REACCIONES BIOQUIMICAS Y ACCION ENZIMATICA DE LAS BACTERIAS Y FLORA NORMAL (FARINGE, BOCA, OIDO, OJOS Y NARIZ) OBJETIVO GENERAL

Analizar e identificar cada una de las reacciones bioqumicas y enzimticas generadas por los microorganismos y su metabolismo segn el medio en el que son sembradas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS Evaluar el crecimiento y reacciones bioqumicas de las bacterias en Agar sangre y Agar chocolate. Conocer e identificar los diferentes microorganismos presentes en partes de nuestro organismo como la faringe, dientes, encas etc. Realizar la siembra de bacterias en medios de cultivo especficos para pruebas bioqumicas. Aprender a utilizar los implementos del laboratorio para tomar muestras en diferentes partes del cuerpo.

MATERIALES

REACTIVOS

Escobillones esteriles (9) bajalenguas esteriles (9) Papel Kraft Erlenmeyers (2) Microscopio Laminas (8) Cinta de enmascarar Mechero Asa redonda (2) Asa recta (2) Autoclave Incubadora

Caldo Nutritivo Caldo Tioglicolato Agar TSI inclinado en tubo Agar LIA inclinado en tubo SIM en tubo Agar sangre en cajas petri Agar chocolate en cajas petri Agar citrato inclinado en tubo Medio Gelatina en tubo Caldo RMVP en tubo Rojo de Metilo Voges Prosfaur Kovacs Violeta de Gram Lugol de Gram Fucsina de Gram Alcohol Acetona

MARCO TEORICO REACCIONES BIOQUIMICAS Y METABOLISMO PARA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

El metabolismo bacteriano puede dividirse para su mejor entendimiento en tres aspectos diferentes, pero ntimamente ligados: 1. Catabolismo: conjunto de reacciones bioqumicas que conducen a la produccin de energa y poder reductor para la biosintesis. 2. Metabolismo intermedio: conjunto de reacciones de los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos nutrientes son transformados en cidos orgnicos, esteres fosfricos y otros compuestos como aminocidos. 3. Anabolismo: parte del metabolismo implicado en la sntesis de macromolculas (cidos nucledos, protenas, sustancias de reserva y otros) todos reacciones endergnicas. La identificacin definitiva de una especie requiere de unas pruebas bioqumicas, la cual permite conocer las actividades metablicas y enzimticas de los microorganismos. Para identificar los productos finales de los procesos metablicos, se debe conocer: Cambios que se producen Reacciones qumicas que ocurren Enzimas que intervienen Productos intermedios Secuencias de las reacciones bioqumicas

Estas pruebas son aplicadas a medios biolgicos, los cuales conocida su reaccin nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. TSI (Triple Sugar Iron): es un medio nutriente y diferencial que permite el estudio de la capacidad de producir acido y gas a partir de molculas de glucosa, lactosa y sacarosa. Es una prueba especifica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre: Contenido: Extracto de carne y pluripeptona Lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de Carbono fermentables Tiosulfato de sodio: produccin de acido Rojo fenol: indicador Bacterias fermentadoras de la glucosa Bacterias fermentadoras de lactosa Bacterias fermentadoras de lactosa Bactrias aerognicas Bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias organicas que contengan azufre.

Procedimiento: Sembrar en medio

TSI
37C por 24 horas

Incubar

Observar resultados LIA ( Lysine Iron Agar): permite diferenciar los microorganismos descarboxilacion o desanimacin de la lisina. REACCION Azul (alcalino) Rojo Engrecimiento Ruptura del agar Fondo amarillo y tendido purpura Contenidos: Peptona y extracto levadura: nutrientes Glucosa: fermentable Lisina: enzimas descarboxilasa y desaminasa Citrato de hierro, amonio: acido INTERPRETACION Hay movilidad No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila Descarboxilacion de lisina que producen

Procedimiento: Sembrar en medio

LIA
37C por 24- 48 horas

Incubar

Observar resultados

MIO ( Movilidad Indol Ornitina): medio semislido que permite evidenciar la movilidad, la produccin de indol y la descarboxilacion de la ornitina.

