerte, presente en la atmsfera pura en concentraciones del orden de 6 pptv, es decir, en el rango de las concentraciones que pueden ser determinadas con precisin mediante cromatgrafos dotados de detectores de captura electrnica (ECD). De esta somera descripcin surgen tambin los elementos bsicos del sistema de medicin. Ellos son: i. las tubos de permeacin de SF6 a colocar en los rmenes de los animales bajo estudio, ii. Los yugos que deben ser colocados vacos (presin del orden de mb) sobre los animales con capacidad de cerca de 500 mb en un lapso de recoleccin (24 hs), iii. Las vlvulas y los reguladores de ingreso de gas, y iv. Las instalaciones y equipos para el anlisis de las muestras son: 1. La tcnica del trazador SF6 para medir metano en pasturas tiene 3 componentes: a) un tubo permeable que contiene SF6 dentro del rumen del animal siete das antes de iniciar la fase experimental, b) una membrana de tefln que controla la liberacin del SF6 por el tubo permeable y c) el anlisis de las concentraciones de CH4 y SF6 en las muestras colectadas. Antes de introducirse en el animal, ese tubo permeable se llena con 1.1 g de SF6 y es pesado semanalmente por mnimo dos meses para establecer la tasa de liberacin del SF6. La tasa de liberacin de ocho tubos (uno por cada animal) vara entre 4.3 y 4.93 mg/da por lo que se debe estimar una constante de flujo durante uno a 3 meses antes de iniciar el estudio. 2. El aire que sale de la cavidad nasal contiene gases respirados y eructados los cuales son arrastrados hacia un tubo de PVC dentro del cual hay un canister, este implemento es ubicado usualmente alrededor del cuello del animal. El flujo dentro del canister es evacuado diariamente y las concentraciones de SF6 y CH4 son analizadas empleando un cromatgrafo de gases. 3. Despus de 24 horas de cada muestreo, a los yugos se les aplica nitrgeno presurizado. Se toman tres submuestras de 20 ml de cada canister con una jeringa e inyectadas dentro de una columna de 6.8 ml, como lo describen Rochette y Bertrand (2003) para el anlisis en el cromatgrafo de gases. 4. La tasa de la mezcla SF6 y el CH4 (umol/mol) en el canister (CSF6 y CCH4, respectivamente) y la tasa de liberacin del SF6 (QSF6: g/da) se emplean para determinar la emisin de CH 4 (QCH4: g/da) usando la ecuacin descrita abajo. Los residuos encontrados en los canister son CbSF6 y CbCH4, respectivamente, los cuales fueron sustrados desde CSF6 y CCH4 respectivamente. 5. La proporcin de los pesos moleculares (PM) son empleados para contabilizar por diferencia la densidad entre gases:
QCH4= [(CCH4 - CbCH4)* QSF6/(CSF6 - CbSF6)]*[MWCH4/MWSF6]
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1.2.3.1. Animales experimentales Para el desarrollo de las actividades se utilizaron quince (15) vacas lactantes de raza Holstein, en base a nmero de partos (2 a 3) y tercio de lactancia (segundo), las cuales eran parte del hato comercial del centro de investigacin Tibaitat de CORPOICA (Mosquera, Cundinamarca, 2650 msnm y temperatura media de 14 C), a los animales seleccionados se les ajust un anillo de PVC en el cuello con el canister, que recibi las emisiones de gases de una capsula con SF6 que se coloc en el rumen de cada vaca por medio de un tubo 7 das antes de iniciar el ensayo de emisiones de metano de vacas en pastoreo con la tcnica SF6. A las vacas experimentales en las diferentes pasturas se les suministr diariamente despus del ordeo de la maana y la tarde un concentrado comercial a razn de 1 kilo por cada 4 litros de leche. Los animales se encontraban en el lote de 6 hectreas descrito arriba, las cuales se distribuyen en tres sub-lotes de 2 hectreas cada uno, dependiendo el rgimen alimenticio. El sub-lote 1 se compona en un 90% de Pennisetum clandestinum (kikuyo) y 10% de gramneas como falsa poa (Holcus lanatus) y raigrs (Lolium multiflorum), el sub-lote 2 corresponde a una asociacin de Pennisetum clandestinum (kikuyo) y Lotus uliginosus (lotus) en proporcin aproximada de 60:40 respectivamente y el sub-lote 3 contena la leguminosa tanfera Lotus uliginosus (lotus) en mayor concentracin, cercana al 80% y un 20% restante en otros forrajes. En cada sub-lote, se alojaron 5 vacas, bajo un sistema de pastoreo rotacional con franjas de 10 x 3 metros, ofreciendo el forraje de 45 das de edad, a voluntad a partir de las 8:00 am todos los das, durante un periodo de 21 das. En la tabla 1, se indica la nomenclatura de los animales, agrupados segn la dieta. Los animales rotaron entre los sub-lotes, en un periodo de 21 das de adaptacin a la dieta, el ltimo da de cada periodo se realizaron los muestreos de contenido ruminal correspondientes, como se presenta en la tabla 2. Tabla 1. Nomenclatura y distribucin de los animales Grupo Nomenclatura de los animales 1 0068, 0294, 0334, 0566 y 0628 2 0226, 0374, 0344, 0550 y 0622 3 0298, 0376, 0382, 0886 y 0648. Tabla 2. Periodos experimentales y muestreos de contenido ruminal Fecha de muestreo Pradera Kikuyo Pradera (naranja) kikuyo:Lotus (azul) (1M) 17 enero/11 Todos los animales -(2M) 9 febrero/11 1 2* (3M) 4 marzo/11 3 1 (4M) 28 marzo/11 2 3 (5M) 20 marzo/11 1 2 (6M) 6 mayo/11** 3 1 M= muestreo *Del animal N 0226 no se obtuvo muestra de contenido ruminal. 17
Pradera Lotus (rojo) -3 2 1 3 2

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** Por razones de manejo, los animales 0294(G1), 0374(G2) y 0886(G3) salieron del experimento para este muestreo, quedando 4 animales en cada pradera.
1.2.3.2 Identificacin de poblaciones de microorganismos en el rumen y parmetros de fermentacin ruminal Para obtener muestras de contenido del rumen, se utiliz la tcnica modificada de sonda ororuminal descrita por Martn et al., (2005), que consta de una sonda plstica de 3m con un dimetro externo de 1 pulgada y 3mm de pared, en la parte distal presenta varios agujeros que facilitan la succin del contenido en el rumen. La sonda se conect a un recipiente de toma de muestra con acoples hermticos de doble entrada, conectando simultneamente la sonda y una bomba de vaco para obtener aproximadamente 100 ml de contenido de rumen por animal tal como se muestra en la figura 3.
Sonda plstica
Bomba de vaco
Figura 3. Materiales para sondeo oro-ruminal de contenido de rumen.
Las muestras de contenido de rumen se llevaron al laboratorio de microbiologa molecular del Centro de Biotecnologa y Bioindustria (CBB) de Corpoica, donde se determin el pH con potencimetro (Hanna instruments., Italia) y se almacenaron las muestras a -20C en tubos de 15 ml para liofilizar, tal como lo muestra la figura 4.
Figura 4. Procesamiento y pH de las muestras de contenido de rumen. 18

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Extraccin y cuantificacin de ADN La extraccin de ADN de muestras de contenido de rumen, se realiz basado en el protocolo descrito por Denman y McSweeney (2005), modificado por Phandanouvong et al. (2010). Del material liofilizado y macerado, se transfirieron 20 mg de contenido de rumen a tubos para microcentrfuga con 0.25 g de perlas de vidrio estriles, con dimetro de 1 mm. El proceso de lisis celular fue logrado por procesos fsicos, qumicos y enzimticos, iniciando por el proceso de agitacin usando un Mini Bead-Beater-8 a 4000 rpm durante 2 minutos, seguido por una lisis qumica con buffer acetato de potasio y agua grado molecular y finalmente se realiz una lisis por choque trmico de -70C a 100C. El material fue centrifugado a 13000 rpm a 4 C y 15 minutos, el sobrenadante obtenido fue incubado a 37C con lisozima durante una hora. Tras la digestin enzimtica se centrifug nuevamente y el sobrenadante obtenido se transfiri a un nuevo tubo junto con una matriz de ligamiento de slica para el ADN (Glass milk). Para retirar residuos como protenas, cidos orgnicos y carbohidratos que afectan la calidad del ADN, se utiliz etanol fro al 70%. La recuperacin del ADN se realiz con 100 L de agua grado molecular y almacenado a 4C para su posterior cuantificacin. La cantidad y calidad del ADN obtenido, se determin con nanoespectrofotmetro ND-100 (NanoDrop, Wilmington, USA) a una longitud de onda de 260 nm. La concentracin de ADN se estim en ng/l y la pureza del mismo, se estim a partir de la relacin entre la absorbancia 260/280 nm, siendo el ptimo un rango de 1.8 a 2.0. El ADN extrado se diluy a una concentracin de 10 ng/L y se utiliz como templado en las posteriores anlisis moleculares.
Amplificacin por PCR del gen 16s ARNr de la poblacin de metangenos y protozoarios totales. La seleccin de primers o cebadores especficos utilizados en este trabajo para el grupo de metangenos del rumen, se realiz basado en los reportes de literatura de Zhou et al., (2010), Yu et al.,(2008), Whitford et al., (2001) y se reportan en la tabla 3 con su respectiva secuencia. La poblacin de protozoarios se cuantific utilizando los primers descritos por Mayorga (2009), que en la tabla 3 se describen sus secuencias.
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Tabla 3. Listado de primers seleccionados para metangenos y protozoarios del rumen. Nombre del primer Secuencia Tamao del amplmero de 5 a 3 Met86F GCTCAGTAACACGTGG 800 pb Met915R GTGCTCCCCCGCCAATTCCT Arc 344f * (V3) ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA 200 pb 519r (V3) GWAATACCGCGGCKGCTG MT-F TTCGGTGGATCDCARA GRGC 128 pb MT-R GBARGTCGWAWCCG TAGAATCC 316F (Protozoarios Totales) GCTTTCGWTGGTAGTGTATT 539R (Protozoarios Totales) ACTTGCCCTCAAATCGT 125 pb
F indica Forward y R Reverse. Al primer Arc 344f* se adicion el gancho de GC con secuencia: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG Anlisis cuantitativo de las poblaciones de metangenos y protozoarios totales por qPCR. Los anlisis cuantitativos de las poblaciones de metangenos y protozoarios, por qPCR se desarrollaron usando el termociclador IQcicler real-time PCR system (Biorad, Hercules, CA, USA), con SYBR green en mezcla como fluorocromo (Fast SYBR green master mixture; Applied Biosystems, Foster City, CA), con un volumen final de reaccin de 16 L, siendo 12 L de la mezcla de reaccin y 4 L de ADN en concentracin de 10 ng/L, con tres replicas por muestra. Para la construccin de las curvas de calibracin, se utiliz como ADN estndar, el ADN total de contenido de rumen de bovinos en pastoreo de kikuyo, en diluciones seriadas desde 1x101 ng/L hasta 1x10-4 ng/L en agua grado molecular. Para calcular los ng ADN/g de materia seca de contenido ruminal, se utiliz la ecuacin ng ADN/g MS = (SQmeans x C x DV)/(S x V). Donde SQmeans es el promedio de nmero de copias cuantificado por qPCR, C es la concentracin de ADN de la muestra, DV es el volumen de dilucin del ADN extrado, S es la cantidad de ADN en ng utilizado en el anlisis y V es la cantidad en mg de contenido de rumen liofilizado para la extraccin, los datos se ajustaron por el logaritmo en base 10 (Log10). Por otra parte, la eficiencia (E) de la PCR se calcul como E= [10 (-1 /pendiente) 1] x 100%, siendo un ptimo de 95 hasta 105%. La poblacin de metangenos totales de las muestras de contenido de rumen de bovinos en pastoreo, se determin por el nmero de copias del gen 16s ARNr, utilizando los primers universales para metangenos descritos en la tabla 3, como MT-F y MT-R. El programa de 20

