Trabajos Prcticos de Laboratorios Ingeniera en Alimentos Trabajo Prctico de Laboratorio N1 Microscopio: Tinciones. Observacin de distintos tipo de microorganismos.

. Desarrollo Experimental. Cultivos de microorganismos Aspergillus Niger Penicillium sp Penicillium expansum Botrytis cinerea Bacterias Tcnicas Utilizadas. EXAMEN EN FRESCO 1. Prender el mechero y esterilizar el ansa en la llama hasta que se ponga al rojo vivo. El asa se toma del mango como si fuera un lpiz. 2. Dejar enfriar el ansa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. 3. Se coloca una gota de agua destilada en el portaobjetos. La boca del tubo se flamea despus de abrir y antes de cerrar y el tapn se maneja con el meique de la mano derecha. 4. Se toma una pequea porcin del cultivo y se mezcla con la gota de agua hasta formar una suspensin homognea. Cubrir con el cubreobjetos. 5. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero. Toda la operacin se realiza cerca del mechero. 6. Observar al microscopio ptico. Vistas obtenidas del microscopio Mohos Saccharomyces cerevisiae Levaduras Rhodotorula sp

Mohos

Rahnella aquatelis

Vistas de una cabeza aspergilada de Aspergillus Niger (10x) y (40x) Pgina 1 Microbiologa General Curso 2012

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Vistas de hifas de Penicillium sp (10x) y (40x)

Vista de esporas diseminadas de hongos filamentosos ambientales contaminantes de un cultivo de bacterias (40x)

Vistas de Botrytis cinrea (10x) y (40x) Levaduras Pgina 2 Microbiologa General Curso 2012

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Muestra de Saccharomyces cerevisiae (40x) TINCIN VITAL (EN FRESCO)

Muestra de Rhodotorula sp (40x)

Esta tcnica es especfica para el reconocimiento de clulas de levaduras. Permite diferenciar entre clulas vivas y muertas. Fundamento: Las clulas vivas utilizan como ultimo aceptor de electrones al azul de metileno, el cual cuando se reduce pasa de azul a incoloro. Por lo tanto las clulas vivas se vern incoloras al microscopio, mientras que las muertas se observan azules. 1. Se realizan los pasos del 1 al 4 de la tcnica anterior, pero antes de colocar el cubreobjetos se colocan unas gotas de azul de metileno. 2. Observar al microscopio.

Vista de clulas de levaduras: mayor porcentaje de clulas muertas TINCIN DE GRAM Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar varias soluciones: Pgina 3 Microbiologa General Curso 2012

Trabajos Prcticos de Laboratorios Ingeniera en Alimentos 1. Un primer colorante bsico cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas. 2. Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clulas. El mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula. 3. Un agente decolorante, la mezcla alcohol-acetona, que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. 4. Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. Se usa la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Fundamento: Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano. 1. Se precede como en las tcnicas anteriores. 2. Luego de extender una fina pelcula de la suspensin sobre el portaobjeto, se cubre y se seca sobre la llama del mechero. 3. Se deja enfriar, luego se colorea y se deja secar. 4. Se observa al microscopio. Vistas de bacterias

Gram positivos: Estreptococos en yogurt.

Gram negativos: Enterobacterias y Cocobacterias (Rahnella)

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Gram positivos: Esporas de bacilos coloreadas

Gram negativas: Lactobacilos en yogurt.

Informe realizado por alumna de Ing. en Alimentos: Cceres Lidia Raquel

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