Se inocula las cepas del microorganismo en el medio de cultivo por 24 horas a 37C REACCION Enturbamiento del agar INTERPRETACION Hay movilidad

Agar transparente de desarrollo solo en picada Azul (alcalino) Coloracin amarilla (acido) Rojo (anillos) Amarillo (anillos) Contenido:

No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila Indol (+) Indol (-)

Dextrosa: hidrato de carbono fermentable Orinitina: enzima orinitina descarboxilasa Indicador: purpura de bromocresol

CITRATO: Permite evidenciar el uso de citrato por parte de la bacteria , como nica fuente de Carbono, mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio.

Procedimiento: Sembrar en medio

Citrato
37C por 24,48, 72 horas

Incubar

Observar resultados

UREA permite identificar si la bacteria tiene la enzima ureasa que hidroliza la urea y produce amoniaco. Positivo (rojo o rosado,alcalino), Negativo (color amarillo, acido).

Contenido: Caldo amarillo Rojo fenol: indicador Peptonas Carbohidratos como fuente de carbono INDOL Es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo. El medio de cultivo utilizado debe ser rico entriptofano.

Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

MEDIO CITRATO UREA INDOL LIA (LISINA DESCARBOXILASA) MIO ( MANITOL MOVILIDAD)

TSI

INCUBACION 35 37 c 18 24 Hr 35 37 c 24 HORAS MEDIO LIQUIDO 35 37 c 24 HORAS (2) MEDIO LIQUIDO 35 37 c 24 HORAS (3) SEMISOLIDO O 35 37 c PICADURA 24 HORAS PICADURA Y 35 37 c ESTRIA 24 HORAS Lactosa Sacarosa Glucosa SH2

SIEMBRA PICADURA Y ESTRIA ESTRIA

LECTURA + AZUL ROSA ANILLO ROSA PURPURA AMARILLO Difusin

LECTURA VERDE CREMA ANILLO AMARILLO AMARILLO ROJO No Difusin

AMARILLO AMARILLO BURBUJAS

ROJO ROJO NO BURBUJAS

Existen diversas bacterias que viven con nosotros y que representan la flora normal del ser humano, aqu presentamos un cuadro con las bacterias ms frecuentemente encontradas en los cultivos de diferentes regiones del cuerpo y que deben ser consideradas flora normal.

BACTERIAS CONSIDERADAS FLORA NORMAL DE HUMANOS Y SU LOCALIZACION ANATOMICA.

BACTERIAS Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus mitis Streptococcus salivarius Streptococcus mutans Streptococcus faecalis Streptococcus pneumoniae +/+/Piel Conjuntiva Nariz Faringe Boca Intestino Grueso + ++ +/Uretra Vagina

++ + -

+ +/-

++ + -

+ + + ++ + +/+

++ + ++ ++ ++ + +

++ +/+

+ + +

++

+ +/-

Streptococcus pyogenes Neisseriae Neisseria meningitidis Veillonellae B. Coliformes (E. coli) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Bacteroides Espiroquetas Lactobacilos Clostridios Clostridium tetani Corinebacterias Micobacterias Actinomicetos Micoplasmas

+/-

+/+ + +

+ ++ +

+ + ++ +

+/+

+ + +

+/++ + + + + +/+ +

+/+/-

+/+

+/+ +/-

+ + +/-

+/-

+ + + +

+ + + ++ +/++ + + ++ +/++ + +/-

++ +

++ +/-

+ +/+ +

+ +

+ +

+ + + +/+

++ = ms frecuente; + = comn; +/- = iregular, ocasional o transitorio.

