FACULDADE DE CINCIAS DA UNIVERSIDADE DE LISBOA

Estudo Cintico da Invertase da Levedura

Bioqumica I
Professora Carla Real
10/05/2013

Bioqumica I

2012/2013

Trabalho n6

ndice
Materiais e reagentes ................................................................................................................... 3 Resumo.......................................................................................................................................... 4 Introduo ..................................................................................................................................... 5 Tratamento de Resultados ............................................................................................................ 7 Questes a desenvolver .............................................................................................................. 16 Bibliografia .................................................................................................................................. 19

Bioqumica I Materiais e reagentes

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Trabalho n6

Sacarose 0,5 M Reagente de Nelson Reagente de arsenomolibdato Tampo acetato de sdio (pH= 4,5) 0,2M Tampo Tris-HCl (pH=7,5) 0,01M Soluo stock de enzima 1mg/mL Cronmetros Micropipetas Papel indicador Universal Espectrofotmetro UV-VIS Material corrente de laboratrio

Bioqumica I Resumo

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Trabalho n6

A cintica enzimtica define-se como sendo o estudo da velocidade de uma reaco na presena de um enzima. Com este trabalho experimental pretendia-se no sestudar a cintica da reaco de hidrlise da sacarose, catalisada pelo enzima invertase, como tambm determinar os parmetros cinticos km e Vmx. atravs da medio das velocidade iniciais da reaco catalisada. Neste trabalho laboratorial foi utilizada uma soluo stock de enzima de concentrao 2,5 U/mL, a qual foi preparada por diluio de uma soluo stock 1mg/mL, usando tampo TrisHCl (pH 7,5) 0,01 M. Aps a sua preparao, a soluo de enzima foi mantida a uma temperatura prxima de 0C. Atravs desta experincia determinou-se os valores de Km e Vmx , que foram ,respectivamente, 44,7 mM e 58,8 M min-1 . O valor da constante de Michaelis-Menten foi mais alto do que os valores tericos, concluindose que houve erros nas medies.

Bioqumica I Introduo

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Trabalho n6

Em 1833, Payen e Persoz isolaram, a partir de extracto de malte, uma substncia qual denominaram diastase (do grego separar) que permitia a hidrlise do amido em glucose. Esta fora a primeira vez que se isolara um enzima, que um composto orgnico que apresenta propriedades de catalisador. Desde essa grande descoberta que os enzimas so molculas que despertam grande interesse devido s funes que desempenham no metabolismo celular e s suas capacidades de catlise e selectividade de reaces. Para compreender como trabalham os enzimas, necessrio saber o efeito que causam diversos factores, tais como a concentrao do substrato, variaes d pH, temperatura, fora inica entre outros. Ao estudo dos factores que influenciam a velocidade da catlise, chamamos Cintica Enzimtica. A equao que relaciona o enzima, E, o substrato, S, e o produto da reaco, P, a seguinte: E+S ES E+P

Para que haja a formao de um complexo ES funcional necessrio que o substrato possua determinadas caractersticas compatveis com o centro activo do enzima. Em 1913 a teoria da aco e cintica enzimtica foi desenvolvida por Michaelis e Menten, na qual uma reao enzimtica pode ser expressa pela seguinte equao:

O modelo admite implicitamente que: a catlise ocorre atravs da formao rpida e reversvel de um complexo ES, entre enzima e substrato; S se considera um passo com importncia do ponto de vista cintico entre o complexo ES e a libertao do produto, P, com regenerao do enzima; O passo da formao do produto irreversvel (cintica de velocidades iniciais). Para muitos enzimas a sua cintica descrita por uma hiprbole, sendo a sua cintica descrita quantitativamente pela equao de Michealis-Menten. Na equao de Michaelis-Menten V0 a velocidade inicial, Vmx. a velocidade mxima, KM a constante de Michaelis-Menten e S o substrato.

