MARCO TEORICO

ENZIMA
Una enzima es una protena con propiedades catalticas, elaborada por la clula, susceptible de ser regulada y que adems presenta, como veremos ms adelante, un alto grado de especificidad. Como todo catalizador, aceleran notablemente la velocidad de una reaccin qumica y cumple con las siguientes condiciones: a) Son efectivas en cantidades pequeas b) No sufren modificaciones ni cualitativas ni cuantitativas al final de la reaccin. Es decir deben quedar qumicamente inalteradas. c) No afectan la posicin de la reaccin que catalizan. Es decir se llega mucho ms rpidamente al equilibrio, pero el mismo es igual al que se llegara en ausencia del catalizador. Pero adems de cumplir estas condiciones propias de todos los catalizadores, las enzimas presentan una serie de caractersticas, derivadas de su naturaleza proteica que las diferencia netamente de los catalizadores inorgnicos: a) Son termolbiles b) Presentan una mayor eficiencia. Entendiendo por eficiencia en este caso al nmero de moles de sustrato transformado por mol de catalizador en la unidad de tiempo c) Presentan alta especificidad en relacin a la naturaleza de la reaccin que catalizan y al sustrato que utilizan. d) Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares.

ESTRUCTURA DE LOS ENZIMAS: EL CENTRO ACTIVO Los enzimas, en cuanto que protenas, presentan todos los rasgos estructurales y propiedades qumicas que caracterizan a esta notable clase de biomolecular. En efecto, se ha podido comprobar que los enzimas pierden su actividad cataltica cuando sufren desnaturalizacin por efecto de los mismos agentes que afectan a las dems protenas; la conformacin tridimensional nativa intacta de la protena enzimtica resulta indispensable para que sta desempee su funcin. Adems, los enzimas, al igual que otras muchas clases de protenas, presentan un centro activo a travs del cual interactan con la(s) molcula(s) de ligando, que en este caso recibe(n) el nombre de sustrato(s), mediante un acoplamiento espacial (las superficies moleculares de ambos tienen formas complementarias) y qumico (grupos funcionales complementarios del enzima y el (los) sustrato(s) establecen diferentes tipos de interacciones dbiles entre s). Tanto la actividad cataltica como el elevado grado de especificidad qumica que

presentan los enzimas residen en esta interaccin especfica entre el enzima y su sustrato. El centro activo es una cavidad existente en la superficie del enzima que est forrada interiormente por una serie de restos de aminocidos.

Por regla general los aminocidos que forman parte del centro activo no se encuentran contiguos en la cadena polipeptdica, sino ocupando posiciones a veces muy alejadas en la misma. El hecho de que estos aminocidos coincidan prximos entre s sobre el centro activo no es ms que una consecuencia del plegamiento caracterstico de la cadena polipeptdica, es decir, de la conformacin tridimensional nativa de la protena enzimtica. Puede resultar til, aunque no siempre posible, distinguir entre los aminocidos que forman parte del centro activo dos categoras: 1. Aminocidos catalticos.- Son uno o ms aminocidos cuyas cadenas laterales R poseen unas peculiaridades qumicas tales que los facultan para desarrollar una funcin cataltica. Constituyen el verdadero centro cataltico del enzima. 2. Aminocidos de unin.- Son una serie de aminocidos cuyas cadenas laterales R poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones dbiles (puentes de hidrgeno, interacciones inicas, etc.) con grupos funcionales complementarios de la molcula de sustrato. Su funcin consiste en fijar la molcula de sustrato al centro activo en la posicin adecuada para que los aminocidos catalticos puedan actuar.