PROCEDIMEINTO SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES: SIM, LIA, TSI Y GELATINA A partir de cepas cultivadas en CN (una en caja de petri y otra en Tubo inclinado por separado se sembr as: Por puncin en SIM y GELATINA con asa recta Por puncin y espiral en TSI y LIA con asa recta Con asa redonda en RMVP

Fig 1. Medios de cultivo SIM, TSI, LIA y GELATINA; de izq. a der.

RESULTADOS TSI (TRIPLE SUGAR IRON) CEPA CAJA DE PETRI CEPA TUBO INCLINADO

FIG. 1 ANALISIS DE RESULTADOS LACTOSA (-) GLUCOSA (+) H2S (-) Hubo crecimiento de la bacteria en este medio de cultivo debido a las propiedades nutricionales que brinda el TSI, pero el resultado negativo para la lactosa determinado por el color rojo del medio, indica que la bacteria cultivada no fermenta la lactosa. No hubo formacin de acido sulfhdrico y no se observo desprendimiento de gas o ruptura del medio.

FIG. 2

LACTOSA (+) GLUCOSA (+) H2S (-) Hubo un gran crecimiento de la cepa, siendo ms visible la poblacin en comparacin a la cepa obtenida de la caja de petri. La coloracin amarilla tanto en el fondo como en la superficie indica que el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa (1). Observamos la presencia de burbujas y ruptura del medio de cultivo, lo cual indica que el microorganismo sembrado produce CO2 como producto de la fermentacin. No hubo formacin de acido sulfhdrico.

Segn lo consultado en la teora las bacterias que se cultivaron pertenecen a la familia de las enterobacterias ya que son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa).

LIA (LYSINE IRON AGAR) CEPA CAJA DE PETRI CEPA TUBO INCLINADO

Formacin de burbujas en la pared del tubo Coloracin levemente amarilla en el fondo del tubo

Coloracin morada ms intensa Fig. 1 Fig: 2 ANALISIS DE RESULTADOS (+) DESCARBOXILACIN DE LA LISINA (-) H2S Esta cepa nos mostro un resultado positivo para la descarboxilacin de la lisina, esto nos confirma que la bacteria cultivada tiene la enzima descarboxilasa, debido a la alcalinidad, el pH se modifica y en el fondo se observa una tonalidad morada o violeta.(2) Fig. 3

(-) DESCARBOXILACIN DE LA LISINA (-) H2S Se observa en el fondo una coloracin amarilla y la superficie permanece del color del medio, lo cual nos indica que solo hay fermentacin de glucosa, lo que tambin produce el gas observado en las paredes del tubo. La bacteria no tiene la enzima descarboxilasa.

SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD) CEPA CAJA DE PETRI CEPA TUBO INCLINADO Motilidad

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3 ANALISIS DE RESULTADOS

Fig. 4

Fig. 5

(-) INDOL (-) INDOL (-) MOTILIDAD (+) MOTILIDAD El crecimiento de la bacteria solo se dio en la El crecimiento y la motilidad de la bacteria en puncin de la inoculacin, no se observa este cultivo se puede observar claramente en la turbidez, lo que indica que no hay motilidad o turbidez y en un desplazamiento hacia las

que la bacteria no tiene flagelo. La formacin paredes del tubo y por fuera de la puncin de de un anillo amarillo por el reactivo de Kovacs inoculacin. La formacin de un anillo amarillo representa que no hubo formacin de Indol. por el reactivo de Kovacs indica que no hubo formacin de Indol.