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Trabalho n6

Quando se recorre a ensaios de mtodos de amostragem para a determinao da velocidade inicial de reaco, pode ocorrer um decrscimo da velocidade durante a reaco devido a: a) O grau de saturao do enzima com o substrato pode diminuir ao longo do tempo devido ao desaparecimento progressivo do substrato (Fig. 2); b) No caso da reaco estudada ser reversvel, a reaco inversa da estudada pode tornar-se mais significativa ao longo do tempo devido lei da aco das massas; c) Os produtos da reaco podem inibir o enzima em estudo e/ou, d) O enzima pode sofrer uma inactivao/desnaturao gradual devido temperatura ou ao valor de pH do meio a que a reaco est a decorrer. Estes factores no tm um efeito significativo no incio da reaco, deste modo, nos primeiros instantes de reaco que as condies experimentais so verdadeiramente conhecidas, este o mtodo proposto e conhecido por Henri-Michealis-Menten. Com esta actividade experimental pretendia-se estudar a cintica da reaco de hidrlise da sacarose, catalisada pelo enzima Invertase da levedura, determinando-se os parmetros Km e Vmx pela medio das velocidades iniciais. Assim conclui-se que factores como a temperatura, pH e tempo da reaco foram mantidos constantes ao longo da experincia, variando apenas a concentrao do substrato. O enzima invertase catalisa a hidrlise da ligao glicosdicas (1-2) da sacarose, dando assim origem aos seus sidos constituintes, a glucose a frutose, tal como est representado na figura 2:

Com esta reaco obtm-se duas oses redutoras por cada molcula de sacarose hidrolisada, pelo que a velocidade da hidrlise da sacarose pode ser determinada atravs da medio da quantidade de oses formadas ao longo do tempo. Para tal usa-se o reagente de Nelson, que um mtodo de doseamento de glcidos redutores, ocorrendo a formao de xido cuproso. Fazendo reagir este composto com o reagente de arsenomolibdato origina-se a um composto azul, cuja absorvncia mxima a um comprimento de onda de 510nm. Deste modo, a reaco foi seguida por mtodos espectrofotomtricos, para que fosse possvel a determinao da absorvncia do produto formado pela reaco enzimtica, e consequentemente, fosse possvel inferir acerca da concentrao de produto, e assim, a determinao dos parmetros cinticos.

Bioqumica I Tratamento de Resultados

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Trabalho n6

Clculo da concentrao exacta das vrias solues de invertase preparadas

Diluio para 2,5U/mL
A preparao da soluo de enzima invertase passou pela diluio de uma soluo inicial de concentrao 1mg/mL. Massa de enzima pesada = 49,5 mg Volume final = 50 mL donde: Como 43U _____ 1 mg x _____ 0,99 mg x = 42,57 U e, como se pretende diluir a soluo preparada para 2,5U/mL num volume total de 20mL, o volume de soluo que se pretende diluir dado por:

Diluio para 1,0U/mL

Neste caso, diluiu-se a soluo inicial (43U/mL) para uma concentrao de 1,0U/mL. Assim sendo, o volume de soluo que se pretende diluir dado por:

Ci Vi C f V f 43 Vi 1,0 20 Vi 0,465 mL

Discusso dos resultados obtidos e base de actuao do reagente de Nelson

Ao longo de toda a actividade experimental foram usados tubos de controlo para os quadros 1 e 2. No quadro 1(do protocolo) pretendia-se estudar a influncia da concentrao de substrato na actividade do enzima invertase da levedura. O zero do espectrofotmetro foi feito com o tubo 1, porque este no tinha sacarose. Como tal, no se formou nenhum produto (glucose e frutose) e consequentemente no havia glcidos redutores no meio reaccional (o que evidenciado pelo mtodo de Nelson). O tubos 10 foi usado como controlo para o efeito do reagente de Nelson na aco enzimtica, visto que lhe foi adicionada o reagente antes do enzima. Como o reagente de Nelson inibe a actividade do enzima, obteve-se uma concentrao de glcidos redutores mais baixa. J no tubo 11 tambm se adicionou primeiro o reagente de Nelson, mas neste no foi adicionado o enzima, portanto pretendia-se seguir a dissociao da sacarose (frutose e glucose). Ao compararmos os resultados das absorvncias