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amplificacin, incluyendo la curva de melting, contiene un ciclo de denaturacin inicial de 95C/ 2 minutos, 55 ciclos de 95C /15 segundos, un anillamiento de 60C/1 minuto y un descenso de 95C hasta 60C con intervalos de 0.5C para crear la curva de temperatura melting (T fusin). La poblacin de protozoarios totales se determin por el nmero de copias del gen 18s rRNA, usando los primers 316F y 539R (tabla 3). El programa de amplificacin, incluyendo la curva melting, se conforma por un ciclo de denaturacin inicial de 95C/10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95C/15 segundos, un anillamiento de 54C/1 minuto y un descenso de 95C hasta 60C con intervalos de 0.5C para crear la curva de temperatura melting (T fusin). Anlisis cualitativo de las poblaciones de metangenos totales por PCR-DGGE. Para la creacin de los perfiles electroforticos y analizar la diversidad de los metangenos en muestras de rumen, se utilizaron geles en poliacrilamida con urea como gradiente denaturante en gradiente lineal 35:60%, a partir del producto de una PCR anidada, donde la pareja de primers o cebadores universales para metangenos Met86F y Met915R, fueron usados en una PCR inicial para amplificar un fragmento de 800 pb del gen 16s ARNr, empleando un termociclador ESCO Swift mini. La mezcla de reaccin de PCR contiene buffer 10X, BSA 20X, MgCl 2 50 mM, mezcla de dNTPs a 10mM, Taq polimerasa 5U/L, primers re-suspendidos a 10 mM y agua grado molecular libre de ADNasas y ARNasas. La cantidad de ADN diluido a 10 ng/L usado como templado fue de 2 L, para obtener una reaccin final de 25 L. El programa utilizado consiste de una fase de denaturacin inicial de 94C x 30 seg, seguido de 30 ciclos con una fase de denaturacin de 94C x 30 seg, el anillamiento de 57C x 30 seg y la extensin de 68C x 1 min, una fase de extensin final de 68C x 7 min. El producto de la PCR inicial fue utilizado como templado para amplificar una PCR anidada usando la pareja de primers universales GC-Arc344f/519r, los cuales corresponden a la regin V3 del gen 16s ARNr. (El primer forward Arc344 posee el gancho de guanina-citocina (GC) caracterstico para la corrida electrofortica en gel de poliacrilamida). Las condiciones de amplificado de la PCR anidada son: denaturacin a 95C x 5 minutos, 30 ciclos de 95C x 30 segundos, 56.5C x 30 segundos y 72C x 30 segundos; una elongacin final de 72C x 7 minutos. El volumen y la mezcla de reaccin para la PCR anidada son iguales a las descritas en la PCR inicial. Los amplicones de PCR fueron separados usando un gel de poliacrilamida al 6% en buffer TAE 0.5X con un gradiente de denaturacin lineal de 35 a 60%, utilizando una cmara de electroforesis vertical DCode Universal mutation detection System (Laboratorios BioRad, Inc., Hercules, CA). Las condiciones de corrida del gel fueron a 60C, 80 V por 14 horas. Al finalizar la corrida, se tieron los geles en 250 ml de TAE 0.5X con 10 L de SYBR safe durante 20 minutos, posteriormente se visualizaron con luz ultravioleta y se fotografiaron usando un documentador de geles (GelDoc System) equipado con un software equipado para anlisis molecular (BioRad, Hercules).
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La similaridad o diferencia de los perfiles fue determinado por la comparacin y el agrupamiento (clustering) de los perfiles completos generados por PCR-DGGE, con el software Quantity One versin 4.6.3. Las matrices de similaridad se produjeron usando el coeficiente de Dice (Dsc), con el cual se construyeron dendogramas usando el algoritmo de agrupamiento UPGMA (unweigthed pair group method using arithmetic averages) (Fromin et al., 2002). La comparacin de similaridad de cada perfil se obtuvo en porcentaje basado en el anlisis de cluster, el promedio del coeficiente de similaridad de Dice (Dsc) fue usado para comparar los perfiles entre dietas y entre animales dentro de cada dieta.
1.2.3.3 Diseo estadstico El diseo experimental de este trabajo corresponde a un modelo de sobre-cambio simple, el modelo se describe como Yijk = + Ti + Vj + Pk + Eijk. Donde es la media general, Ti el efecto del tratamiento i con i= 3 praderas, Vj corresponde al efecto de la unidad experimental j, con j= 5 vacas por tratamiento, Pk es el efecto del periodo k, con k= 3 periodos de 21 das y Eijk es el error experimental del efecto del periodo y los tratamientos (Kaps y Lamberson 2004). Todos los animales recibieron todos los tratamientos durante los diferentes periodos. Los muestreos descritos en la tabla 2 como 2M, 3M y 4M que comprenden desde el 9 de febrero hasta el 28 de marzo del 2011, estarn sujetos al anlisis estadstico de acuerdo con la descripcin previa del modelo. Para evaluar las diferencias entre las dietas en las poblaciones, se realizar un anlisis de varianza (ANAVA) y a partir de una prueba F, si se observan diferencias significativas entre tratamientos, se realizar una prueba de comparacin de medias no planeada de Tukey con nivel de confianza del 5% usando el paquete estadstico SAS versin 9.2.
1.3 Resultados 1.3.1 Establecimiento de las pasturas Para el primer ao de establecimiento los tratamientos, en general se observa que los rendimientos de biomasa presentan diversidad en la composicin botnica de la pastura. Produccin de biomasa: LOTUS 361 (g MS/m2), LOTUS + KIKUYO 190 (g MS/m2) y KIKUYO 129 (g MS/m2). La produccin de biomasa del Kikuyo puro es similar a lo reportado por diversos autores para la regin occidente de la sabana de Bogot, la cual oscila entre 90 170 g MS/m2. La asociacin Kikuyo + Lotus presenta un incremento en la produccin de biomasa de 47% con la inclusin de la leguminosa. Sin embargo, a pesar de la mayor produccin de biomasa (179 % ms que la del Kikuyo) en el tratamiento de Lotus puro, existe una alta proporcin de maleza y trbol similar a la de Lotus, la cual sera difcil erradicar, mientras que la gramnea presente puede ser removida. Se espera iniciar el pastoreo de los tratamientos en el primer trimestre del ao, considerando que los cambios climticos anunciados por el IDEAM no sean drsticos (heladas y falta de agua) los cuales afectaran la cantidad y calidad de la biomasa. Para ello se va a mantener el riego por gravedad, se aplicar herbicida selectivo a hoja angosta para eliminar la gramnea en Lotus puro y se controlar 22

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la maleza manualmente en la asociacin, donde sera imposible erradicarla con herbicida debido a la presencia de la leguminosa. La composicin qumica de la pradera de Lotus sembrado en lote 47 de CI Tibaitata fue: Protena Cruda (28.56 %), FDN (40.15 %), FDA (19.69 %), Lignina (2.23 %), Celulosa (11.07 %). Adicionalmente, en trminos de fraccionamiento de las protenas de acuerdo su degradabilidad de acuerdo al protocolo de Cornell, el Lotus contiene: Protena A (Nitrogeno No Proteico) (20.95 %), Protena B1 (Proteina Verdadera) (10.91 %), Protena B2 (31.08 %), Protena B3 (21.66 %), Protena C (15.40 %), Protena Soluble en Buffer (A+B1) (31.86 %).
Tabla 4. Produccin de forraje verde y % MS por tratamiento TRATAMIENTO LOTUS KIKUYO ASOCIADO LOTUS ASOCIADO KIKUYO FV g/ m2 1176,2575 1581,503 725,8825 477,875 MS %/ m2 14,16 26,86 15,59 16,92
Durante el todo el seguimiento y la realizacin del proyecto se llevan un control de actividades el cual es registrada diariamente en un libro de campo, en el cual tambin es monitoreada la precipitacin diaria registrada por el pluvimetro. La informacin llevada en este libro es la que se encuentra resumida en general en este informe, y adjuntando las precipitaciones anuales, la cual reporta que en el ao 2009 una precipitacin de 432,5 mm y en cuanto lo registrado en el ao presente es de 376 mm. Una vez las pasturas fueron establecidas, las praderas de Kikuyo, Lotus y Kikuyo+ Lotus para el bioensayo con vacas de leche fueron sincronizadas en su utilizacin en un proceso de pastoreo rotacional, con un perodo de pastoreo de 45 das (46 unidades de pastoreo); igualmente se desarrollaron procesos de control de arvenses y construccin de cercas fijas y elctricas. Datos climatolgicos de la zona Una de los problemas acaecidos durante el presente semestre fue las fuertes lluvias inesperadas que sobrepasaron los promedios histricos, lo que ha postergado el montaje del ensayo de campo. Para lo cual se anexan los promedios mensuales de precipitacin, siendo el mes de noviembre y diciembre los que impidieron el normal pastoreo hasta enero que se inicia el verano (Tabla 5).
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Tabla 5. Promedio de precipitacin histrica mensual y ltimos 6 meses en la zona occidente de la Sabana de Bogot Mes Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Histrico mensual 10 aos 89 70 65 47 75 85 45 Precipitacin promedia mensual 2010 109 85 45 40 85 210 141
Pasturas de Lotus, Lotus + Kikuyo y Kikuyo Las pasturas se establecieron y permanecieron con una alta proporcin de leguminosa Lotus (75 % Lotus, 15% Trbol blanco y 10% de malezas-gramneas). Lotus + Kikuyo (65% Lotus, 15% Trbol blanco y 30% Kikuyo). Kikuyo (95% Kikuyo, 5% Trbol blanco)
Manejo de las praderas durante la poca de invierno Hacia el final del ao de 2010 se tena previsto la iniciacin de las mediciones de metano y SF6, pero las lluvias abundantes, que superaron el promedio de la ltima dcada, inundaron gran parte de las unidades de pastoreo (+/- 35% del rea de pastoreo inundada) (Figura 5 a 8), afectando la proporcin de las especies (degradando la gramnea y mejorando al Lotus, la cual es una leguminosa que tolera encharcamiento prolongado). Luego de pasar el perodo de lluvias, se deber realiza una nueva composicin botnica y de rendimiento de biomasa) para estimar la carga animal posible de soportar.
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Figura 5. Cabecera de los Lotes de Lotus Kikuyo
Figura 6. Cabecera de lotes de Lotus +
Figura 7. Lotus en pasturas inundadas Composicin qumica de los forrajes
Figura 8. Sobrevivencia del Lotus bajo inundacin
La composicin de los forrajes en cuanto a protena y pared celular se presenta en la tabla 1. Donde se observa que la leguminosa posee menor proporcin de fibra indigerible como lignina con respecto a la gramnea, tambin se muestra menores contenidos de carbohidratos estructurales (FDN) relacionados directamente con la produccin de metano ruminal. En cuanto al porcentaje de protena cruda (PC), la leguminosa posee altos contenidos con respecto a la gramnea, sin embargo la diferencia entre los forrajes es pequea en comparacin con el reportado por Chipatecua et al., (2007) quienes en la misma zona de muestreo reporta valores de 18.5 y 34.8 % para Kikuyo y Lotus respectivamente. Posiblemente las condiciones de manejo (riego y fertilizacin) y climticas generan esta amplia diferencia entre los mismo forrajes en la misma zona geogrfica. Para el fraccionamiento de la protena en % con respecto al % de PC, el Kikuyo tiene un mayor porcentaje de protena soluble influenciado por altos valores de nitrgeno no protico y fraccin B1, a pesar de 25

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ello, la fraccin B2 conocida como protena verdadera es mayor para Lotus, la fraccin insoluble (C) tiene grandes diferencias entre los forrajes, siendo mayor para Lotus; estos datos sugieren que la presencia de taninos condensados que se reportan para el Lotus (Chipatecua M., et al., 2007, Castro et al., 2007, Woodward., et al 2001 y Tavendale M.H., et al. 2005) que poseen la caracterstica de ligar las protenas y evitar su degradacin por los microorganismos del rumen sea la causa por la cual existe mayor disponibilidad de protena soluble en Kikuyo (libre de taninos) con respecto al Lotus (Tabla 6). Tabla 6. Composicin qumica de los forrajes en % de Materia seca. Parmetro Pared celular FDN FDA Lignina Celulosa Protena cruda NNP Protena B1 Protena B2 Protena B3 Protena C Fraccin A+B (soluble) 40.15 19.69 2.23 11.07 Fraccionamiento de la protena 28.56 20.95 10.91 31.08 21.66 15.4 84.6 46.78 15.09 5.08 7.04 24.93 22.81 22.8 26.32 24.55 3.52 96.48 Lotus Kikuyo
1.3.2 Produccin de gas, produccin de metano y degradabilidad in vitro. Los resultados para la produccin de gas total en ml, produccin de metano en g/200 mg MS y el porcentaje de degradabilidad in vitro de la materia seca tras una fermentacin in vitro a 94 horas de 200 mg de forraje en materia seca, usando la tcnica de produccin de gas descrita por Theodorou et al., (1994) se muestran en la tabla 7. El Kikuyo y su mezcla con Lotus presentan la mayor cantidad de gas con respecto al tratamiento de Lotus puro o en 100% de inclusin, con valores de 52 y 48 ml vs 41 ml para la leguminosa respectivamente, siendo significativa la diferencia entre la gramnea pura y la mezcla 50:50 gramnea:leguminosa frente a una leguminosa tanfera (P=0.002) como lo muestra la tabla 2. ste parmetro es utilizado como un indicador de la degradabilidad de un sustrato. En una revisin de Giraldo et al., (2007), el principio propuesto por McBee (1953) y Hungate (1966) que el volumen de gas en ml determina la degradacin o fermentacin ruminal potencial de los alimentos, teniendo en cuenta al gas como un producto de la fermentacin, se asocia que a mayor produccin de gas 26