GELATINA CEPA CAJA DE PETRI CEPA TUBO INCLINADO

ANALISIS DE RESULTADOS (+) HIDRLISIS La hidrlisis observada en los medios de cultivo de las dos cepas, es debida a la presencia de enzimas hidroliticas (gelatinasa) en la bacteria las cuales hacen que la gelatina pase a ser liquida completamente. (3)

RMVP (ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER) CEPA CAJA DE PETRI CEPA TUBO INCLINADO

ANALISIS DE RESULTADOS (+) ROJO DE METILO (-) VOGES PROSKAUER Esta bacteria nos muestra como resultado que Se observa la aparicin de un color rosado en la no hay presencia de acido mixto ya que la superficie del medio lo cual constituye una coloracin obtenida en la parte superior del reaccin positiva indicadora de la presencia de (-) ROJO DE METILO

medio es amarilla

acido mixto, producto de la fermentacin de la glucosa.(4) La prueba para Voges Proskauer se determino negativa ya que al agregar las 6 gotas de anaftol y el KOH no se observo coloracin roja. Esto indica que no se presento la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo.

Muestra SIM * ANALISIS DE RESULTADOS INDOL (-) MOTILIDAD (+) La bacteria ya cultivada presenta un buen crecimiento de la poblacin, motilidad observada gracias a turbidez en el medio y suspensin en la superficie del mismo. Al agregar el reactivo de KOVACS (3 gotas) la coloracin del anillo es amarilla, lo que confirma que no hay formacin de Indol.

FLORA NORMAL AGAR CHOCOLATE (FARINGE)

FIG. 1

FIG. 2 ANALISIS DE RESULTADOS

FIG.3

Las bacterias inoculadas de la faringe mostradas en las imgenes 2 y 3 en agar chocolate no muestran mayor crecimiento debido a la poca cantidad de muestra obtenida en el hisopo, en la fig. 1 la poblacin bacteriana es mayor ya que el frotis fue bueno y presenta hemolisis alfa igualmente ms visible que en las cepas cultivadas en las figuras 2 y 3.

Las bacterias que forman la flora normal de la faringe y que posiblemente crecieron en los medios de agar chocolate son principalmente: Streptococcus y b hemolticos, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, son bacterias en forma de coco grampositivas producen catalasa y son aerobios facultativos (5). Lo que se observa morfolgicamente es que son colonias pequeas, blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa. Con certeza no conocemos cuales crecieron especficamente en el medio, pero segn lo consultado en la teora morfolgicamente si cumplen con los resultados obtenidos en la prctica.

Al observar en el microscopio el frotis de faringe con objetivo de 100X Encontramos clulas epiteliales, pero no se pudo visualizar con claridad las bacterias debido a la deficiencia de la siembra.

100X frotis de faringe

AGAR SANGRE (FARINGE, CABELLO Y CUELLO)

Siembra en espiral: CUELLO

Siembra en espiral: CUERO CABELLUDO FIG. 1 Siembra en espiral: PABELLON OREJA

Siembra de aislamiento: FARINGE

Siembra en espiral: DIENTES

FIG. 2

Siembra en espiral: PALMA DE LA MANO

Siembra de aislamiento: FARINGE

Siembra en espiral: ENCIAS

FIG. 3

ANALISIS DE RESULTADOS FARINGE: (+) HEMOLISIS ALFA ENCIAS: (+) HEMOLISIS ALFA DIENTES: (+) HEMOLISIS ALFA FIG. 1: El mayor crecimiento de bacterias en esta caja de petri se observa en la siembra de aislamiento de faringe, morfolgicamente son visibles colonias blancuzcas, con forma de cocos y alfa hemolticas (coloracin verdosa). En la siembra en espiral con frotis de cuello, no se observa crecimiento bacteriano posiblemente porque es un lugar del cuerpo muy seco o tal vez por la falta de muestra, o la inadecuada incubacin, sin embargo puede contener la flora normal de la piel: staphylococcus epidermis, staphylococcus aureus, corinebacterias etc. lo que tambin sucedi en la siembra de cuero cabelludo, el crecimiento de microorganismos fue muy escaso. FIG. 2: los microorganismos ms visibles se encuentran en la siembra de aislamiento de faringe y en la siembra en espiral de frotis de dientes, la composicin de bacterias hospedadas en los dientes pueden ser: Streptrococcus alfa- hemolticos, (observada en el medio por su coloracin verdosa), streptococcus mutans, streptococcus sanguis, lactobacyllos etc. (4) En la siembra del pabelln de la oreja el crecimiento fue escaso. Puede contener la flora habitual de la piel FIG. 3: el crecimiento de bacterias hospedadas en las encas es muy visible, la alfa- hemolisis se ve ntidamente. Por ser un lugar hmedo es un habitat natural para bacterias aerobias y anaerobias tales como: Campylobacter sputorum, staphylococcus epidermis, streptococcus mitis, streptococcus salivarius, bacteroides etc.