En cuanto al resto de los aminocidos de la cadena polipeptdica del enzima, los que no forman parte del centro activo, podra pensarse en principio que no desempean ninguna funcin, pero esto no es cierto; tienen la importante misin de mantener la conformacin tridimensional catalticamente activa del enzima; sin ella no existira centro activo y el enzima no podra interactuar con su sustrato.
CINTICA ENZIMTICA: EL COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO Los enzimas actan de acuerdo con los mismos principios generales que los dems catalizadores: aumentan la velocidad de las reacciones qumicas combinndose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan un estado de transicin con una energa de activacin menor que el de la reaccin no catalizada. Hay que destacar sin embargo que los enzimas son mucho ms eficaces que cualquier

catalizador artificial conocido. Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que producen son de entre 107 y 1014 veces la velocidad de la reaccin no catalizada. La actividad molecular (nmero de molculas de sustrato transformadas por una sola molcula de enzima por minuto) de distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de molculas de sustrato por minuto. Cabe preguntarse pues, cmo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la velocidad de las reacciones qumicas que catalizan.

Los mtodos experimentales para conocer la actividad cataltica de los enzimas son cada vez ms complejos y sofisticados. Sin embargo, el mtodo ms antiguo utilizado en enzimologa, desarrollado por Leonor Michaelis y Maud Menten (Figura 14.3), y que en la actualidad sigue siendo de gran utilidad, consiste en analizar como vara la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente en funcin de algunos parmetros experimentales como la concentracin del sustrato o la del propio enzima, lo que globalmente se conoce con el nombre de cintica enzimtica.

FUENTE: HENRI, V. (1903) Lois gnrales de laction des diastases, Hermann, Paris.

La cintica de las reacciones catalizadas por enzimas muestra un rasgo caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin del enzima por el sustrato. Cuando se mide la velocidad inicial de una reaccin catalizada enzimticamente se observa que para concentraciones de sustrato bajas la velocidad de reaccin es proporcional a dicha concentracin, como ocurre con carcter general para las reacciones no enzimticas. A medida que la concentracin de sustrato aumenta la velocidad de reaccin deja de ser proporcional a sta. Con un aumento posterior la velocidad de reaccin llega a ser totalmente independiente de la concentracin del sustrato y se aproxima asimptticamente a un valor mximo que es caracterstico de cada enzima y que se conoce como velocidad mxima. Se dice entonces que el enzima se halla saturado por el sustrato. La concentracin de sustrato a la cual la reaccin alcanza la mitad de su velocidad mxima se conoce con el nombre de KM (constante de Michaelis-Menten). KM es un valor caracterstico de cada enzima y constituye una

medida de la afinidad del enzima por el sustrato: valores bajos de KM indican una alta afinidad mientras que valores altos representan una baja afinidad. El efecto de saturacin del enzima por el sustrato condujo a los primeros investigadores de la cintica enzimtica, incluso antes de que se conociera la naturaleza proteica de los enzimas, a formular la hiptesis, hoy corroborada, de que el enzima y el sustrato se combinan de modo transitorio para formar un complejo enzima-sustrato en el que se alcanza el estado de transicin con mayor probabilidad que en la reaccin no catalizada. Una vez alcanzado dicho estado el complejo enzima-sustrato se descompone para dar lugar a los productos y el enzima libre segn se refleja en la siguiente ecuacin:

El enzima, una vez liberado, puede combinarse con una nueva molcula de sustrato para formar un nuevo complejo enzima-sustrato cerrndose as el ciclo cataltico del enzima. De este modo, una sola molcula de enzima puede transformar en producto, en sucesivos ciclos catalticos, a un elevado nmero de molculas de sustrato, lo que contribuira a explicar la gran eficacia cataltica que exhiben estas biomolculas.

FUENTE: HENRI, V. (1903) Lois gnrales de laction des diastases, Hermann, Paris.

La hiptesis del complejo enzima-sustrato explica de modo satisfactorio el efecto de saturacin del enzima por el sustrato observado en los estudios de cintica enzimtica: cuando la concentracin de sustrato es muy superior a la concentracin del enzima en el medio de reaccin, todos los centros activos de las molculas de enzima se hallan ocupados en un momento dado por molculas de sustrato, con lo que aumentos posteriores de la concentracin de ste no se traducen en aumentos en la velocidad de reaccin.

