Вы находитесь на странице: 1из 0

Fluorescent in situ Hybridization

Hibridacin in situ
Desarrollada por Pardue & Gall (1969)
-Muy pocas secuencias de DNA disponibles
-Radioistopos
Alto entrenamiento
Seguridad
Tiempo
Hibridacin in situ Fluorescente
Pinkel & Gray (1984)
Deteccin de secuencia blanco por fluorescencia
Mtodo rpido
Discriminativo
Inofensivo
Relativamente fcil
Historia
Historia
37C
95C
Fundamentos
Desnaturalizacin
Desnaturalizacin de la sonda
Desnaturalizacin del DNA Cromosmico
Hibridacin Sonda-DNA Cromosmico
Metodologa
Metodologa
Hibridacin in situ Fluorescente
FISH (Clsico)
Multicolor Karyotyping
Spectral Karyotyping
Multicolor banding FISH
Fiber FISH
Q-FISH
Flow-FISH
Chromosome combing
Padlock FISH
CGH
Array-CGH
etc.!!
Sondas
Fragmentos de DNA homlogos a la secuencia
blanco, marcados con una molcula detectable
directamente o mediante una reaccin
inmunoqumica
Estos fragmentos deben cubrir una regin de por lo
menos 70 kb para poder ser detectados al microscopio.
Definicin
Sondas
Sondas
Sondas:
Sondas gen-especficas:
Sondas regin especficas:
Sondas de pintado cromosmico total:
Hibridacin in situ Fluorescente en
diagnstico oncolgico
Citogentica Molecular
Citogentica Clsica Gentica Molecular
Gentica Clnica
Anlisis de Metafases
Translocaciones
Cromosomas Marcadores
Inversiones (pericntricas)
Anomalas numricas
Microdeleciones
Anlisis de Metafases
Citogentica de interfase
Diversidad de sondas especficas (proyecto
genoma)
Simplificacin de protocolos
Disminucin del tiempo de anlisis
Mejora notable en los mtodos de
marcado de sondas
Mejora en los sistemas de tomas de
imgenes y softare
!nformacin valiosa
en n"cleos
interfsicos
FISH en interfases
HERRAMIENTA CL
HERRAMIENTA CL

NICA
NICA
Citogentica de interfase
Algunos usos especficos
Estudio de mosaicismos
Clulas tumorales
Muestras pequeas
Clulas inactivas
FISH en interfases
Se obtiene informacin de una gran variedad de muestras
Permite obtener informacin especfica en muestras
pequeas
Independiente de la presencia de clulas metablicamente
activas
Sujeto a variaciones tcnicas importantes
Debido a:
Calidad de la sonda
Calidad de la fijacin
Background
Reactivos de deteccin
Interpretacin de las seales
Especificidad de la sonda
Temperatura de desnaturalizacin
Variabilidad entre reacciones
Es necesario establecer criterios propios
Dise
Dise

o de sondas
o de sondas
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3B PPM1F
22qter
(C+)
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3B PPM1F
22qter
(C+)
Cent.
HIRA (Tuple1) TOP3B PPM1F
22qter
(C+)
Para aplicacin en Oncologa
Dise Dise o de sondas o de sondas
Para aplicacin en Oncologa
Dise Dise o de sondas o de sondas
Sondas Locus especficas
Sondas Break Apart
Sondas Doble fusin
Sondas Tumores slidos
Sondas Oncolgicas
Locus Especficas
17p13.1 (TP53)
Izq, Normal. Der, P53-
Isocromosoma 17q
150Kb
17p13.1
17q25.3
SHBG
FXR2
SAT2
TP53
(20Kb)
WDR79
EFNB3
DYH2
Sondas Oncolgicas
Locus Especficas
1p36 (TP73)
1p36.32
150Kb
TP73
Control
1q44
Sondas Oncolgicas
Locus Especficas
5q15-q31 (SHGC85191/EGR1)
SHGC85191
Control
5q11.2
EGR1
Her 2/neu (erb2) Es un oncogen que se encuentra en la
clula normal en dos copias nicamente
Her 2/neu
Enumeracin 17 (17p11.2) (C+)
CANCER DE MAMA:
Distintos mecanismos pueden llevar a la amplificacin de este gen,
desencadenando la enfermedad.
Sondas Oncolgicas
Tumores slidos
Microtomo Microtomo
Tacos de Tacos de parafina parafina
Cortes de Cortes de
4 4- -6 6
Se Se al al al al microscopio microscopio
Procesado:
Sondas Oncolgicas
Tumores slidos
Celula normal: dos copias de Her 2/neu
dos seales verdes representan dos cromosomas 17
dos seales rojas representan dos copias del oncogen
Celulas con amplificaciones
Las seales verdes representan los
cromosomas 17, las seales rojas
representan del oncogen amplificado
Sondas Oncolgicas
Tumores slidos
Clulas normales Clulas anormales
Sondas Oncolgicas
Tumores slidos
Translocacin BCR-ABL
Dise Dise o de sondas o de sondas
Cromosoma Philadelphia en Leucemia Mieloide Crnica
95 % de los pacientes tiene esta fusin
Su presencia activa una tirosina kinasa requerida
para su funcin transformante
La evolucin es seguida a travs del porcentaje de
clulas con cr. Phi en sangre
El mtodo ms apropiado para esto es FISH
Dise Dise o de sondas o de sondas
Porqu FISH ?
Los mtodos moleculares (PCR) dan la respuesta: SI NO
FISH: respuesta cuantitativa (%)
Los mtodos moleculares (PCR) pueden contaminarse
con falsos positivos
FISH: no es pasible de contaminacin intermuestras
Translocacin BCR-ABL
Dise Dise o de sondas o de sondas
Translocacin BCR-ABL
(Sonda Fusin Simple)
BCR-ABL +
BCR
Crom. 22
140Kb
350Kb
ABL
Crom. 9
52Kb
421Kb
BCR-ABL -
Falsos positivos
5-13%
BCR-ABL +
Translocacin BCR-ABL
(Sonda Doble Fusin)
BCR
Crom. 22
140Kb
1300Kb
ABL
Crom. 9
52Kb
876Kb
BCR-ABL -
Falsos positivos
0.5%
Sondas de Doble Fusin
MLL
(myeloid/lymphoid or mixed leukemia)
Dise Dise o de sondas o de sondas
MLL
(myeloid/lymphoid or mixed leukemia)
(Sonda Break apart)
Crom. 11
MLL
MLL normal
MLL translocado
Sondas Break Apart
Simple de aplicar
Resultados obtenidos en corto tiempo
Fcil de interpretar
Funciona en casi cualquier clula o tejido
Herramienta en investigacin
Herramienta diagnstica
Conclusiones Finales
MUCHAS GRACIAS
alaudicina@lexelmedical.com

Вам также может понравиться