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Trabalho n6

dos tubos 10 e 11 verificamos que estes so muito prximos, o que permite concluir que a dissociao do disido no tubo 10 algo em que o enzima no catalisa. No quadro 2(do protocolo) foi, novamente, usado o tubo 1 para definir o zero do espectrofotmetro, porque no tinha sacarose. Com este quadro pretendia-se controlar a hidrlise no enzimtica da sacarose. O reagente de Nelson um agente de paragem da reaco de dissociao do disido (sacarose). Isto acontece porque o cobre presente neste reagente reduzido pelos glcidos presentes na sacarose, em meio bsico e quente. O cobre reduzido vai actuar depois sobre o reagente de arsenomolibdato determinado a cor azul da soluo, que proporcional concentrao de glcidos presentes em soluo. O calor vai provocar a decomposio parcial dos glcidos em fragmentos oxidveis pelo hidrxido cuproso, presente no reagente de Nelson. Esta reaco d origem ao cido etanodiico, ao cido propanodiico, entre outros. Nesta reaco o hidrxido de cobre reduz-se a hidrxido cuproso, passando a soluo de um tom azul para amarelo. medida que o aquecimento continua, o hidrxido cuproso fica desidratado, transformando-se em xido cuproso, que confere soluo um tom vermelho. este xido cuproso que vai reduzir o reagente de arsenomolibdato, originando o xido de molibdnio (MO3O8), que apresenta uma cor azul. Como j foi referido, esta soluo resultante apresenta um tom azul, cuja intensidade proporcional ao teor de glcidos, por isso pode ser medido atravs do espectrofotmetro a 510nm .Portanto conclui-se que o reagente de Nelson utilizado com duas finalidades. A primeira a identificao de glcidos redutores (atravs da formao de um composto de cor azul azul de molibdnio proveniente da reaco do arsenomolibdeno com xido cuproso), e a segunda a desnaturao do enzima, devido a uma variao brusca do pH para valores elevados, que ir pr fim a reaco de hidrlise enzimtica, isto porque, uma vez desnaturado, o enzima perde a sua funo.

Os enzimas apresentam geralmente um pH ptimo de funcionamento, e o invertase no excepo. O intervalo de actuao do invertase de pH entre 3,5 e 5,5, sendo que o pH ptimo 4,5 a 55C. Se o enzima no se encontrar em soluo, a hidrlise da sacarose ocorre muito facilmente se o meio for cido. Isto permite concluir que o reagente de Nelson torna a soluo mais bsica, e deste modo inibe o enzima. Este facto deve-se alterao do estado de ionizao de um grupo funcional do enzima, e mesmo a presena do tampo de fosfatos este no tem a capacidade de neutralizar uma base to forte.
Para 2,5 U/mL Foram, ento, medidas as absorvncias a um comprimento de onda de 510nm de todos os tubos de ensaio preparados, estando os resultados apresentados em seguida no Quadro 1. Tubos n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Abs 510nm 0,000 0,631 0,757 0,767 0,609 0,583 0,740 1,055 0,870 0,088 0,082 Quadro 1: Absorvncias da hidrlise total para 2,5U/mL. 8

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Sabendo que este ensaio experimental foi descontnuo,isto porque o volume do enzima, o tempo de incubao, e o volume total dos tubos de ensaio so sempre os mesmos (0,1mL, 10 minutos e 10 mL respectivamente), aumentando apenas a quantidade de substrato de tubo para tubo. Logo, ser de esperar que os valores de absorvncia aumentem medida que se aumenta a concentrao de glcidos reductores, como se pode verificar atravs da lei de Lambert-Beer(Abs=lc). No entanto verifica-se que tal no acontece nos tubos 5,6,7 e 9, muito provavelmente devido a erros experimentais. Nos tubos 10 e 11 esperam-se valores de absorvncia mais baixos, visto que no houve actividade enzimtica( apesar de o tubo 10 conter enzima). Para o tubo 10, a formao de glcidos redutores est apenas dependente da hidrlise no enzimtica, sendo por isso a taxa de formao do produto, menor, e, consequentemente, valores de absorvncia menores, provando-se assim que o reagente de Nelson pra a reaco enzimtica. Para o tubo 11, devido ausncia de enzima, espera-se um valor de absorvncia menor, uma vez que a hidrlise facilitada em meio acdico(provm do tampo que est a pH 4,5). Tubo n 1 Abs 510nm 0,000 2 0,014 3 0,014 4 0,015 5 0,022 6 0,023 7 8 0,132 9 0,112