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mayor afinidad expresan los microorganismos para degradar un sustrato asociado a la composicin del forraje (Getachew et al., 1998). Sin embargo, este principio no se comprueba a partir de los resultados de este trabajo, pues la degradabilidad en trminos de prdida de peso fue mayor para Lotus que presenta la menor produccin de gas. Esta contradiccin, posiblemente se debe a que el gas no es el nico producto de la fermentacin, los cidos grasos voltiles (AGV) son el producto principal de la degradacin, posiblemente el Lotus liber menor cantidad de gas pero produjo mayor concentracin de AGV durante la fermentacin, lo cual es una caracterstica deseable pues stos son la fuente principal de energa de los rumiantes. (Van Soest., 1994). Por otra parte, la degradabilidad fue significativamente mayor para el tratamiento Lotus y menor en la mezcla, la gramnea sola (100% Kikuyo) no reporta diferencias con respecto al Lotus ni a la mezcla (P=0.029). Esta respuesta tambin se explica por el efecto de los contenidos de FDN inferiores para Lotus que facilitan la colonizacin y degradacin del sustrato (Van Soest., 1994). La degradabilidad de la mezcla fue menor, teniendo en cuenta el efecto de aditividad en las asociaciones, esta variable puede presentar efectos negativos cuando uno de los forrajes de la mezcla posee taninos condensados (Rosales M, 1996). La produccin de metano en 94 horas no fue diferente entre los tratamientos (P=0.071). A pesar de no mostrar diferencias significativas, existe una tendencia a producir menor cantidad de metano para la leguminosa tanfera Lotus, congruente con las mediciones in vitro e in vivo para este forraje en otros trabajos (Waghorn et al., 2002 y Tavendale et al., 2005). En la tabla 25 se observa que la mezcla expresa algebraicamente la mayor produccin de metano, probablemente, el metano tiene un comportamiento aditivo, pero no se determin en este trabajo, a pesar de ello, Rosales M (1996) demostr que existe efecto asociativo, probando la aditividad en mezclas de gramneas y leguminosas de trpico bajo con contenidos de metabolitos secundarios, entre ellos taninos condensados. Tabla 7. Produccin de gas total, produccin de metano y degradabilidad in vitro de materia seca de Kikuyo, Lotus y su mezcla en 94 horas de fermentacin. Tratamientos Parmetros Kikuyo Mezcla (50:50) Lotus Valor P a a b Produccin de gas total (ml) 52 48.3 41.3 0.0025 Produccin de metano (g/200 mg de MS) 4.08 4.53 3.62 0.071 ab b a DIVMS en % 84.54 83.61 87.11 0.029 DIVMS: Degradabilidad in vitro de la materia seca. Valores con diferente letra en la misma fila indica diferencias significativas con P<0.05. La validez de los resultados presentados se determin a partir de pruebas estadsticas para comprobar que se cumplieran los supuestos del modelo completamente al azar. Todas y cada una de las variables cumpli con que la media del error experimental fuese cero (0) con probabilidad de 1, y aceptar la hiptesis nula para Levene Ho= 21 = 22 = 23 = 2 con una probabilidad de P<0.05 . La tabla 8 presenta en resumen los valores de probabilidad obtenidos para las dos pruebas en cada variable analizada. 27

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Tabla 8. Resumen de las probabilidades obtenidas para las pruebas de normalidad del error experimental y homogeneidad de varianzas en cada variable de estudio. Valor P Valor P Shapiro-Wilk Test Levene Produccin de gas total 0.6369 0.3594 Produccin de metano 0.5514 0.5081 Degradabilidad in vitro MS 0.3141 0.1002 La Ho se acepta si el valor P (probabilidad) es mayor a 0.05 o 5% de nivel de confianza. Variable respuesta
1.3.3 Establecimiento de la tcnica de SF6 Durante la ejecucin del proyecto se realizaron tareas de laboratorio tendientes a la preparacin, calibracin y ensayos de homologacin de los diferentes elementos necesarios para las mediciones del gas trazador SF6, as como al desarrollo de elementos nuevos en la adaptacin del cromatografo y el sistema de vlvulas bombas acopladas al sistema de su inyeccin. Al igual que el diseo, construccin, calibracin, mantenimiento y seguimiento de los equipos de medicin a campo adaptados a las condiciones de trabajo reales, incluyendo la seleccin de materiales y componentes. Como los son la calibracin de cpsulas de emisin de SF6 (trazador de referencia) y de los yokes de recoleccin de emisiones, la puesta a punto y ejecucin de tcnicas para mediciones de las mezclas de CH4 y SF6 en las muestras colectadas. Para dar orden a la descripcin nos referiremos por separado a las tareas relacionadas con el desarrollo y la puesta a punto de los componentes principales del sistema de medicin, a saber: tubos de permeacin de SF6, recipientes recolectores, reguladores de ingreso y metodologa de anlisis. Tubos de permeacin de SF6 Ellos son una cavidad en una barra de bronce y cerrada mediante una membrana de tefln (mecnicamente sostenida por una microgrilla de acero). En ella se encuentran en equilibrio las fases gaseosa y condensada de SF6 (inicialmente algunos gramos), lo cual, a 39 C, temperatura en el rumen, significa una presin de vapor de alrededor de 50 bar. Se origina, entonces, un flujo de gas a travs de la membrana, prcticamente constante mientras no cambie el valor de la presin, cuyo valor est regulado por la temperatura (ley de Clausius-Clapeyron) mientras las dos fases coexisten. En la primera etapa del proyecto se requiri del diseo y construccin de 5 juegos de 25 tubos de permeacin y posterior calibracin de ellos durante 2, 4 y 6 semanas, los cuales sern introducidos en el rumen de los animales usados en el trabajo de campo. La calibracin, es decir la determinacin precisa de las tasas de emisin de SF6 es realizada en una incubadora a temperatura controlada de 39C, lo cual consiste en pesar peridicamente las cpsulas mediante una balanza analtica (precisin 0.1 mg); la progresiva disminucin de las masas permite determinar el flujo de salida del SF6. 28

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Seleccin de los tubos de permeacin (TP) La seleccin de los TP, se realiz con base en el pesaje secuencial de los tubos durante diez semanas entre el 17 de noviembre de 2010 hasta el 29 de enero de 2011, luego de varios ensayos fallidos por obtener permeaciones consideradas como significativas para la determinacin del marcador SF6 En los yugos. En este sentido, las permeaciones promedias obtenidas en el presente trabajo fueron altos al ser comparados con otras investigaciones referenciales de Nueva Zelanda y Canad(Tabla 1), las cuales fueron realizadas cercanas al nivel del mar. De los 25 TP llenados, fueron seleccionados 15 de ellos, por una mayor prdida de peso, lo cual segn la metodologa propuesta por Johnson y Johnson (1995) y Lassey et al (2001), se consideran equivalente a la TP. Posteriormente, estos tubos fueron ubicados en el retculo-rumen de 15 vacas seleccionadas al azar, para luego ser muestreadas (Tabla 9). Tabla 9. Tasas de permeacin obtenidas en trabajos de investigacin Tasa de permeacin de SF6 Pas (mg/d) Nueva Zelanda Canad Colombia 2,5 3,9 4,3 4,9 4,5 7,6 Mcnaughton et al. 2009 McGinn et al. 2006 Crdenas sin publicar Referencia
Este hallazgo permite que las tasas de permeacin de los tubos supera el reto metodolgico que a mayor altitud la presin atmosfrica es ms baja y podra afectar la determinacin del marcador (SF6 ) y del metano, datos similares han sido reportados por Lula da Silva et al. (2004). Tabla 10. Permeacin, correlacin y asignacin de Tubo de permeacin a unidad experimental en cada tratamiento. No. TP A17 A05 A13 TP1 4,956 5,419 5,698 R2 0,9993 0,9995 0,9932 Vaca 344 550 226 K+L Tratamiento
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A25 A20 A36 A06 A10 A27 A14 A38 A16 A31 A15 A02
6,050 7,616 4,879 5,268 5,568 5,967 7,431 4,488 5,721 6,119 6,655 7,379
0,9994 0,9994 0,9995 0,9996 0,9995 0,9994 0,9993 0,9995 0,9995 0,9996 0,9997 0,9993
622 374 334 566 68 628 294 886 298 382 648 376 LOTUS KIKUYO
La seleccin de estos tubos se realiz con aquellos permeaciones que presentaron un mayor coeficiente de determinacin (R2), siguiendo los patrones de protocolos de seleccin de tubos realizados en otros trabajos de investigacin, donde se ha medido metano entrico bajo pastoreo (Pinares-Patio et al. 2005; McGinn et al (2006). Diseo de yugos, cabezales y reguladores tipo capilar Los yugos fueron hechos en PVC en forma de U de volumen total 1.5 l para ser montados sobre la cruz de los animales. Los yugos se construyeron con caos de PVC reforzados, de 50 mm OD y 42 mm ID. Dos tramos de 50 cm fueron cerrados con tapas de PVC en un extremo y unidos por los extremos abiertos mediante un codo hecho en madera. Todas las juntas fueron selladas con pegamento especfico para PVC y, luego, selladas externamente. El arreglo fue curvado en un horno industrial a 150 C para lograr la forma de U deseada. La capacidad de los yugos es la adecuada para que en 24 horas ingresen unos 500 mb de aire a travs de los reguladores de ingreso (Ver figura 9 y 10). 30

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Figura 9. Capilares para yugos
Figura 10. Yugos calibrados
Cada uno de los yugos y de los tubos fue dotado de una vlvula. Las valvulas fueron terminadas, por un lado, con una rosca macho , que facilit su insercin en los yugos y tubos, y por el otro con una rosca hembra similar, a la cual se ados un conector que posibilita el ensamble rpido y reversible con tubos plsticos similares a los usados para el retculo, con el cual pueden entonces ensamblarse fcilmente as como con otros elementos. En los yugos, las vlvulas fueron instaladas en los codos, mediante perforaciones con la correspondiente rosca hembra. En cambio, en los tubos, fueron montadas sobre la parte plana de una tapa y fijadas mediante una tuerca que, una vez insertado y montado el extremo, queda en el interior del tubo. Los bordes externos de los asientos de las vlvulas fueron posteriormente sellados. Para la calibracin de los yugos, el sellado en el borde de asiento de la vlvula fue revisado peridicamente para evitar prdidas, reveladas por la inmersin en agua del recipiente con aire a presin algo mayor que la atmosfrica en su interior. Los tubos de colecta de PVC para ser ajustados al cuello de los animales, deben ser evacuados antes de su uso y la tasa en la cual el aire es muestreado de la nariz del animal est determinada por la longitud y dimetro interno del tubo capilar. De este modo se construyeron 45 capilares para conexin del arns y de repuesto para capturar eructos del animal y se calibraron y ajusto el flujo de vaco de 30 yugos. Los yugos y cabezales se han probado en las vacas de leche durante uno los puntos ms crticos del proceso experimental, como es el comportamiento en la sala de ordeo (Figura 6). En el caso de los reguladores de ingreso, en este proyecto se utiliz el tipo capilar, su misin es interponer una impedancia hidrulica al paso del aire de modo que la presin en el recipiente recolector, inicialmente vaco, llegue a unos 500 mb en 24 hs. En este caso se aprovecha la impedancia hidrulica de los de tubos capilares largos y de muy pequeo dimetro interior. Los reguladores de ingreso fueron homologados individualmente, bajo la condicin de que la presin en los yugos previamente vaciados debe subir a valores entre 400 y 600 mb en 24 hs. El largo de 1 m es justamente el que proporciona ingresos de este orden de acuerdo con la teora de flujos en tubos. En general, no hubo problemas en su construccin, siendo el punto ms delicado el ensamble del capilar con la unin metal. El inconveniente principal de este tipo de regulador es el costo, pues son 31

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elementos utilizados para tuberas y ensambles de cromatografa HPLC, que suele manejar altas presiones. Establecimiento y validacin del mtodo cromatografico para la cuantificacin de CH 4 y SF6 emitidos por la fermentacin entrica de los bovinos Para la cuantificacin de la concentracin de SF6 y CH4 se utiliza una columna RESTEK RTMsieve 5A (Molecular sieve 5A Porous Layer Open Tubular Capillary Column, 30 metros 0.53 mmID, Serial No. 940695) y un detector de captura electrnica (ECD), adecuado para compuestos con halgenos y con las condiciones cromatogrficas descritas en la Figura 11. Temperatura Inyector: 150 Modo de inyeccin: Split Modo de control de flujo: Presin 100 kPa Flujo Total: 775.3 ml/min Flujo columna: 70.30 ml/min Velocidad Lineal: 351.5 cm/sec Temperatura Detector: 300C Condiciones isocrticas 30C, Duracin de la corrida: 3 min Tiempo de Retencin pico Hexafloururo de Azufre: 2.31 min Sistema de inyeccin asistida por sistema controlado de vlvulas acopladas al CG y a una bomba de vaco. Figura 11. Condiciones cromatogrficas y perfil cromatografico del SF6 La cuantificacin de los gases emitidos y contenidos en los yugos SF6 y CH4 se realiza por el mtodo de estndar externo, mediante la construccin de una curva de calibracin individual de los patrones puros de SF6 y CH4 grado cromatografico (suministrada por la empresa colombiana AGAFANO LTDA), con una concentracin "base" de 99.99% de pureza, la cual fue diluida sucesivamente en los mismos yugos que sern usados en los animales bajo experimentacin, para obtener una curva estndar de calibracin (Concentracin vs. rea bajo la curva) de SF 6 y CH4, fueron seguidas las recomendaciones del laboratorio de NEWA, entonces fueron preparadas tres concentracin de los patrones a nivel alto (949.65 pptv), medio (172,66 pptv) y bajo (18,99 pptv), stas fueron hechas en el mismo laboratorio de Nutricin animal-CBB, debido a que la mencionada empresa (AGAFANO LTDA) no prepara mezclas por debajo de concentraciones en ppm. La respuesta a los cambios de concentracin y la linealidad de la curva de SF6 la Figura 12. Aunque como puede ser observado en la figura 6, el nmero de puntos en la calibracin debe ser
SF6
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incrementado al menos a 12 diferentes concentraciones, para que sea considerada como una curva de calibracin adecuada, lo cual ya est llevando a cabo por la joven investigadora.
Figura 12. Curva estndar de calibracin del marcador SF6 realiza por cromatografa de gases Condiciones cromatogrficas adaptadas para la cuantificacin de hexafloruro de azufre SF6 Cromatografo de gases: Columna: Detector: Temperatura del detector: Temperatura del inyector: Programa de temperatura (Isotrmica): Presin: Flujo Total: Flujo columna: Velocidad lineal: SHIMADZU GC 2014 RT-Msieve 5A 30m x 0.53 mm ID x 50um De captura de electrones 300C 150C 30C por 3minutos. 100kPa 138.1 ml/min 12.37 ml/min 93.3 cm/sec
Para esta tcnica en particular el cromatrografo fue adecuado con una bomba de vaco y un sistema de inyeccin automtica de muestras de gas, el cual se conecta al yok (colector de muestra). El sistema es controlado por el software del cromatografo (GC Solution), a travs de tres eventos, el primero la succin del gas del yok por la bomba de vaco, el segundo la presurizacin del gas, lo cual dirige la muestra hacia un loop con un volumen fijo de 1ml y finalmente el tercer evento inyecta el gas de forma directa a la columna capilar.
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Bomba de vacio
Presurizacin de la muestra Loop (1ml)
Inyeccin de la muestra
Conexin al yoke
Figura 13. Adecuacin del cromatografo de gases para la tcnica SF6. 1.3.4 Determinacin de metano entrico en vacas Holstein pastoreando tres tratamientos de dieta alimenticia. 1.3.4.1 Produccin de biomasa y composicin de las pasturas evaluadas Luego de 5 ciclos de rotacin evaluados, la produccin de biomasa vari significativamente (p<0,05) entre los grupos experimentales (Tabla 5), siendo mayor la produccin de biomasa para la pastura de Kikuyo, seguida por Lotus y Kikuyo + Lotus. La proporcin de Lotus en el tratamiento puro alcanz, el 78% siendo alto para una pastura de leguminosa; sin embargo, en ese mismo tratamiento la proporcin de trbol fue alta con 10%, mientras que en los otros tratamientos, las proporciones de trbol y arvenses fue baja. En general, la produccin de biomasa area de la pastura de kikuyo fue alta comparado con los resultados reportados por Castro et al. (2008) donde se produjeron 1860 kg MS/ha. La asociacin kikuyo + Lotus, produjo menos biomasa comparada con resultados obtenidos en similares condiciones agroecolgicas por Castro (2007). Tabla 10. Resultados del anlisis por cromatografa de SF6 y CH4 en yugos Tratamiento/Pradera 622 550 Kikuyo 374 344 226 Asociado 382 34 VACA 030 035 020 023 016 019 JOKE SF6 (ppt) 1,4230 5,2355 3,8680 0,9435 2,4465 0,9035 CH4 (ppm) 1,50725 1,57725 1,56275 1,54275 1,76325 1,48725