POR QU LAS ENZIMAS SON CATALIZADORES TAN EFICACES? Una reaccin qumica en la que, a partir de unas molculas se obtiene unos productos diferentes, siempre implica una redistribucin de enlaces. La organizacin de los tomos que componen los reactivos es distinta de la de los productos y en las molculas, los tomos se unen entre s mediante enlaces. Cuando, por ejemplo, representamos una reaccin como A B C D, estamos indicando implcitamente un balance de materia, es decir, que los tomos presentes en A y B se encuentran tambin en C y D, aunque, evidentemente, estn distribuidos de forma diferente. La figura 1 representa esquemticamente esa idea.

FUENTE: HENRI, V. (1903) Lois gnrales de laction des diastases, Hermann, Paris.

Una reaccin qumica puede considerarse tanto desde una perspectiva termodinmica como desde un punto de vista cintico. En el primer caso, lo ms inmediato es indicar el cambio de energa libre que se produce al transcurrir la reaccin. Por ejemplo, si la reaccin A B C D transcurre en condiciones estndar, la variacin de energa libre es G. Evidentemente, el valor de esta magnitud no representa la variacin real de energa libre, ya que raras veces se dar la reaccin en condiciones estndar, es decir, con todos los reactivos y productos a concentracin 1 M. Pero s aporta un dato valioso: un valor de G negativo, por ejemplo, indica que la reaccin tiende a producirse de izquierda a derecha, aunque las condiciones actuales puedan obligar a lo contrario. Para introducir un nuevo concepto, vale la pena citar ahora un ejemplo, del que luego se har ms uso. En las reacciones de hidrlisis G es siempre negativo: el aumento de entropa que implica la escisin hidroltica de un compuesto qumico es responsable de ello. Los aceites comestibles, por concretar, son tristeres de glicerol con cidos grasos, luego para su hidrlisis G<0. Si se mezcla el aceite (A) con agua (B), necesariamente se tendr G<0. La reaccin de hidrlisis, en principio, debe producirse con una gran liberacin de energa, pero todos tenemos experiencia de que al mezclar aceite con agua, el aceite permanece inalterado durante mucho tiempo. La razn de esta aparente paradoja estriba en que en una reaccin qumica, para que los reactivos se conviertan en productos es preciso pasar por un estado intermedio, el estado de transicin. Como se esquematiza en la figura 2, en el estado de transicin ni se han terminado de romper los enlaces que hay en A y B, ni se han acabado de formar los que han de aparecer en C y D. El estado de transicin representa, pues, una situacin inestable, de modo que, para pasar de A B a C D, es necesario comunicar a los reactivos la energa necesaria para que alcancen el estado de transicin.

FUENTE: HENRI, V. (1903) Lois gnrales de laction des diastases, Hermann, Paris.

En otras palabras Para que ocurra una reaccin qumica en un sentido determinado debe producirse con un G negativo, pero adems debe producirse a una velocidad adecuada. Un valor negativo de G no implica necesariamente que la reaccin ocurra en ese sentido a alta velocidad. Para que esto ltimo ocurra es necesario que las molculas del sistema estn en un estado especial de reaccin denominado estado activado o excitado o de transicin. Tal activacin de las molculas involucra cierta energa adicional que es necesario entregar al sistema antes de la reaccin propiamente dicha. Esta energa adicional se denomina energa de activacin (Ea).

FIG. 3: Energa de activacin (Ea)

FUENTE: HOPPER, S. Y SEGAL, H. L. (1962) Kinetic studies of rat liver glutamic-

alanine transaminase J. Biol. Chem. 237, 31893195.

FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimtica. Destacaremos dos: el pH y la temperatura. EFECTO DEL pH La mayora de los enzimas presentan un pH ptimo para el cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH vara ms all de unos lmites estrechos. De ah la conocida importancia biolgica de los sistemas tampn.

FUENTE: HOPPER, S. Y SEGAL, H. L. (1962) Kinetic studies of rat liver glutamic-

alanine transaminase J. Biol. Chem. 237, 31893195.

En la mayor parte de los casos el pH ptimo est prximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH ptimo muy diverso segn sea el pH del medio en el que habitualmente actan (los enzimas proteolticos del jugo gstrico tienen pHs ptimos prximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por ltimo existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto.