Quadro 2: Absorvncias da hidrlise no enzimtica para 2,5U/mL. Neste quadro os valores de absorvncia devem-se apenas hidrlise da sacarose em meio cido devido presena do tampo acetato de sdio pH 4,5. Assim devia verificar-se um aumento progressivo mas lento dos valores de absorvncia, o que pode ser comprovado atravs do Quadro 2. Tal no acontece na passagem do tubo 8 para o 9, verifica-se que h um ligeiro decrscimo que deve ser resultado de erros nas medies. No quadro no se apresenta o valor do tubo n7, porque durante o aquecimento o nosso tubo foi perdido no meio de tantos tubos que estavam em banho maria, e por isso decidimos no considerar esse valor.

Estudo da hidrlise total e no enzimtica da sacarose em funo da concentrao de substrato

Nesta experincia foram utilizadas duas diluies diferentes da soluo de enzima invertase: 2,5U/mL e 1,0U/mL. Contudo, os clculos em seguida apresentados podem ser aplicados a qualquer uma das diluies, uma vez que as concentraes de sacarose utilizadas so iguais. Para calcular as concentraes de sacarose, acima referidas, presentes em cada tubo de ensaio, recorremos frmula: Os clculos que se seguem esto apenas exemplificados para o tubo 2 (pois o tubo 1 no contm sacarose), estando os restantes resultados, para os restante tubos, indicados no Quadro abaixo. Tubo 2 [sacarose]inicial = 0,5 M 9

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Vinicial = 0,01 mL Vfinal = 10 mL [sacarose]final = ?

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Trabalho n6

Apresenta-se a seguir o quadro com as concentraes em cada tubo: Tubo n 1 Concentrao da sacarose (M) Concentrao da sacarose (g/mL) 0 2 0,0005 3 0,001 4 0,0015 5 0,0025 6 0,0035 7 0,005 8 0,01 9 0,015

0,5

1,5

2,5

3,5

10

15

Quadro 3: Concentrao de sacarose num volume total de 10 mL.

Para concentrao 2,5U/mL

Aps a preparao das solues indicadas no Quadro 1 e no Quadro 2(do protocolo), mediramse os respectivos valores de absorvncia, estando os resultados apresentados no Quadro 4. A coluna da hidrlise total corresponde aos valores de absorvncia do Quadro 1 e a hidrlise no enzimtica aos do Quadro 2(do protocolo). Concentrao da sacarose (M) 0 0,0005 0,001 0,0015 0,0025 0,0035 0,01 0,015 Concentrao da sacarose (g/mL) 0 0,5 1 1,5 2,5 3,5 10 15 Hidrlise total 0,000 0,631 0,757 0,767 0,609 0,583 1,055 0,870 Hidrlise no enzimtica 0,000 0,014 0,014 0,015 0,022 0,023 0,132 0,112

Tubo n 1 2 3 4 5 6 8 9

Quadro 4: Abs510nm para as respectivas hidrlises em 2,5U/mL.

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1.2

Absorvncia a 510 nm

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 Concentrao de Sacarose mM 20 Hidrlise total Hidrlise no enzimtica

Grfico 1- Grfico que relaciona a Absorvncia a 510 nm com a concentrao de sacarose