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298 648 376 886 628 334 Lotus 294 068 566 1 Ambiente 2 3
041 009 043 002 017 011 029 005 024 032 006 001
2,0410 1,1290 1,3175 1,6425 1,5655 1,0675 1,1755 1,2580 1,1720 0,2625 0,3840 24,452
1,56950 1,54200 1,50900 1,57175 1,37255 1,49000 1,52175 3,11800 1,56550 1,40275 1,40625 1,40300
Los anlisis cromatogrficos de SF6 y CH4 realizados durante el bioensayos en campo fueron muy bajos (Tabla 10) a los obtenidos por Pinares (comunicacin personal), los cuales se muestran en la Tabla 11. De otra parte, al aplicar la frmula (1) sugerida por Lassey et al (2001), el valor de emisin fue bajo al comparado con otros trabajos de investigacin y en algunas ocasiones los resultados mostraron valores de cero (0) para SF6 y de CH4. De igual forma, en muchos das de evaluacin, los anlisis cromatogrficos de SF6 y de CH4, fueron superiores en los yugos ambientales comparados con los yugos con animales, lo cual dara estimaciones negativas de emisin de metano entrico en animales, segn el protocolo experimental de estimacin del gas. Tabla 11. Datos del trabajo de investigacin en Nueva Zelanda, Agresearch Palmerston North (Pinares-Patio, comunicacin personal). SF6 (ppt) 350,1 270,3 CH4 (ppm) 84,169 57,57
Yugo Yoke 8 Yoke 6
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Yoke 15
283,6
69,727
La tasa de la mezcla SF6 y el CH4 (umol/mol) en el canister (CSF6 y CCH4, respectivamente) y la tasa de liberacin del SF6 (QSF6: g/da) se emplearon para determinar la emisin de CH4 (QCH4: g/da) usando la siguiente ecuacin, la cual tiene en cuenta las concentraciones encontradas en el ambiente (CbSF6 y CbCH4). La proporcin de los pesos moleculares (MW) fueron empleados para contabilizar por diferencia la densidad entre gases:
(1) QCH4= [(CCH4 - CbCH4)* QSF6/(CSF6 - CbSF6)]*[MWCH4/MWSF6] En este contexto se puede concluir parcialmente que no se ha podido ajustar la tcnica de medicin de metano entrico por SF6, porque falta identificar el factor que impide la estimacin que se acerque a valores de otros investigadores han utilizado este marcador en la medicin de metano. El mayor cuello de botella se encuentra en la valoracin del gas a alturas superiores a 1600 m.s.n.m, proceso de ajuste de la tcnica que en la actualidad se est realizando en una alianza estratgica con Brasil y Nueva Zelanda 1.3.4.2 Produccin y calidad composicional de la leche La carga animal empleada fue la misma para los diferentes grupos experimentales; sin embargo, la produccin de leche present diferencia significativa entre tratamientos (p<0,05) siendo mayor la produccin de leche en las vacas que pastorearon Lotus y menor en aquellas que pastorearon kikuyo(Tabla 12). Resultados similares han sido reportados por Castro et al. (2009) cuando vacas Holstein han pastoreado Lotus, igualmente Woodward (2001) observ tendencias similares, cuando las vacas pastorearon Lotus frente a ryegrass. Tabla 12. Produccin de biomasa y composicin botnica de pasturas evaluadas Pastura/Tratamiento ITEM Kikuyo + 400 Kikuyo + Lotus kg N/ha/a 2,730a 3 36 2,350c 35 5 Lotus 2,570bc 78 10 Sign. p<0,05 P<0,01 NS
Prodn. biomasa, kg MS/ha Proporcin Lotus, % Proporcin trbol, %

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Proporcin arvenses, % Proporcin ryegrass, %
0 -
3 2
3 9
NS p<0,05
Tabla 13. Produccin de biomasa, carga animal, produccin y calidad composicional de leche de vacas en tres tratamientos de pasturas en la sabana de Bogot Pastura/Tratamiento ITEM Kikuyo + 400 kg N/ha/a 2,730a 2,5 16c 3,6 3,3 12,2 Kikuyo + Lotus 2,350c 2,5 19b 3,4 3,3 12,3 Lotus 2,570cb 2,5 23a 3,3 3,3 12,0 Sign. P<0,05 P<0,01 NS NS NS
Prodn. biomasa, kg MS/ha Carga animal, v/ha Prodn. leche, l/v/d Grasa,% PC, % ST, %
De otro lado, no se presentaron diferencias significativas (p>0,05) entre tratamientos para los valores de la composicin de la leche relacionados con los contenidos de grasa, protena cruda y slidos totales. Resultados similares fueron reportaron Woodward (2001), mientras que Castro et al. (2009) report mayores valores en grasa y protena cruda de la leche 1.4 Conclusiones y Recomendaciones Se observ que mantener la pradera pura de Lotus no es fcil y se requiere investigar ms en otros estudios, sobre cmo controlar el trbol blanco dentro de las pasturas de Lotus, de igual forma, erradicar el ryegrass no ha sido posible, la aplicacin de un con herbicida (Fusilade-selectivo a hoja angosta) busco mantener una proporcin alta (>80%) de Lotus mediante control selectivo. De igual forma, el Lotus asociado, regular el 50 50% de leguminosa y gramnea no es fcil, pero se ha logrado mediante manejo de la carga animal y del tiempo de ocupacin, dejando siempre el mismo perodo de recuperacin de la pastura (45 das). De sta forma se mantuvo las proporciones de los componentes de las pasturas adecuadamente. 37

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De acuerdo con el inters actual en estimar y reducir la emisin de metano ruminal en sistemas de produccin animal, a travs de estrategias nutricionales sostenibles, se ha evaluado de manera preliminar los niveles de degradabilidad en trminos de gas total y porcentaje de desaparicin de la materia seca asociados a la produccin de metano in vitro en dos forrajes en trpico alto. La produccin de gas no mostr bajo las condiciones de este experimento una relacin con el porcentaje de DIVMS como se esperaba, sin embargo no se descarta la relacin de estas variables, pero se recomienda en futuros trabajos realizar anlisis simultneos de cidos grasos voltiles que pueden explicar de mejor manera el comportamiento de los forrajes. Se encontraron discrepancias entre los resultados de este trabajo con respecto a los reportes para la produccin de metano con la leguminosa Lotus uliginosus, posiblemente el efecto del Lotus se asocia a al contenido de taninos condesados presentes en la muestra, ya que no se analizaron en este trabajo, es posible que su desconocimiento sea la causa de no reportar diferencias para esta variable, se recomienda hacer siempre anlisis de metabolitos secundarios en pruebas de produccin de metano, pues son uno de los factores considerados importantes en la reduccin de la metanognesis ruminal. El trazador SF6 requiere de ms labor de validacin y adaptacin de la tcnica en condiciones de altitudes superiores a 1600 m.s.n.m, debido a problemas de permeacin del animal hacia el ambiente , como tambin la precisin de la determinacin en los jokes a travs del cromatgrafo de gases. A pesar que la pastura de kikuyo fertilizada con urea produjo ms materia seca, esta no se vio reflejada en la produccin animal, demostrndose la bondad de la leguminosa Lotus como pastura asociada al kikuyo o pastura pura, para la produccin de leche en la Sabana de Bogot. La dieta para las vacas lecheras a base de nuevas pasturas no mejor la calidad composicional de la leche bajo las condiciones experimentales del estudio Se recomienda para objetivamente alcanzar la medicin de metano por la tcnica de SF6 progresar en la estimacin de factores de correccin que permitan alcanzar niveles ajustados a las condiciones ambientales descritas.
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Captulo 2: Determinar la capacidad de pasturas con y sin leguminosa de almacenar agua como medida de adaptacin y de secuestrar carbono, reducir emisiones de N2O y de CH4 como medida de mitigacin.
2.1 Introduccin El planeta tierra est siendo afectado por un fenmeno de origen natural, denominado efecto invernadero, este se ha visto modificado de forma negativa por la actividad humana, presentando como consecuencia el aumento gradual de la temperatura de nuestro planeta. Los gases cuya presencia en la atmsfera contribuyen al efecto a escala planetaria similar al observado en un invernadero, son llamados gases de efecto invernadero (GEI), siendo principalmente: dixido de carbono (CO2), metano (CH4), xido de nitroso (N2O) y artificiales como los clorofluorcarbonados (CFC). Estos gases en el aire atrapan el calor impidiendo su salida al espacio exterior, provocando as el calentamiento global. El metano se conoce como un biognico traza, ya que tiene origen biolgico y su concentracin atmosfrica en volumen es de unas pocas partes por milln; pero a pesar de su baja concentracin, tienen gran importancia ya que su accin como gases invernadero es alta, de hecho es el segundo ms importante GEI ya que una vez emitido permanece en la atmosfera aproximadamente de 9 a 15 aos y es 21 veces ms efectivo en atrapar calor en la atmosfera que el CO2 sobre un periodo de 100 aos, es decir, su potencial de calentamiento global (PCG) de aproximadamente 23 que representa el efecto invernadero en equivalentes de CO2. La agricultura contribuye a la generacin de gases de efecto invernadero, particularmente metano y xido nitroso; de hecho la agricultura se ha asociado con la reduccin de los sumideros de metano en el suelo y con un aumento en las emisiones de xido nitroso hacia la atmsfera (Powlson et al., 1997, Freney, 1997). La intensificacin de la agricultura provoca el uso de dosis altas de fertilizantes nitrogenados, estimulando la emisin de N2O y un efecto inhibitorio en el almacenamiento (oxidacin) de CH4 (Bronson, 1994). Es as que, a travs de la ganadera intensiva, la especie humana interviene tambin en el cambio climtico. El CH4 es generado por el manejo de estircol y la quema de biomasa (Ciesla, 1995). Las prcticas como la labranza, quema, manejo de estircol, fertilizacin qumica y la remocin frecuente ocasionan la emisin de CO2, CH4 y N2O desde el suelo y la vegetacin hacia la atmsfera, por ende el suelo cumple una funcin muy importante en la regulacin de la composicin gaseosa de la atmsfera (Lal et al., 1994). Las emisiones de CH4 son el resultado de la metanognesis y la oxidacin de CH4 que se da en general, en suelos aerbios, aunque la evidencia presentada es que es tambin una va anaerbia para la oxidacin de CH4 (Segers, 1998). Los parmetros medio ambientales ms importantes de control de la oxidacin de CH 4 es la temperatura del suelo (Whalen y Reeburg, 1996), la humedad del suelo (Nesbit y Breitenbeck, 1992) y el pH (Hutsch et 39