EFECTO DE LA TEMPERATURA Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones qumicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crtica. Este efecto no es ms que un reflejo de la desnaturalizacin trmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. Si representamos grficamente la variacin de la actividad de los enzimas en funcin de la temperatura (ver Figura 14.9) da la impresin de que existe una temperatura "ptima" anloga al pH ptimo estudiado anteriormente; hay que resaltar que esa aparente temperatura ptima

no es ms que el resultado de dos procesos contrapuestos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura y 2) la desnaturalizacin trmica del enzima.

FUENTE: HOPPER, S. Y SEGAL, H. L. (1962) Kinetic studies of rat liver glutamic-

alanine transaminase J. Biol. Chem. 237, 31893195.

INHIBICIN ENZIMATICA Existen una serie de sustancias, llamadas inhibidores, que inhiben o anulan la accin de los enzimas sin ser transformados por ellos. Su estudio resulta de gran utilidad a la hora de comprender los mecanismos de catlisis, la especificidad de los enzimas y otros aspectos de la actividad enzimtica. La inhibicin enzimtica puede ser irreversible o reversible, esta ltima comprende a su vez tres tipos: inhibicin competitiva, acompetitiva y no competitiva. INHIBICIN IRREVERSIBLE Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima unindose covalentemente a algn grupo funcional esencial para la catlisis con lo que el enzima queda inactivado irreversiblemente. El estudio de este tipo de inhibidores ha resultado de gran utilidad para identificar los grupos funcionales esenciales para la catlisis en aquellos enzimas a los que inactivan. Este tipo de inhibicin se conoce tambin como "envenenamiento" del enzima. Por ejemplo algunos compuestos organofosforados txicos llamados venenos nerviosos, que se utilizan como insecticidas, actan inhibiendo irreversiblemente al enzima acetilcolinesterasa, la cual interviene en la actividad del sistema nervioso. Se sabe que estos compuestos organofosforados inactivan al enzima formando un enlace ster fosfrico con el grupo hidroxilo de un determinado resto del aminocido serina, lo que demuestra que ese grupo funcional es esencial para la catlisis.

INHIBICIN REVERSIBLE Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato. Se distinguen tres tipos de inhibicin reversible: 1. INHIBICIN COMPETITIVA El inhibidor es una molcula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con l por acceder al centro activo, pero que no posee ningn enlace susceptible de ser atacado por el enzima. EL inhibidor forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de caractersticas cinticas anlogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lgicamente, no puede descomponerse a continuacin para dar lugar al enzima libre y a los productos:

2. INHIBICIN INCOMPETITIVA El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unin al sustrato, sino que lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos. El inhibidor se coloca prximo al centro activo situado de tal manera que impide fsicamente la salida de los productos

3. INHIBICIN NO COMPETITIVA El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo en la accin de ambos (Figura 14.12). Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en el una alteracin que dificulta bien la formacin del complejo enzima-sustrato o bien la descomposicin de ste para dar lugar a los productos.

La unin con el inhibidor produce dos formas inactivas: los complejos EI y ESI, ninguna de las cuales puede descomponerse para dar lugar a los productos y al enzima libre:

Aunque podra pensarse que los distintos tipos de inhibicin estudiados pueden desempear algn papel en la regulacin de la actividad enzimtica, todo parece indicar que no es as; la regulacin de la actividad enzimtica se lleva a cabo mediante mecanismos que no se ajustan a ninguno de los modelos de inhibicin estudiados y que se describirn en el prximo apartado. El inters del estudio de la inhibicin enzimtica reside ms en su utilidad para comprender la estructura, mecanismos catalticos y especificidad de los enzimas, que en una importancia biolgica real.

BIBLIOGRAFIA
1. HENRI, V. (1903) Lois gnrales de laction des diastases, Hermann, Paris.

2.
3.

HOPPER, S. Y SEGAL, H. L. (1962) Kinetic studies of rat liver glutamic-alanine transaminase J. Biol. Chem. 237, 31893195.