De acordo com a anlise dos resultados obtidos, verificou-se que os valores de absorvncia obtidos para os tubos onde ocorreu hidrlise quer pela presena de enzimas quer pela acidez do meio (devida presena do tampo acetato de sdio, com pH 4,5 hidrlise no enzimtica), so superiores aos obtidos para as solues onde apenas se deu a hidrlise no enzimtica, o que se deve ao facto de se obter uma maior quantidade de glcidos redutores (resultantes da hidrlise da sacarose) pois estes resultam da ocorrncia dos dois tipos de hidrlise. Este facto leva a que um maior nmero de molculas de sacarose sejam hidrolisadas mais rapidamente, o que contribui para que a intensidade da colorao da soluo aumente, provocando um aumento do valor da absorvncia quando estes valores so comparados aos obtidos para as amostras submetidas apenas a hidrlise no enzimtica. Alm disto, pode tambm dizer-se que, no caso da hidrlise relativa apenas acidez do meio (conferida pelo tampo de acetato de sdio, pH 4,5), se verificou um aumento progressivo mas muito lento dos valores de absorvncia, o que era de esperar uma vez que os enzimas apresentam uma velocidade de catlise bastante elevada. Como nestes tubos no existia invertase, a reaco de hidrlise da sacarose ocorre a um ritmo muito lento. Esperava-se que o grfico que diz respeito hidrlise total fosse prximo de uma hiprbole, visto que na presena de enzima, e com concentraes baixas de substrato, se obtm uma formao rpida de produto e, medida que a concentrao de substrato vai aumentando, o enzima vai ficando cada vez mais saturado (levando a um aumento mais lento nos valores de absorvncia). Para a hidrlise no enzimtica, o grfico esperado era 11

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prximo de uma recta, pois, uma vez que no se tinha enzima em soluo, a formao de produto no depende da formao do complexo enzima-substrato nem da saturao do enzima, variando a absorvncia de uma forma aproximadamente linear. Em relao a este ensaio pode-se verificar que o grfico referente hidrlise no enzimtica se aproxima de uma recta, tal como era previsto. No entanto o grfico que diz respeito hidrlise total tem uma forma ligeiramente hiperblica, mas h vrios valores que se desviam. Para se determinar o valor das absorvncias na hidrlise enzimtica subtrai-se o valor da absorvncia no enzimtica absorvncia enzimtica total, tal como no frmula seguinte:

AbsHidrliseEnzimtica = AbsHidrliseTotal AbsHidrliseno enzimtica

De acordo com o que foi dito anteriormente, fez-se o quadro 5: Concentrao Concentrao Hidrlise da sacarose da sacarose Hidrlise no Tubo n (M) (g/mL) total enzimtica 1 2 3 4 5 6 8 9 0 0,0005 0,001 0,0015 0,0025 0,0035 0,01 0,015 0 0,5 1 1,5 2,5 3,5 10 15 0,000 0,631 0,757 0,767 0,609 0,583 1,055 0,870 0,000 0,014 0,014 0,015 0,022 0,023 0,132 0,112

Hidrlise enzimtica 0,000 0,617 0,743 0,752 0,587 0,560 0,923 0,758

Quadro 5: Absorvncias da hidrlise enzimtica para 2,5U/mL. A partir deste quadro, construiu-se o seguinte grfico, que relaciona a concentrao de sacarose com os valores de absorvncia dos diversos tubos: Desta forma, o clculo dos valores de velocidade inicial de hidrlise da sacarose na mistura reaccional devido aco enzimtica, (exemplificado para o tubo 2): De acordo com a lei de Lambert-Beer e tendo em conta que e que foram feitos do seguinte modo

c corresponde concentrao de glcidos redutores, tem-se que

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Este valor de concentrao corresponde concentrao de glcidos redutores para um volume igual a 10 mL. No entanto, pretende obter-se a concentrao para 1 mL, pois o volume da mistura reaccional. Desta forma, procedeu-se do seguinte modo:

Como v0 pode ser calculado do seguinte modo, [ ]

Tendo em conta que t corresponde ao tempo de incubao, que foi igual a 10 minutos e a [ que ] corresponde concentrao 2 calculada acima, tem-se

Em baixo, apresenta-se a tabela com todos os valores de velocidade inicial calculados para as diferentes concentraes de glcidos redutores num volume igual a 1 mL: Tubo Absorvncia [glcidos redutores] para um volume igual a 1 mL ( ) 0,000 43,45 52,32 53,00 41,34 39,44 65,00 53,38 0,00 869,0 1046,5 1059,2 826,8 788,7 1300,0 1067,6 1 0,000 2 0,617 3 0,743 4 0,752 5 0,587 6 0,560 8 0,923 9 0,758