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al, 1994); adems dicha oxidacin tambin se ve influenciada o inhibida por la C NH 4 y la fertilizacin (NO3). La mayora de los suelos en condiciones naturales se comportan como sumideros de metano y como fuentes de xido nitroso (Mosier et al., 1995). La textura del suelo es un importante factor relacionado a los flujos de metano, siendo las texturas ms gruesas las que tienen mayores tasas de captacin de metano, en relacin a los suelos con texturas ms finas (Boeckx et al., 1997) y el contenido de agua en el suelo es uno de los factores ms importantes en la variabilidad de los flujos de gases de efecto invernadero (Conrad, 1995, Pol et al., 1998). La compactacin del suelo tiene un importante efecto en la reduccin de las tasas de almacenamiento de metano y pueden convertir un suelo, de sumidero a fuente de metano hacia la atmsfera (Rondn, 2000). La conversin de ecosistemas naturales hacia agricultura, resulta en la reduccin de las tasas de almacenamiento de metano y en el incremento de las emisiones de xido nitroso del suelo, ya que los cultivos requieren la adicin de fertilizantes (Mosier et al., 1991). Por otro lado, se estima que el carbono orgnico del suelo (COS) es aproximadamente tres veces mayor (1550 Pg) que el retenido en los organismos vivos (550 Pg) (Lal et al 1995); por esta razn cambios mnimos en las reservas de COS son sustanciales para incidir en los niveles de emisin y/o concentracin de CO2 en la atmosfera afectando el clima global (Schlesinger, 1995). Uno de los sistemas productivos que cumple un importante papel y al cual se le ha prestado poca atencin en el mantenimiento del ciclo global del C es el sistema agropecuario (Nepstad et al., 1994; Gifford, 1994). En este sentido, se resalta el potencial de las pasturas tropicales como reservorios significativos de C. Este reconocimiento se establece en el Protocolo de Kyotoen donde predomina el inters por minimizar las emisiones netas de carbono e incrementando la tasa por la cual esos gases son retirados de la atmsfera gracias a los sumideros (FAO, 2002). En este sentido, el sector agropecuario enfrenta grandes retos para atender de forma competitiva y sostenible los mercados locales, regionales y globales y adaptarse a los cambios climticos. Con miras a generar esfuerzos por mejorar la capacidad de adaptacin de los sistemas productivos, se presentan contextos ecosistmicos en los cuales es posible incidir en este proceso como el de las sabanas (Mouillot and Field 2005) citado por Batjes et al. (1999) los cuales son considerados fuente importante de emisiones de Carbono por el sector ganadero, sin embargo son poco conocidas y cambiantes. Las pasturas asociadas a los sistemas ganaderos de carne y leche han sido asociadas como emisores de GEI, sin embargo el tipo de pastura podra potencialmente ser un importante sumidero de estos. En informacin revisada por la FAO (2002) se sostiene que el 70% de las tierras de pastoreo estn o se encuentran en un proceso de degradacin consecuencia del sobrepastoreo, por lo que es necesario generar prcticas de manejo del suelo y de las praderas para controlar los procesos de degradacin (Bravo y Florentino, 1999). Las leguminosas que contienen taninos condensados (p.e. Lotuses) que son capaces de bajar el CH4, (g/kg de consumo de materia seca) por12 15 % y puede mejorar la produccin animal (Waghorn, 2008). En el presente estudio se monitoreo las emisiones de metano y 40

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xido nitroso en el suelo de tres lotes cultivados en Lotus uliginosus (gramnea) solo, (kikuyo) pennisetum clandestinum (leguminosa) + Lotus uliginosus y pennisetum clandestinum + N destinada a pastoreo, adaptando las tcnicas de medicin de CH4 por cromatografa de gases, seguido por un estudio para generar conocimiento alrededor del almacenamiento de carbono incorporado en el suelo en funcin de dos especies forrajeras en cultivo puro y mezcla a travs de mediciones de emisiones de CO2 y de materia orgnica a diferentes profundidades en condiciones de la Sabana de Bogot, as tener una aproximacin a un modelo de la economa del carbono en ecosistema altoandino con influencia de sistemas de pastizales.
2.2 Materiales y Mtodos 2.2.1 Determinacin del flujo de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Kikuyo (pennisetum clandestinum ), Lotus (lotus uliginosus) y la pastura asociada Lotus-Kikuyo
2.2.1.1 Condiciones cromatogrficas para cuantificar las concentraciones de metano y xido nitroso. Para cuantificar las emisiones de metano (CH4) y xido nitroso (N2O), inicialmente fue necesario estandarizar la tcnica para la medicin de este gas, para lo cual los parmetros evaluados fueron: selectividad precisin del sistema, precisin del mtodo y linealidad, est ltima determinada a partir de dos seriales de concentraciones definidas. Previo a este proceso se establecieron las condiciones de corrida utilizando el cromatgrafo de gases Shimadzu GC-2014 (Figura1), variando las temperaturas de inyeccin, deteccin y del horno, hasta obtener como condiciones ptimas de deteccin y cuantificacin de metano y xido nitroso. 2.2.1.2 Evaluacin de los flujos de metano y xido nitroso en los suelos Para el monitoreo de los flujos de metano y oxido nitroso entre el suelo y la atmsfera, se utiliz la tcnica de la cmara cerrada esttica, la cual es utilizada a nivel internacional para la medicin de los gases de efecto invernadero y se encuentra estandarizada y validada por el CIAT (Chu, 2007; Robertson, 2000; Smith, 1995). Se realizaron mediciones independientes de metano sobre praderas ubicadas en las instalaciones pertenecientes a CORPOICA en el municipio de Mosquera y la finca Megaleche en Facativa. Las cmaras son de policloruro de vinilo (PVC) y se componen de un anillo y una cmara con sptum (tapn). Los anillos se enterraron a 5cm del suelo y permanecieron instalados en los lotes. Al momento del muestreo se coloc la parte superior de la cmara sobre el anillo y se cerr hermticamente (Ver figura 14). La jeringa con vlvula adaptada se introdujo en el sptum de la cmara para tomar las muestras del aire acumulado en los tiempos 0, 15 y 30 minutos, estas se inyectaron en vacutainer de (7ml), se les coloco un cdigo de identificacin y se procesaron en el laboratorio para su posterior anlisis por cromatografa de gases. Adems en la primera cmara de cada finca se midi la temperatura en grados centgrados (C) dentro de la cmara. Las cmaras estticas fueron desplegadas en la 41

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superficie del suelo, instalando en este caso 10 cmaras por lote, distribuidas en zing-zang en cada lote.
Pennisetum clandestinum
1
2 3
8
Asociacin
Lotus
uliginosus
5
1 0
Instalacin de las cmaras
Toma de muestras de gas
Chu et al., 2007
Figura 14. Distribucin de las cmaras y toma de muestras gases del suelo cultivado
Finalmente las muestras fueron analizadas por duplicado bajo la tcnica cromatografica implementada y al obtener la concentracin (ppm) promedio de cada muestra de metano y oxido nitroso en las diferentes praderas, esta se utiliz para calcular los flujos; este se determin mediante la siguiente formula derivada del balance de masa en la cmara (Kim y Kim, 2002): Ecu.1 Jgas = gas V C A t (273+ T) 273
donde Jgas es el flujo del CH4, gas es la densidad del gas, V es el volumen de la cmara, A es el rea cubierta de la cmara, T es el promedio de temperatura en el interior de la cmara durante la toma de muestra con intervalos de 15 minutos, y C /t es la tasa de cambio de la concentracin de metano en el mismo intervalo de tiempo.
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2.2.1.3 Anlisis Estadstico Con los datos de los flujos acumulados del gas efecto invernadero (CH4), se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) y las medias fueron comparadas mediante la prueba de Tukey a un nivel de significancia de =0.05, utilizando el programa Statistical System Analysis (SAS 9.2). El modelo empleado es denominado modelo completamente al azar: Yij = + Ti + Ei Yij: : T: i: Ei: Flujo de gas en cada tratamiento Media general Tratamiento Lotus, Kikuyo y Lotus + kikuyo. Error experimental
Adicionalmente se realiz un anlisis de varianza para el promedio de las concentraciones de metano a diferentes tiempos de muestreo, es decir, se analiz la variacin entre las concentraciones presentadas al minuto 0 (C0), 15 (C1) y 30 (C2) por cada una de las praderas.
2.2.2 Almacenamiento de carbono en suelo de pasturas pura y asociada de Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus 2.2.2.1 rea de estudio El trabajo se realiz en Corpoica, sede Tibaitat, Mosquera en el departamento de Cundinamarca, localizado a 4 42' Latitud Norte y 74 12' Longitud Oeste, ubicado en la Sabana de Bogot en el km 14 sobre la carretera central de occidente, Municipio de Mosquera del Departamento de Cundinamarca (IGAC, 2000) (Figura 15).
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Figura 15. Ubicacin del Centro de Investigacin Tibaitat en el Municipio de Mosquera, Cundinamarca. Adaptado de Corpoica& Car (2008) En cuanto a las caractersticas climticas el rea de estudio se clasifica de acuerdo con Caldas-Lang como clima fro seco, con precipitaciones medias anuales inferiores a 700 mm, distribuidas a travs del ao en dos pocas lluviosas; la primera de marzo a mayo y la segunda de septiembre a noviembre, obteniendo dos perodos secos (diciembre a febrero y junio a agosto); sin embargo a escala interanual, estos perodos han sufrido modificaciones debido a fenmenos como El Nio y La Nia asociados con ondas de tipo atmosfrico-ocenico (Rossby, Kelvin, Madden&Julian) los cuales tienden a modificar el comportamiento de las lluvias, siendo determinantes en aos ms hmedos (1984, 2004 y 2006) y/o ms secos (1980, 1992 y 1997). En cuanto a la humedad relativa promedio anual de la zona alcanza aproximadamente un 80%, influenciada por la precipitacin, razn por la cual, durante los meses lluviosos se presentan altos registros de humedad relativa comparado con los meses secos que tienen valores ms bajos de este elemento (IGAC et al. 2000). En cuanto a la zona de vida de acuerdo con la clasificacin general de Holdridge, el rea se ubica en el Piso Altitudinal Montano Bajo, en alturas entre los 2000 y 3000 m.s.n.m. y especficamente en una formacin de Bosque seco montano bajo (bs/MB), con un rango de biotemperatura media entre 12 y 18 C y lluvias inferiores a 1000 milmetros al ao y una evapotranspiracin promedio anual entre 650 y 690 mm (calculada por mtodo Thornthwaite). En la tabla 1, se presentan las principales caractersticas climticas del rea de estudio. Tabla 1. Caractersticas climticas del rea de estudio. Adaptado de IGAC et al. (2000)
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En cuanto a la descripcin edfica, teniendo en cuenta la zonificacin agroecolgica de Colombia, los suelos de Tibaitat corresponden a la representacin de tierras de altiplanicies, con pendientes hasta del 3%. Los suelos se clasifican taxonmicamente como andisoles, es decir, con influencia variable de cenizas volcnicas. Aunque la clasificacin taxonmica es imprecisa para este estudio se determina que el orden, suborden y gran grupo hacen parte de la unidad definida como Haplustands; caracterizada por tener rgimen seco, provenientes de cenizas volcnicas y con un rgimen de temperatura entre 8 y 15 C. Generalmente son suelos profundos, bien drenados y de fertilidad moderada. Estas reas son aptas para cultivos transitorios y ganadera intensiva. Estos suelos son representativos de 63.700 ha que se encuentran en el pas (IGAC Gobernacin, 2000).
2.2. 2.2 Etapas metodolgicas Este trabajo es abordado a travs de los enfoques exploratorio, experimental y explicativo para determinar la interaccin entre carbono orgnico y caractersticas productivas del suelo y factores climticos. As la metodologa aplicada permite comparar y evaluar relaciones entre especies forrajeras y valores de carbono, cuyo anlisis de resultados permite evidenciar diferencias entre grficos de referencia por proceso de emisin y acumulacin; para el desarrollo del presente trabajo fueron tenidas en cuenta las siguientes etapas: Etapa I: Revisin secundaria. Recolectar la informacin sobre estudios relacionados con dinmica de carbono en el suelo por sistemas de pastizales, mtodos de anlisis basado en estudios de la FAO (2002), IPCC (2001), descripcin del perfil de suelos de Tibaitat de acuerdo con el IGAC et al. (2000); estudios sobre actividad biolgica del suelo desarrollados entre otros investigadores por Weissenberg (1954), Haber (1958), Wiant (1067), Witkamp (1966), Kucera et al. (1971), Jong et al. (1972), Caballero et al (1985) y (1986).
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Etapa II. Seleccin de reas mustrales El muestro se realiz en sistemas de pasturas con dos aos de establecimiento para produccin de leche especializada por la Empresa Ganadera de Megaleche, abarcando la totalidad del rea, es decir aproximadamente 8 hectreas divididos en aproximadamente 2 ha por cada tratamiento (en total 4). Siguiendo un diseo completamente no aleatorizado diferenciados en tres bloques que cubren los cuatro tratamientos con 4 repeticiones; fueron realizados los muestreos durante ao y medio. La distribucin de los muestreos se efecto utilizando el sistema de grilla siguiendo las pautas para toma de muestras definido por el Instituto Agustn Codazzi, tal como se puede observar en el grfico 2. Los tratamientos fueron: 1) leguminosa forrajera Lotus uliginosus con cobertura del 100%; 2) Asociado Pennisetumclandestinum con una cobertura de 60-70% Lotus uliginosus 3040%; 3) Pennisetumclandestinum con 100% de cobertura; 4) Testigo con Pennisetumclandestinum cobertura del 100%. Las prcticas de renovacin de praderas (guadaa y aplicacin de fusilade 1. (2 lt/ha); 2. (1lt/ha); 3 (no se fumiga), control de malezas manual y fertilizacin fueron aplicados en los tratamientos 1, 2 y 3; mientras que en el tratamiento 4 no se efectan prcticas de manejo y renovacin de praderas.
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Figura 17. Diseo de tratamientos en el rea de estudio. Sistema de grillas
Etapa III. Mediciones Las siguientes fueron las mediciones desarrolladas para dar cumplimiento a los objetivos propuestos: Mediciones en suelo: Para la determinacin de almacenamiento de carbono fueron realizadas 24 cajuelas de 20*20 cm en el rea de estudio, a las profundidades de 0-15, 15-30 (Horizonte A) y 30-60 cm (Horizonte B) cuyas distancias oscilan entre 50, 100 mt -150 mt sistema adaptado por recomendaciones del CIAT, con 4 repeticiones. De esta manera, se colectan con barreno 36 muestras para la determinacin de la densidad aparente y humedad gravimtrica, 36 en bolsas plsticas para anlisis de carbono por combustin hmeda y 36 muestras para el anlisis de carbono total. Determinacin de carbono total por el mtodo de combustin seca: Las muestras de suelo son secadas y molidas y luego su tamao es reducido adecuadamente en un molino de balines diseado 47