CONCLUSIONES Se aprendi que cada medio de cultivo diferencial contiene un sustrato: TSI (lactosa, sacarosa, glucosa) LIA (lisina) SIM (peptona) que hace posible ver los cambios fsicos como prueba de las reacciones bioqumicas y acciones enzimticas. Se determino que en el medio de cultivo TSI el resultado es positivo para la fermentacin de lactosa y glucosa si la coloracin del medio es amarilla, si por el contrario, es roja el resultado se da como negativo.

Comprobamos que gracias a la coloracin violeta ms intensa del medio de cultivo LIA se puede corroborar la descarboxilacin de la lisina que realiza la bacteria; si la tonalidad es amarilla el resultado se da como negativo. Se determino que en el medio de cultivo SIM la cepa de la caja de petri no cuenta con flagelo y la del tubo inclinado si, esto se confirmo por el desplazamiento y turbidez vistas en los tubos. Confirmamos la hidrlisis realizada por las dos cepas inoculadas, debido a la licuacin observada en la gelatina. Comprobamos la hemolisis alfa provocada por algunas de las bacterias cultivadas en el agar chocolate, encontradas en la flora normal de la faringe. Analizamos que en zonas del cuerpo como el cuello y la palma de la mano no se encontraron bacterias por ser lugares ms secos, a pesar de que se pueden encontrar bacterias de la flora bacteriana normal de la piel. Logramos observar la hemolisis alfa, una de las principales reacciones bioqumicas en las cepas cultivadas en el agar sangre. El resultado positivo para rojo de metilo que determina la formacin de Indol, en una de las cepas cultivadas se logro determinar por la coloracin rosa en la superficie del cultivo. Reconocimos y observamos la flora bacteriana normal de la faringe, los dientes y las encas.

BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm http://www.dibico.com/fichast/1015.pdf http://www.slideshare.net/rocartoom7/pruebas-bioquimicas-formal http://www.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-5-pruebas-bioqumicas8146300 5. http://es.scribd.com/doc/50402732/PRUEBAS-BIOQUIMICAS-DE-IDENTIFICACIONBACTERIANA-26-pp

6. http://www.docstoc.com/docs/121213230/Baterias-bioquimicas-y-medios-de-cultivo 7. http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/files/0e8a6919-7eeb423f-9fa8-b9c866aab3ff/Identificaci%C3%B3n%20Bacteriana.pdf
8. http://www.slideshare.net/rocartoom7/estudio-de-las-especies-bacterianaspa-copiarr-vale 9. http://www.mama.com.mx/pediatria/13-articulos-de-pediatria/114-flora-bacteriana-normal 10. http://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/EXUDADO+FAR%C3%8DNGEO

INFORME N 4 MICROBIOLOGIA: REACCIONES BIOQUIMICAS Y ACCION ENZIMATICA DE LAS BACTERIAS Y FLORA NORMAL (FARINGE, BOCA, OIDO, OJOS Y NARIZ)

TATIANA MORENO NATALIA ROMERO ADRIANA USECHE

CORPORACION TECNOLOGICA DE BOGOTA TECNOLOGIA EN QUIMICA INDUSTRIAL MICROBIOLOGIA V SEMESTRE BOGOTA 2013