Para calcular a concentrao de sacarose na mistura reaccional, procedeu-se do seguinte modo (exemplificado para o tubo 2): Para um volume igual a 10 mL, tem-se uma concentrao igual a 0,50 mM,

portanto para se calcular a concentrao existente num volume de 1 mL, faz-se o seguinte clculo:

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Desta forma, em seguida est indicado o quadro com o registo das concentraes de todos os tubos, assim como os valores de velocidades iniciais. Tubo [sacarose] (mM) 1 0,00 2 5,00 3 10,00 52,32 4 15,00 53,00 5 25,00 41,34 6 35,00 39,44 8 65,00 9 53,38

100,00 150,00

0,000 43,45

Com base nestes valores, elaborou-se o seguinte grfico,

Vo em funo da concentrao de sacarose na mistura reaccional

70 60 V0(M min -1) 50 40 30 20 10 0 0 25 50 75 [Sacarose] mM 100 125 150

Grfico 2- Velocidade inicial em funo da concentrao de sacarose no meio reaccional

Observando o grfico anterior verifica-se que, apesar de alguns inconsistncias nos valores, este semelhante a uma hiprbole. Por fim, utilizou-se o mtodo de Hanes para o clculo dos valores de Km e de Vmx. Este mtodo de linearizao consiste na inverso da equao de Michaelis-Menten e multiplicao pela concentrao de substrato, obtendo-se a equao:

[ A] K m 1 [ A] , onde [A] corresponde concentrao de substrato. V0 V V

Desta equao conclui-se que . Tendo em conta todos estes aspectos, elaborou-se o seguinte grfico: e que

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Mtodo de Hanes
3 2.5 2 y = 0.0174x + 0.0765 R = 0.973

[S]/ Vo

1.5 1 0.5 0 0 50 100 [Sacarose] mM 150 200

Decidiu-se usar o mtodo de Hanes por ser aquele que apresenta menos erro em relao aos restantes. De acordo com o que foi dito acima, Km 44,7 mM e Vmx 58,8 M min -1. Os valores na literatura para o Km vo desde 25 a 30 mM. Conclui-se, por isso, que houve erros nas medies porque o valor da constante de Michaelis-Menten experimental ligeiramente superior ao valor terico.

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Bioqumica I Questes a desenvolver

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1- Porque que a soluo de invertase foi preparada em Tampo Tris-HCl (pH=7,5)

0,01M e os ensaios foram realizados usando-se tampo acetato de sdio (pH= 4,5) 0,2M? A invertase e um enzima que catalisa a hidrlise da ligao glicosdica (12) do disido sacarose, originando glucose e frutose .A invertase tem uma elevada actividade no intervalo de pH 3,5-5,5 com um pH ptimo em 4,5. No entanto, pH extremos (bsicos ou cidos) modificam irreversivelmente a estrutura do enzima, desnaturando-o ou modificando a ligao entre o apoenzima (parte no proteica do enzima equivalente aos cofactores orgnicos) e o coenzima (parte proteica do enzima). Por isso, a soluo de invertase foi preparada em tampoTris-HCl (pH 7,5), de modo a obter um enzima estvel e funcional, garantindo a viabilidade durante o estudo do enzima. Caso o enzima tivesse sido preparado em valores de pH diferentes, o enzima poderia no ser vivel e estar desnaturado na altura do ensaio, no catalisando a reaco pretendida. Durante os ensaios usou-se, por isso tampo acetato de sdio a pH 4,5, uma vez que a este valor de pH o enzima revela uma actividade cataltica mais elevada.