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en el CIAT, para que el suelo quede con un tamao de partcula de 105 m de una manera homognea (Rondon y Thomas, 1994); las muestras son analizadas en el Laboratorio de Istopos estables de la Universidad de California. El anlisis es destructivo, ya que las muestras de suelo son pasadas a estado gaseoso mediante la aplicacin de temperatura para poder ionizar la muestra y establecer los niveles de fraccin estable de carbono a travs de nitrgeno total, C13 y N15. Las abundancias isotpicas naturales de 13C y 15N con base en los valores estndares del V-PDB (Viena-Pee DeeBelemnite) y el nitrgeno del aire (Peterson y Fry, 1987); dado que la fijacin biolgica de CO2 discrimina contra 13C, los valores 13C del material celular biosintetizado son "ms negativos" que el sustrato de carbono utilizado, generalmente, CO2 atmosfrico o carbonato marino; en este sentido son utilizadas las siguientes frmulas:
: Unidad de medida de los istopos estables. Es la desviacin relativa de las razones isotpicas de la muestra y el patrn en tanto por mil. Determinacin de carbono total por el mtodo de combustin hmeda: El mtodo ms utilizado es el de Walkley Black la diferencia con el anterior es que no incluye el conteo de carbonatos. Humedad gravimtrica del suelo: Las muestras son secadas en estufa elctrica a peso constante a una temperatura de 105 grados centgrados. Densidad aparente: muestras no disturbadas en anillos de 2.5 cm de altura por 5 cm de dimetro, clculo requerido para determinar el peso de carbono por hectrea.
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Figura 18. Mtodo para determinacin de carbono orgnico Los clculos para determinar contenidos de carbono y nitrgeno por combustin hmeda se determinaron de la siguiente manera: Carbono en suelo (t ha-1) = %C * DA * P* A Nitrgeno asimilable en suelo (t ha-1) = (%M.O* 1,74) /20 *2000000/100 Donde: %C = Porcentaje de carbono; % M.O. = Materia orgnica; DA = Densidad aparente (g/cm3); P = Profundidad (cm), A= Area Monitoreo por arreglos de recambio de emisiones: para el monitoreo de los flujos de GEI entre el suelo y la atmsfera, se utiliza la tcnica de la cmara cerrada esttica, la cual es utilizada a nivel internacional para la medicin de Dixido de carbono y se encuentra estandarizada y validada en CIAT (Chu, 2007; Robertson, 2000; Smith, 1995). Por cada cmara, se toman muestras de 10 ml de aire en los tiempos 0, 15 y 30 minutos a partir de la ubicacin de la cmara mediciones mensuales durante un ao; registrando datos de temperatura y humedad del suelo para su respectivo anlisis. A continuacin, se eliminarn 3 ml y los restantes 7 ml se transfieren a frascos de vidrio previamente adaptados con vaco por medio de un liofilizador. Estas muestras sern posteriormente enviadas al laboratorio de Istopos estables del CIAT, para determinar la concentracin de Dixido de Carbono con el cromatgrafo de gases Shimadzu GC-14. El clculo de emisiones de CO2 se determin para cada uno de los tratamientos aplicando la ecuacin Jgas = gas (V/A)(C/t)(273/(273+T).
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Figura 19. Procedimiento para cuantificacin de gases efecto invernadero
2.2.2.3 Anlisis Estadstico Los datos son organizados y tabulados de acuerdo con cada tipo de medicin y anlisis comparando medias, anlisis de varianza y anlisis de componentes principales a travs del programa estadstico SAS. Con los registros se permite establecer correlacin entre el carbono orgnico, factores climticos y caractersticas productivas del suelo. Se elaboran modelos utilizando Stella por cada tratamiento para hacer una aproximacin al balance de carbono a travs de valores de referencia y medidos teniendo presente variables del carbono fijado, Materia orgnica del suelo y materia orgnica de la vegetacin (respirado).
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2.3 Resultados 2.3.1 Determinacin del flujo de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Kikuyo (pennisetum clandestinum ), Lotus (lotus uliginosus) y la pastura asociada Lotus-Kikuyo 2.3.1.1 Condiciones cromatogrficas para cuantificar las concentraciones de metano y xido nitroso. Las condiciones de calibracin para la cuantificacin de metano y xido nitroso de muestras de suelo se encuentran en la tabla 14. Tabla 14. Condiciones cromatogrficas para la determinacin de Metano (CH4) y xido Nitroso (N2O). METODOS Columna Capilar Detector Metano (CH4) xido Nitroso (N2O)
RT-Msieve 5A (30m x 0,53mm x 50m) Detector de ionizacin de llama Detector de captura de electrones (FID) (ECD)
Temperatura Detector Temperatura Inyector Gas de Arrastre Flujo del arrastre gas
170C 150C Nitrgeno (N2) de 12,37 ml/min
300C 130C
11,64 ml/min 60C 3 minutos
Programa de 30C temperatura del horno 4 minutos
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Volumen Inyeccin
de 1ml
1ml
Selectividad: Se determin que el metano y xido nitroso bajo las condiciones cromatogrficas implementadas eluyen a un tiempo de retencin de 2,03 y 1,73 minutos, respectivamente (Ver figura 15).
CH4 2,3 min
N2O 1,73 min
Figura 15. Cromatogramas de la selectivadad de la elusin de metano (a) y xido nitroso (b) Linealidad: Los dos seriales de concentraciones altas y bajas de metano procesadas estn entre 45.5 a 727.6 ppm y de 6.5 a 77,9 ppm, respectivamente, para establecer as la curva de calibracin que se usara para cuantificar las emisiones de metano en suelo. Los resultados de estas curvas se muestran en la tabla 15 y figura 16. Tabla 15. Curvas de calibracin metano y xido nitroso Concentracin metano (ppm) 6,496 12,992 25,985 51,971 77,957 AREA (V/min) 1138,12 2019,91 4111,1333 6858,13 Concentracin oxido nitros (ppm) 14,571 24,285 34 48,571 AREA (V/min) 311482,5 515792,2 722657,8 1051999 311482,5
11112,6733 14,571
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Figura 16. Curvas de calibracin para metano (a) y xido nitroso (b)
Repetitividad Precisin del sistema. El criterio principal que se tuvo en el sistema de separacin cromatogrfica para evaluar la precisin del mismo, fueron la reas, mostradas en la tabla 1, la repetitividad del sistema fue optimo ya que los coeficientes de variacin(%) fueron menores al 5% en todos los casos, indicando una confiabilidad del 95%. Reproducibilidad Precisin del mtodo: El criterio principal que se tuvo en el mtodo de separacin cromatogrfica para evaluar la precisin del mismo, fue la concentracin de metano presente en la muestra evaluada, mostradas en la tabla 2, la reproducibilidad del mtodo es ptima ya que al observar el coeficiente de variacin (%) de las inyecciones por muestra este es menor al 5% en ambos casos, de hecho presentan una confiabilidad mayor del 99%.
2.3.1.2 Evaluacin de los flujos de metano y xido nitroso en suelos cultivados en Lotus, Kikuyo y su asociacin. Es importante destacar que los valores negativos representan flujos netos desde la atmosfera al suelo y valores positivos indican una emisin neta del suelo hacia la atmsfera. As, en todos los periodos del estudio, cada tratamiento se comporta de la misma forma, siendo sumidero o emisor de metano. El suelo cultivado con Kikuyo se muestra como emisor, con un flujo constante de 0,2549 g m-2min -1 y los otros dos lotes evaluados Lotus (solo) y la asociacin Lotus + Kikuyo son sumideros de metano con flujos entre (-0.1908 g m-2min -1) y (-0.1177 g m-2min -1) y entre (-0.0076 g m-2min 1 ) y (-0.1239 g m-2min -1 ) respectivamente, siendo mayor a travs del tiempo, es decir, los flujos son menores (Ver figura 17). Al realizar el anlisis de varianza para el promedio de las concentraciones de metano se obtuvieron las probabilidades (Pr) de las interacciones de tratamiento*da (T*d) de las concentraciones de 53

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metano a tiempo 0, 15 y 30 minutos, C0, C1 y C2 respectivamente, Obtenindose un diferencia significativa y muy significativa en las concentraciones C0 (Pr=0,0138) y C1 (Pr=0,0004) respectivamente y una diferencia significativa en C2 (Pr=0,66) para la interaccin (T*d).
Figura 17. Promedio de los flujos de CH4 emitidos por los suelos cultivado en Lotus uliginosus, Pennisetum clandestinum y la asociacin L. uliginosus+P. clandestinum entre 0 y 15 min (A) y entre el entre 0 y 30 min (B) de acumulacin, por un periodo total de cuatro meses; n=10 cmaras; letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significas de las medias (P<0,05).
Figura 18. Promedio de los flujos de N2O emitidos por los suelos cultivado en Lotus uliginosus, Pennisetum clandestinum y la asociacin L. uliginosus+P. clandestinum entre 0 y 30 min de acumulacin, por un periodo total de cuatro meses; n=10 cmaras; letras diferentes sobre las columnas indican diferencias significas de las medias (P<0,05). De forma general en las tres praderas evaluadas las concentraciones en ppm de metano se encuentran en el mismo rango de concentracin entre 5,70 y 5,97 ppm, por lo tanto se utiliz la 54

