LABORATORIO DE BIOQUIMICA SEPARACION Y CUANTIFICACION DE UNA FRACCION PROTEICA POR EL METODO DE BRADFORD PRACTICA N 3

MARCEL YEPEZ CC. 1128438648 GUILLERMO CARMONA CC. 16079507

Profesor Francisco Pea

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUIMICA FARMACEUTICA MEDELLN ANTIOQUIA 4 DE MARZO DE 2011

I. MARCO TERICO El mtodo de Bradford, es otro mtodo usado que tiene las mismas aplicaciones que el de Lowry, utiliza un reactivo, llamado reactivo de Bradford, que al entrar en contacto con protenas se reduce, virando su color del amarillento al azul intenso. Las muestras son ledas a 595nm y con estos datos se realiza la curva de calibracin. El contenido protenico de una clula se estima para consistir en millares de diversos tipos de protenas con un rango dinmico de la expresin. La tecnologa que se est utilizando actualmente implica la extraccin de los componentes de protena, fraccionamiento de esta mezcla muy compleja, protelisis enzimtica de cada especie separada y aislada, anlisis espectromtrico total extenso y finalmente corresponder con los datos estructurales generados contra una base de datos de protenas sabidas o de productos anticipados de la expresin del genoma. Este procedimiento implica un paso inicial usando 1 - o la electroforesis de 2

dimensiones (DE):

Usando 1-DE, las protenas se separan en base de masa molecular; la tcnica es reproductiva y se puede utilizar para las protenas en el rango total del kDa 10-300, pero ha limitado la resolucin. Para la separacin de mezclas ms complejas de la protena, 2-DE es el mtodo preferido. Esto implica el separar de las protenas primero segn su carga neta por un paso de progresin de la concentracin isoelctrica y entonces, en la segunda dimensin, segn su masa molecular que emplea la electroforesis dodecyl del gel de la sulfato-poliacrilamida del sodio (SDS-PAGE) que da un alto coeficiente de la separacin. La espectrometra total (ms) es el mtodo de opcin para la identificacin de las protenas separadas, y de la espectrometra de 2-DE y total ahora represente una tecnologa por la cual vario mil protenas se puedan separar, detectar e identificar en una manera automatizada.

La metodologa de Proteomics es hecha inicialmente por la separacin y la localizacin de la protena por 2-DE seguido por la supresin de las protenas del inters que entonces experimentan la digestin proteoltica para rendir una mezcla de fragmentos del pptido. Los pptidos son analizados por espectrometra total, inicialmente usando MALDI-MS para la determinacin de la masa molecular y la generacin de una huella digital de la masa del pptido. Si la base de datos que busca en esta etapa rinde resultados ambiguos, un anlisis espectromtrico de la segunda masa, ESI-MS/MS, se utiliza para generar la informacin de la secuencia que se utiliza para una bsqueda ms rigurosa de la base de datos. Del espectro total obtenido en el anlisis de la mezcla del resumen de la protena, la

correspondencia de la masa del pptido o la huella digital total del pptido es decir las masas moleculares de los fragmentos del pptido, puede ser comprobada. A menudo, si la secuencia de aminocido es suficientemente nica y la masa la exactitud justamente arriba, la correspondencia total se puede utilizar para buscar bases de datos 12-15 para identificar la protena con xito sin la necesidad de otros anlisis. Si, sin embargo, la bsqueda de la base de datos lleva a los resultados ambiguos, despus anlisis futuros del ms, implicando el uso de la espectrometra total en tndem (MS/MS), se emprenden secuencialmente en cada pptido en la mezcla para generar una secuencia, o la secuencia parcial, conocida como etiqueta de la secuencia, para estos pptidos. Esto es alcanzada con frecuencia por el uso de ESI-MS/MS19 y un paso de progresin adicional de la purificacin se debe realizar generalmente para separar los pptidos de las sales y de los detergentes que pueden ser presente que causan la atenuacin de la seal del pptido.