2- Como comprovaria que a ocorrncia de uma reaco num homogenato ou extracto

celular era devida aco cataltica de um enzima, presente nesse homogenato, sobre o substrato utilizado? Para comprovar que a ocorrncia de uma reaco num homogenato ou extracto celular era devida aco cataltica de um enzima realizar-se-ia um estudo cintico, traando-se o grfico da velocidade inicial em funo da concentrao de substrato. Se nesse grfico se obtivesse uma hiprbole, concluir-se-ia que a reaco era devida aco cataltica de um enzima que obedece a uma cintica de Michaelis-Menten. No entanto, existem vrios enzimas que no possuem um comportamento Michaeliano e, por isso, seria necessrio recorrer a outra forma de confirmar a existncia de actividade cataltica. Poder-se-ia, ento, efectuar um ensaio com um agente interferente, causando, por exemplo, uma variao significativa de pH e/ou temperatura. Caso se obtivesse um grfico de velocidades iniciais em funo da concentrao de substrato em que a velocidade inicial da reaco tivesse diminudo ou mesmo desaparecido em relao ao ensaio cintico sem agentes interferentes, saber-se-ia que o enzima era responsvel pela actividade cataltica. Os agentes interferentes actuariam como agentes desnaturantes dos enzimas catalticos da reaco, de natureza proteica, perdendo assim a sua actividade devido a alterao das condies experimentais do meio.

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3- Um enzima que apresenta um pH ptimo a 6,8 tem uma actividade muito reduzida a
pH 4,2. Como poderia determinar se esta reduo na actividade resulta de uma ionizao reversvel do substrato e/ou enzima ou causada por uma desnaturao irreversvel do enzima? Os pH extremos (bsicos ou cidos) podem modificar irreversivelmente a estrutura do enzima, destabilizando-o e levando a sua desnaturao, e, consequentemente, impossibilitando o estabelecimento de ligaes enzima-substrato. Para confirmar se a reduo na actividade se deve a uma ionizao reversvel ou irreversvel, poder-se-ia realizar o seguinte ensaio: Realizar-se- ia um ensaio cintico do enzima, a um pH ptimo de 6,8 (ensaio de controlo). E um ensaio cintico do enzima a um pH de 4,2. Em seguida repetir-se ia o segundo ensaio, mantendo o mesmo enzima usado mas alterando o pH ate ao valor ptimo de 6,8. Ao comparar os grficos velocidade inicial/concentrao de substrato, podemos concluir a que se deve a reduo na actividade do enzima:

Se o 3 Ensaio apresentar um grfico semelhante ao controlo, ento a reduo dever-se-ia a

uma ionizao reversvel que foi corrigida com a alterao do pH para um valor ptimo.

Se no 3 ensaio o grfico se manteve igual ao do 2 ensaio, ento a reduo dever-se-ia a

uma desnaturao irreversvel do enzima.

4- Qual a forma geral da curva que representa a dependncia da velocidade de uma

reaco enzimtica com a temperatura do meio? Justifique sucintamente. A temperatura e um factor muito importante na actividade enzimtica, e afecta os diferentes enzimas de maneira diferentes. Cada um possui uma temperatura ptima diferente para a qual a sua actividade cataltica/velocidade de reaco ser mxima. No entanto pode-se obter uma curva geral para a dependncia velocidade de reaco/ temperatura com se v na figura seguinte:

Quando o enzima se encontra a temperaturas abaixo da sua temperatura ptima, um aumento de temperatura (temperatura <temperatura ptima) leva a um aumento da velocidade da reaco, devido ao aumento da energia cintica das molculas envolvidas na reaco. Temperaturas muito inferiores a temperatura ptima, levam a velocidades de reaco muito pequenas, devido a menor existncia de energia cintica no sistema. No entanto, se o enzima se encontra a temperaturas acima da sua temperatura ptima, o aumento da temperatura 17

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(temperatura> temperatura ptima) vai comear a interferir nas ligaes qumicas que mantm a estrutura espacial do enzima, baixando a velocidade de reaco e eventualmente causando a desnaturao do enzima, cessando a sua actividade cataltica.

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2012/2013

Trabalho n6

http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAJiEAJ/cinetica-enzimatica (consultado no dia 15/05/2013 s 18.30 h)

http://www.barreto.uac.pt/bq2_prat/01invertase_introd.pdf (consultado no dia 15/05/2013 s 18.35 h)

Durante a elaborao deste relatrio foi consultado o protocolo experimental.

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