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curva de calibracin que estaba entre 6 a 77,9 ppm. Por otro lado, al evaluar el efecto del tiempo en la toma de las muestras (0, 15 y 30 minutos), se present una diferencia significativa por tratamiento (Pr < 0,05), es decir, las condiciones climticas del da que se tomaron las muestras de gas afectan la concentracin de metano, presentando una menor concentracin a una menor temperatura, pues en la tercer semana que se presenta un descenso en la concentracin las temperaturas se encontraron entre 21,9 24,3C, siendo estas las ms bajas a lo largo de la toma de datos. Sin embargo, en el minuto 30 de toma de muestras el comportamiento de los tres suelo es constante, siendo afectado solo el tratamiento Lotus en la cuarta semana de muestreo, que al contrastar con los datos de temperatura presenta 24,9C, la menor en cuanto al muestreo en este suelo. Con los datos de los flujos de metano, se aplic la formula expuesta en la metodologa, utilizando en un primer caso (figura3) la diferencia en concentracin y temperatura entre el minuto 0 y el minuto 15 para calcular la tasa de flujo de cada cmara; y en un segundo caso (figura4) se utiliz la diferencia en concentracin y temperatura entre el minuto 0 y el minuto 30 para calcular la tasa de flujo de cada cmara. En cuanto a los flujos de metano en los diferentes tratamientos, es de destacar que existe una desventaja metodolgica, pues como se conoce los parmetros medio ambientales ms importantes en cuanto al control de la oxidacin de CH4 son la temperatura delsuelo (Castro etal, 1995; Whalen y Reeburgh,1996), la humedad del suelo (Nesbit y Breitenbeck, 1992), y el pH (al Dunfield y otros, 1993,Hutsch et al, 1994) y para este estudio solo se cont con el parmetro temperatura, sin lograr correlacionar los efectos humedad y pH del suelo. Adems, el muestreo se llev a cabo solo por algunos meses, se pudo obtener una mejor estimacin del flujo neto de metano en el diferente tratamiento a travs de la toma de datos a lo largo de un ao o ms. Es importante resalta en este punto de la discusin que siendo el kikuyo gramnea tipo C3, y el Lotus una leguminosa, tipo C4, sus procesos fotosntesis y reciclaje de nutrientes es diferente, lo que puede estar alterando la toma de estos del suelo hacia la planta, y por lo tanto su funcin de sumidero o emisor de GEI puede estar asociado, por otro lado, el efecto estas pasturas sobre las propiedades fsicas del suelo tambin son un factor en la emisin de metan. Sin embargo, a pesar que el periodo de muestreo no fue prolongado, da indicios del comportamiento de estas pasturas una vez establecidas en un sistema de pastoreo. Ante estos resultados es importante analizar que al utilizar el mtodo de recoleccin de gases por Cmara Cerrada Esttica, se presentan ventajas metodolgicas que se ven expresadas en los resultados obtenidos: primero los gases emitidos por el suelo en una cubierta cerrada no se diluyen continuamente con el aire exterior, as que los flujos ms pequeos pueden ser medidos; segundo una cubierta abierta debe ser operada a una presin subambiental, a una la presin reducida, es necesario establecer el flujo a travs de la circulacin del aire y esto crea un potencial para flujo de gases por flujo de masa de un volumen de suelo exterior al recinto; y por ultimo cuanto ms corto es el momento en que el suelo est cubierto, ms pequea ser la alteracin del micrositio en estudio y, por lo tanto, menor ser el cambio en su CH4 tasa de produccin.
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2.3.2 Almacenamiento de carbono en suelo de pasturas pura y asociada de Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus 2.3.2.1 Acumulacin de carbono en suelo La profundidad del suelo se encuentra directamente relacionada con los contenidos de materia orgnica, encontrando ms C almacenado en el horizonte profundo con tendencia a disminuir en los horizontes superficiales, presentando diferencias altamente significativas (p<0,05) entre 0-15, 15-30 y 30-60 cm. En cuanto al almacenamiento de carbono por combustin seca, el valor mayor se concentra en el tratamiento 3Pennisetumclandestinum a una profundidad entre 30 a 60 cm; este resultado se relaciona con la fisiologa de la especie dado su sistema radicular profundo por tanto incrementa su capacidad de acumulacin de nutrientes (Figura 19).
Figura 19. Comparacin entre tratamientos por acumulacin de carbono orgnico Con respecto al contenido de Nitrgeno, usualmente en los laboratorios se determina forma orgnica; dada la importancia de la relacin C:N en este trabajo se establecen las formas disponibles asimilables las cuales de acuerdo con el grfico 4, prevalecen en las profundidades entre 0-15 cm por el tratamiento testigo (Pennisetumclandestinum) (Figura 20); de acuerdo con valores de referencia para condiciones de clima frio los registros calculados de nitrgeno asimilable son bajos (<170 kg/ha).
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Figura 20. Comparacin de Nitrgeno asimilable entre tratamientos 2.3.2.2 Abundancias isotpicas de carbono Los istopos estables al igual que el contenido determinado por combustin hmeda estn directamente relacionados con la profundidad. La razn de estos resultados se atribuye a la afirmacin de Krull y Skjemstad (2003) en Australia y Michelsen et al. (2004) los cuales encontraron que el 13C increment desde la superficie hacia las partes ms profundas del suelo, relacionado con mayores prdidas respiratorias de carbono isotpicamente ligero durante la descomposicin de las capas superficiales del suelo, resultando en enriquecimiento del carbono ms antiguo en profundidad. En este caso, los valores de 13C fluctan entre -19,03 y 22,95 % (predomina Pennisetum clandestinum-testigo) (Grfico 5) y de 15N oscilan entre 5,92 y 6,92% (Grfico 6) (predomina asociado) siendo mayores a profundidades entre 30 y 60 cm. El incremento de valores de 13C y 15N en funcin de la profundidad del suelo se atribuye tambin a la acumulacin de biomasa microbiana (hongos saprofitos, micorrizas arbusculares y ectomicorrhizas) (Bostrm et al., 2007; Hobbie y Horton, 2007; Lindahl et al., 2007). De otra parte, los valores obtenidos para carbono 13 reflejan rangos propios de suelo con cobertura bajo plantas C3 (bosques); es posible deducir la seal isotpica propia del bosque que estuvo en esos suelos; adems se puede estimar que esta composicin isotpica es producto es cambios paleoclimticos.
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Figura 21. Comparacin de isotopos 13C (% -V-SMOW) entre tratamientos
Figura 22. Comparacin de isotopos 15 (%) entre tratamientos
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2.3.2.3 Emisiones de Dixido de carbono Los flujos de dixido de carbono en el municipio de Mosquera, centro experimental Tibaitat, demuestran que los suelos pueden actuar como fuente de emisin o sumidero de gases de efecto invernadero; aunque entre tratamientos son escasas las diferencias significativas (Figura 23); entre das de muestreo es posible identificar contrastes, tal como se puede observar en el grfico 8luego de comparacin de medias entre tratamientos los mayores valores positivos refleja la capacidad de produccin del gas partiendo de la actividad biolgica del suelo (das 1, 3 y 2; pasturas asociado 852,10 g m-2min -1, Pennisetum clandestinum 812.63 g m-2min -1 y Lotus uliginosus 777.96 g m2 min -1); algunos valores negativos indican el consumo del gas como en el caso del da 4 por pasturas asociadas (-79.35 g m-2min -1) y da 6 por Lotus uliginosus (-41.35 g m-2min -1).
Figura 23. Comparacin de flujos de emisiones entre tratamientos.
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Figura 24. Flujo de emisiones de CO2 por semanas de muestreo en el rea de estudio Estas emisiones de CO2 fueron comparadas con las de metano CH4, para efectos de explicar las tendencias de los flujos a partir de los resultados obtenidos en este estudio; en este sentido en la figura 25 es posible observar diferencias significativas entre el flujo del metano CH4 y CO2; en cuanto a los flujos de CH4 los sistemas de pastizales presentaron diferencias significativa (P <0,05). La pastura de Pennisetumclandestinumrepresenta la mayor produccin del gas con un flujo constante de 0,2549 g m-2min -1; en cuanto a Lotus uliginosus y la asociacin es posible identificar un consumo de CH4 con flujos entre -0.1908 g m-2min -1 y -0.1177 g m-2min -1 y entre-0.0076 g m-2min -1 y -0.1239 g m-2min -1, respectivamente; indicando en este ltimo proceso que posiblemente en usos agrcolas las bacterias metanotrficas oxidaron el metano antes de que saliera del suelo (Kamman et al., 2001) contribuyendo con la disminucin de sus concentraciones en la atmsfera. Adems tambin se afirma que aplicaciones de compuestos fertilizantes nitrogenados afectan la oxidacin de metano, dado que el amonio (NH4+) inhibe la enzima metanomonooxigenasa que es la encargada de catalizar el proceso oxidativo.
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Figura 25. Comparacin entre flujos de emisin de CO2 Y CH4. De otra parte, se establecen relaciones entre emisiones de CO 2y el pH del suelo el cual oscila entre 5.4 a 5.8 para los 4 tratamientos sin diferencias significativas. De acuerdo con Gaucher (1971) esto se debe a que el pH acta sobre las proporciones relativas del CO2 libre y de CO2 compuesto: se afirma que pH cidos entre 5 a 6 mantienen una elevada proporcin de CO2 libre, a diferencia de pH alcalinos que favorecen la fijacin de CO2 combinado y disuelto; en este sentido, los valores son muy altos para CO2 libres. 2.4 Perspectivas del trabajo Las dataciones existentes permiten analizar el comportamiento del rea en cuanto al contenido de carbono en suelos cultivados por pasturas. El potencial del contenido de carbono en suelos cultivados en pasturas permite orientar procesos de temporalidad, espacialidad y relaciones entre variables fsicas y de manejo de los suelos en ecosistemas altoandinos. Las lecturas faltantes por analizar sobre acumulacin de carbono a travs de istopos permitirn evaluar las transformaciones de los residuos orgnicos frescos en materia orgnica del suelo y sus distintas fracciones como indicador para evaluar los cambios asociados a labranza u otros tipos de manejo, usos y capacidad productiva del suelo; de all la importancia de su anlisis. Con respecto a la actividad celuloltica es posible explicar entre otras las tasas de mineralizacin e incorporacin de materia orgnica factor explicado por la gnesis de suelos derivados de ceniza volcnica y su incidencia en la relacin C/N. 61

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Con los datos sealados es posible evaluar la compartimentalizacin del carbono dentro del ciclo global en sistemas de pastizales; representado a travs de flujos netos de emisin y acumulacin; como herramientas para incidir en procesos de toma de decisiones relacionadas con estrategias de adaptacin al cambio climtico y en la bsqueda de alternativas sostenibles que permitan sugerir mecanismos de remediacin del suelo y modular las formas y modos de produccin hacia el bienestar ambiental, animal y sociocultural.
2.5 Conclusiones Se implement una tcnica de cromatografa de gases para la cuantificacin de CH4 (CH 4) un importante GEI, esta fue estandarizada y validada, desarrollando los parmetros de selectividad, linealidad (con un coeficiente correlacin de 0,9995) y precisin para el sistema y el mtodo (con unos %RSD no mayores al 5%). El mtodo de recoleccin de gases por Cmara Cerrada Esttica permiti medir los flujos de CH 4, presentando ventajas metodolgicas, ya que con este es posible medir flujos pequeo de gas, crea un potencial para flujo de gases por flujo de masa de un volumen de suelo exterior al recinto y se logran tomar muestras en corto tiempo, generando as una mnima alteracin del micrositio y por ende un mnimo cambio en el flujo de los gases evaluados. El comportamiento de las pasturas en trminos de flujos de CH4 fueron significativamente diferentes entre ellas, siendo: Kikuyo emisor de CH4, con un flujo constante de 0,2549 g m-2min -1, Lotus (solo) sumidero con flujos entre (-0.1908 g m-2min -1) y (-0.1177 g m-2min -1) y la asociacin Lotus + Kikuyo con flujos entre (-0.0076 g m-2min -1) y (-0.1239g m2min1). Indicando, que el tipo de pastura usada como forraje de alimentacin podra disminuir el impacto negativo de la ganadera en las emisiones de metano a el ambiente. La investigacin en curso ha permitido evaluar algunos estimativos sobre compartimentalizacin de carbono y respiracin del suelo. El suelo constituye una importante fuente de sumidero o reservorio de carbono. El conocimiento de variables de acumulacin se sustenta en la interaccin entre carbono orgnico y propiedades fsicas, qumicas y biolgicas relaciones afectadas por un uso y manejo especfico del suelo en un contexto de ecosistema altoandino; por tanto, este anlisis permite generar una serie de pautas relacionadas con estrategias de adaptacin al cambio climtico basado en prcticas de remediacin del suelo que inciden en la productividad del suelo, planta, animal y del ambiente. Los procesos fsicos y qumicos que ocurren en los sistemas naturales originan cambios en las relaciones entre los istopos estables (13C/12C, 15N/14N). El estudio del fraccionamiento isotpico representa una gran herramienta para determinar el origen de componentes tanto orgnicos como inorgnicos, siendo posible la interpretacin de registros naturales as como el suministro de 62