II. DIAGRAMA DE FLUJO III. Aadiendo las cantidades citadas en la tabla siguiente; se sigue el diagrama en la practica
CONCENTRACION de la sln (U/ml ) 2000 1000 500 250 125 65 32.5 16.5 SLN. SALINA 0.85% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Hallada en el grafico: PROTEINA ESTANDARD 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 BLANCO 10 Muestra Problema general 11 Muestra Problema Particular

5 ml

Muestra= 1 ml

Hallada en el grafico:

5 ml

Muestra= 1 ml

Luego cada uno de los tubos se diluyo ms: 0.6 microlitros + 300 microlitros NaOH .

 Se preparo una solucin del reactivo: 30 microlitros de la sln A + 300 microlitros de la sln B + 300 microlitros sln C Solucin A: Na2CO3 en agua destilada 2% (p/v). Solucin B: CuSO4.5H2O en agua destilada 1% (p/v). Solucin C: Tartrato de sodio y potasio en agua destilada 2% (p/v).

FUNDAMENTO: En EL METOTODO DE LOUWRY se usa un reactivo llamado Reactivo de FOLIN-CIOCALTEU, creado en el proceso con Na2CO3, CuSO4.5H2O y Tartrato de sodio y potasio en agua destilada (2%, 1%, 2% respectivamente) ; el se combina con la rxn de Biuret, y se reduce , debido principalmente a la tirosina, el triptfano y en menor grado a la cistena y la histidina.

Se usaron aprox 11 tubos de ensayo, inicialmente

Para esto se usan los reactivos: Reactivo de FOLIN-CIOCALTEU Sln Patrn: Solucin de albmina 4mg/mL en NaCl 0.9% (p/v). Sln complejante: se prepara justo antes de usar mezclando las soluciones A:B:C cada una en una proporcin 100:1:1 respectivamente. Se aaden 2 ml de solucin de hidrxido de sodio al 20%. NaOH 2N A 2 ml de la Sln Patron Llevar a 100C por 10 minutos apror

Todo esto para realizar la curva de calibracin basada en los estandares.

Agreguamos 0.2 mL del reactivo de FOLIN, inmediatamente agite y deje en reposos por 30 minutos en la oscuridad.

Se Llevo a temperatura ambiente y luego se adiciona 2 mL de solucin complejante recientemente preparada. Se Agita y dejamos reposar por 10 minutos.

El Hidrxido de Sodio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino ne cesario para que tenga lugar.

Este reactivo no slo mide los fenoles totales, sino que reaccionar con cualquier sustancia reductora

Por ultimo este mtodo permite: Determinar la concentracin de protenas de una muestra mediante espectroscopia ultravioletavisible a una longitud de onda de 750nm Si la concentracin de protena es menor de 500 mcg / mL. A 550 nm si la Concentracin est entre 1000 y 2000 mcg/mL

IV. CALCULOS Y RESULTADOS

V. TABLAS DE DATOS
% TRANSMITANCIA 88 39 60 55 86 94 93 92 34 71 ABSORBANCIA A 585 nm 0,055517328 0,408935393 0,22184875 0,259637311 0,065501549 0,026872146 0,031517051 0,036212173 0,468521083 0,148741651

# TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 MPG MPP

CONCENTRACION 2000 1000 500 250 125 65 32,5 16,5 Por interpolacion: se sale del rango de datos Por interpolacion: 513

VI. DISCUSIN El reactivo de FOLIN-CIOCALTEU; no slo mide los fenoles totales, sino que reaccionar con cualquier sustancia reductora. En consecuencia, el reactivo mide la capacidad reductora total de una muestra, no slo el nivel de compuestos fenlicos. Este reactivo forma parte del ensayo de protenas de Lowry, y tambin reaccionar con algunos compuestos que contienen nitrgeno, como la hidroxilamina y la guanidina.3

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Vctor W. Rodwell: Harper. Bioqumica Ilustrada Betty Lucy Lpez Osorio: Notas del Curso; Fundamentos de Anlisis Instrumental http://www.molecularstation.com/es/proteomics/protein-identification/