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informacin paleoclimtica y paleoambiental predictivos de evolucin climtica
valiosa junto con la elaboracin de modelos
Captulo 3: Formar una masa crtica de alto nivel en agricultura y cambio climtico a travs de la socializacin de resultados con el sector productivo y ambiental. Se realizaron 3 tesis de maestra que estn en un proceso de sustentacin, dos jvenes investigadores, 2 estudiantes de pasanta y un estudiante de doctorado. Los estudiantes vinculados al proyecto: William Rendn, Ingeniero Qumico de la maestra de Ingeniera Ambiental (Se retir en el segundo ao del proyecto), bajo la direccin del Dr Miguel Ayarza, Juan de Jess Vargas, Zooctenista, estudiante de maestra de Produccin Animal de Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot, bajo la direccin del Dr Juan Carulla y Alexandra Salinas, zootecnista, maestria ciencias ambientales, Universidad Distrital, dirigida por Olga Luca Mayorga. Adicionalmente, en la convocatoria de Jvenes Investigadores convocada por COLCIENCIAS en agosto de 2009 y junio 2010, fueron aprobados dos jvenes investigadores, los cuales sern financiados por CORPOICA-COLCIENCIAS. Los trabajos que fueron aprobados fueron CUANTIFICACIN DE GASES DE EFECTO INVERNADERO EMITIDOS POR PRADERAS DE KIKUYO (Pennisetum clandestinum), DE LOTUS Y SU ASOCIACIN UTILIZADAS EN SISTEMAS DE ALIMENTACIN ANIMAL, el cual ser realizado por Kar en Malagn (Qumica y el estudio USO DE TCNICAS MOLECULARES PARA MONITOREO DE BACTERIAS METANOGNICAS DE BOVINOS EN PASTOREO a ser desarrollado por Erika Angarita. Por otro lado, Erika Angarita, ingreso al programa de maestra de Produccin Animal de Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Fueron adems vinculados dos estudiantes de pre-grado en zootecnia como actividades de pasanta de la Universidad Cundinamarca, para colaborar en las actividades de muestreo en las GEI en suelos, ellos fueron Mauricio Jose Avila y Diana Parra. Se socializ los resultados a travs de los siguientes eventos: Seminario internacional sobre cambio climtico y los sistemas ganaderos, realizado los das 24 y 25 de Marzo de 2009, en el Auditorio de la Universidad de la Salle. Da de campo: demostracin prctica de la metodologa del SF6 para medir la produccin de metano por los animales y de cmaras cerradas para medir emisiones de oxido nitroso, realizado en Corpoica, C.I. Tibaitat, el 27 de marzo de 2009. Entidades participantes: Universidad de la Salle, Embrapa, CIAT, FEDEGAN, Corpoica. Taller: AMENAZAS Y OPORTUNIDADES DEL CAMBIO CLIMTICO EN LA GANADERA COLOMBIANA, 24 de septiembre de 2010 con la participacin de 75 personas, entre investigadores, productores y estudiantes.
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Taller: LOTUS ULIGINOSUS COMO ESTRATEGA DE MITIGACIN Y ADAPTACIN AL CAMBIO CLIMTICO, 15 de julio de 2011 con la participacin de 85 personas, entre investigadores, productores y estudiantes.
Se elabor un folleto informativo lotus uliginosus como estrategia de mitigacin y adaptacion al cambio climtico y se encuentra en el editor la cartilla estrategia de mitigacin de gases efecto invernadero y adaptacin a la variabilidad climtica de un sistema de produccin de leche especializada en ecosistema alto-andino. Participacin en los congresos Nacionales (2) e Internacionales (2):
1. III
Congreso Internacional sobre cambio climtico y desarrollo sostenible, UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA - TEATRO ARGENTINO, August 8, 2011 August 11, 2011; ACUMULACIN DE CARBONO EN SUELO DE PASTURAS PURA Y ASOCIADA DE Pennisetum clandestinum y Lotus uliginosus, EN LA SABANA DE BOGOT por Alexandra Salinas.
2. XI ENCUENTRO NACIONAL Y IV INTERNACIONAL DE INVESTIGADORES DE
LAS CIENCIAS PECUARIAS-ENICIP, Medellin, Colombia: a) Acumulacin de carbono en suelo de pasturas pura y asociada de Pennisetum clandestinum Graminae y Lotus uliginosus Fabacea, en la Sabana de Bogot por Alexandra Salinas. Aplicacin de tcnicas moleculares para identificacin y monitoreo de microorganismos metanognicos de bovinos en pastoreo, por Erika Angarita
b)
IX CONGRESO COLOMBIANO DE METEOROLOGA, Conferencia Internacional "200 aos de la meteorologa y de la climatologa en Amrica Latina", Bogot, 23, 24 y 25 de Marzo de 2011; VALORACIN DEL EFECTO DE DOS ESPECIES Pennisetum clandestinum (pasto kikuyo) GRAMINAE y Lotus corniculatus (LOTUS) FABACEA, EN CULTIVO PURO Y ASOCIADA SOBRE LA ACUMULACIN DE CARBONO EN SUELO EN LA SABANA DE BOGOT. Por Alexandra salinas
4. 48. REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 18 a 21 de julho de 2011, em Belm, no Par, no Hangar Centro de Convenes e Feiras da Amaznia
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a)
Fluxos de metano em solos cultivados com forragem lotus uliginosus, pennisetum clandestinum, e sua associao em um sistema de produo pecurio da sabana de bogot, karen malagn
b) Anlise da diversidade de microrganismos metanognicos do rmen de gado pastando em
Lotus uliginosus y Pennisetum clandestinum. Por Erika Angarita. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Acosta, M. Diseo y aplicacin de un mtodo para medir los almacenes de carbono en sistemas con vegetacin forestal agrcola de ladera de Mxico. Tesis. Colegio de Postgraduados, Montecillo, Mxico. 121 p. 2003. Albrecht A, Kandji ST. Carbon sequestration in tropical agroforestry systems. Agric. Ecosyst. Env. 99: 15-27. 2003. Balesdent, J., Arrouays, D. Usage des terresetstockage du carbonedans les sols du territoirefrancais (1900-1999) C.R. Acad. Agric. Fr 85 (6): 265-277. 1999 Balesdent, J., Chenu, C., Balabane, M. Relationship of soil organic matter dynamics to physical protection and tillage. Soil and Tillage Research 53: 215-220. 2000. Batjes, N.H. Management options for reducing CO2- concentrations in the atmosphere by increasing carbon sequestration in the soil. ISRIC. Wageningen, The Netherlands. 114 pp. 1999. Batjes, N.H. Total carbon and nitrogen in the soils of the world. European Journal of Soil Science 47: 151-163. 1996. Batjes, N.H. y W.G. Sombroek. Possibilities for carbon sequestration in tropical and subtropical soils. Global Change Biology 3(2): 161-173. 1997. Blaxter, K.L.; Clapperton, J.L. Prediction of the amount of methane produced by ruminants.British journal of nutrition 19: 511-522. 1965. Boeckx P., Cleemput O., Villaralvo I. 1997. Methane oxidation in soils with different textures and land use. Nutrient Cycling in Agroecosystems 49. pp. 91-95 Bostrm, B., Comstedt, D. &Ekblad, A. 2007. Isotope fractionation and 13C enrichment in soil profiles during the decomposition of soil organic matter. Oecologia, 153, 89-98. Bravo, C y A. Florentino. Nivel de cobertura, conservacin y aguas bajo diferentes sistemas de labranza. Revista de la Facultad de Agronoma, Maracay 25: 57-74. 1999. Bronson K., Mosier A. 1994. Suppression of methane oxidation in aerobic soil by nitrification inhibitors. Biology and Fertility Soils 17. pp. 263-268 Caballero, L.M.; Sanchez, L.E. Accin de Eucaliptus globulus, Pinus radiata y ocho especies nativas del alto andino sobre el suelo, Cundinamarca. Tesis de grado de Biologa. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 1986. 65

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Trumbmore, S.E., Davidson, E.A., Barbosa de Camargo, P., Nepstad, D.D., Martinelli, L.A. Belowground cycling of carbon in forests and pastures of eastern Amazonia. Global Biogeochemical Cycles 9: 515-528. 1995. Van Noordwijk, M., Cerri, C., Woomer, P.L., Nugroho, K., Bernoux, M. Soil carbon dynamics in the humid tropical forest zone.Geoderma 79: 187-225. 1997. Vogt KA, Vogt DF, Palmiotto PA, Boon P, OHara J, Asbjrnsen H Review of root dynamics in forest ecosystems grouped by climate, climatic forest type and species. Plant Soil 187: 159- 219. 1996. Weissenberg, H. Die mikroorganismentatigkeit auf rohumushaltigem. Heidesandgemessenan der CO2 produktion Z. Pflanzanernahrung. Dung Boderkde 66. p 227-239. 1954. Whalen S. C. and Reeburgh W.S. 1996. Moisture and temperature sensitivity of CH4 oxidation in boreal soils. Soil Biol. Biochem. 28: 1271 1281. Whitford, M. F., R. M. Teather, and R. J. Forster. 2001. Phylogenetic analysis of methanogens from the bovine rumen. BMC Microbiol. 1:5. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb. 2008, p. 889893 Vol. 74, No. 3 Wiant, H. Influence of temperature on the rate of soil respiration. J. forest 65. p. 489-490. 1967. Witkamp, M. Descomposition leaf litter in relation to environment microflora microbial respiration. Ecology, vol. 47. No. 2. 1966. Woodward, S. L.; Woodward, G. C. Waghorn, G.; Ulyatt, M. J. and Lassey, K. 2001. Early indications that feeding lotus will reduce methane emissions from ruminants. Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production. Vol 61: 25 -36. Young, A. Soil monitoring: a new basic task for soil surveys, Soil Use and Management 7: 126130. 1991. Zhou, M., E. Hernandez-Sanabria, et al. (2010). "Characterization of Rumen Methanogenic Community Variation under Different Diets and Host Feed Efficiencies Using PCR-DGGE Analysis." Appl. Environ. Microbiol.: AEM.00010-10.
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RESULTADOS ESPERADOS, RESULTADOS OBTENIDOS E INDICADORES Resultado esperado Tcnica de medicin de metano validada y estandarizada para un sistema produccin lechero en Colombia (Sabana de Bogot) Resultado obtenido Tcnica de medicin de metano validada y estandarizada para bovinos en pastoreo. En la Sabana de Bogot Indicador verificable Informe final, resmenes publicados en congresos nacionales e internacionales, y informacin digital de los resultados presentados en los talleres, folleto pblico y cartilla en edicin.
Reduccin en la produccin de metano entrico por vacas y reduccin en la produccin de gases efecto invernadero en suelo
Evaluar el efecto de pasturas con y sin leguminosa sobre produccin y calidad composicional de la leche y capacidad de reducir emisiones de CH4
Productividad de las pasturas evaluada y composicin botnica determinada. Calidad composicional del forraje valorada. Microorganismos ruminales identificados y cuantificados a nivel de gnero y correlacionados con el proceso de metanognesis. cidos grasos voltiles (AGV) determinados y relacionados con el proceso de metanognisis ruminal
Mayor produccin de leche Produccin de leche en los y mejor calidad de leche diferentes modelos de producida alimentacin determinada y propiedades fsicoqumicas y calidad composicional de la leche 73
Produccin y calidad composicional de la leche valorada.

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valorada.
Pasturas como medida de adaptacin y mitigacin con capacidad secuestrar carbono, reducir emisiones de N2O y de CH4.
1) xido nitroso emitido por el suelo valorado, 2) evaluado, 3) Cantidad de dixido de carbono emitido por el suelo de las pasturas evaluadas 4) Cantidad de carbono secuestrado en funcin del tipo de pastura y 5) Metano emitido por el suelo de las tratamientos Talento humano formado como investigadores.
Oxido nitrosos, metano y dixido de carbono determinados y captura de carbono determinada en los suelos cultivados en las pasturas de estudio.
Formar una masa crtica de alto nivel en agricultura y cambio climtico a travs de la socializacin de resultados con el sector productivo y ambiental.
Dos talleres de capacitacin al sector productivo de la cadena lctea y del sector ambiental.
Informes finales, una tesis elaborada para optar al ttulo de Ph. D. Dos tesis elaboradas para optar al ttulo Magster. Divulgacin de los resultados en un evento nacional o internacional. Dos Talleres de socializacin a 100 productores; cartillas
PRODUCTOS Y/O PROCESOS GENERADOS E IMPACTOS Tipo de Producto y/o Proceso Nombre del Producto y/o Proceso Plazo (aos) despus de finalizado el proyecto 5 aos
Descripcin Valorar un sistema de produccin de
Impacto Esperado Sistema de produccin de leche 74
Indicador verificable Informe final, una tesis elaborada para optar al ttulo de Ph. D.
Estudios y Produccin de Caracterizaciones metano por vacas en

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pastoreo determinada en gramneas y leguminosas
leche especializada para adaptarse a variabilidad climtica severa y mitigar gases efecto invernadero
especializada valorado en trminos de productividad y produccin de gases efecto invernadero
Divulgacin de los resultados en un evento nacional o internacional. Dos Talleres de socializacin a 100 productores; cartillas Dos actas elaboradas. Dos listas de los asistentes a los dos talleres Informe final, resmenes publicados en congresos nacionales e internacionales, y informacin digital de los resultados presentados en los talleres, folleto pblico y cartilla en edicin.
Estudios y Determinar la Caracterizaciones capacidad de pasturas con y sin leguminosa de secuestrar carbono, reducir emisiones de N2O y de CH4 como medida de mitigacin.
xido nitroso emitido por el suelo valorado
Metano emitido por el suelo de las tratamientos (2) evaluado Cantidad de dixido de carbono emitido por el suelo de las pasturas evaluadas Cantidad de carbono secuestrado en funcin del tipo de pastura Tcnica de
Evaluar la capacidad de un sistema de produccin de leche especializada para adaptarse a variabilidad climtica severa y mitigar gases de efecto de invernadero usando diferentes pasturas cultivadas en sus suelos
10 aos
Metodologas o
Ajuste de tcnica
Produccin de 75
2 aos
Informe final,

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Procesos (procesos agroindustriales; mtodos de investigacin y de transferencia; protocolos de laboratorio)
SF6 para medir emisiones de metano en animales en pastoreo
medicin de metano validada y estandarizada para bovinos en pastoreo
metano por vacas en pastoreo determinada por el uso del marcador interno SF6
resmenes publicados en congresos nacionales e internacionales, y informacin digital de los resultados presentados en los talleres, folleto pblico y cartilla en edicin.
Nota: Para la identificacin de Productos y/o Procesos se debe tener en cuenta la clasificacin correspondiente Clasificacin de los Productos y/o Procesos Generados Bioproductos (biofertilizantes, bioplaguicidas y bioreactivos) Estudios y Caracterizaciones Construcciones, equipos, herramientas, instrumentos de medicin u otros implementos Metodologas o Procesos (procesos agroindustriales; mtodos de investigacin y de transferencia; protocolos de laboratorio) Modelos biofsicos, economtricos, bioeconmicos, etc. Recomendaciones tcnicas y prcticas de manejo Nuevos materiales genticos (variedades, clones, razas, hbridos, dems) Sistemas de informacin, cartografa, bases de datos, etc. Vacunas Colecciones biolgicas Apoyo en gestin empresarial a organizaciones de productores Tecnologas escaladas (biofbricas, semillas) Productos agroindustriales transformados Sistemas expertos para la produccin (Software)
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FINANCIADO POR: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

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QCH4= [(CCH4 - CbCH4)* QSF6/(CSF6 - CbSF6)]*[MWCH4/MWSF6]

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Pradera Lotus (rojo) -3 2 1 3 2

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Figura 3. Materiales para sondeo oro-ruminal de contenido de rumen.

Figura 4. Procesamiento y pH de las muestras de contenido de rumen. 18

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Figura 5. Cabecera de los Lotes de Lotus Kikuyo

Figura 6. Cabecera de lotes de Lotus +

Figura 7. Lotus en pasturas inundadas Composicin qumica de los forrajes

Figura 8. Sobrevivencia del Lotus bajo inundacin

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Figura 9. Capilares para yugos

Figura 10. Yugos calibrados

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Presurizacin de la muestra Loop (1ml)

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Yugo Yoke 8 Yoke 6

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Prodn. biomasa, kg MS/ha Proporcin Lotus, % Proporcin trbol, %

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Proporcin arvenses, % Proporcin ryegrass, %

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Instalacin de las cmaras

Toma de muestras de gas

Chu et al., 2007

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