CTEDRA DE QUMICA ORGNICA- 2012 Trabajo Prctico N 5: Aminocidos y Protenas Carrera: Agronoma Objetivo del Trabajo Prctico: I) Realizar

reacciones de caracterizacin de protenas: coagulacin y precipitacin II) Evaluar el comportamiento de protenas y aminocidos mediante reacciones de coloracin. III) Extraer y reconocer protenas de origen vegetal. IV) Realizar determinaciones cuantitativas de protenas utilizando el mtodo colorimtrico de Biuret Fuente de aminocidos: Se trabajar con soluciones patrn de leucina, triptfano y alanina. Fuente de Protenas de Origen Vegetal: Se trabajar con protenas extradas de harina de trigo, harina de arveja y harina de gluten. I. Ensayos de coagulacin y reacciones de precipitacin Fundamento: Las protenas debido al gran tamao de sus molculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formndose cogulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70C o al ser tratadas con soluciones salinas, cidos, alcohol, etc. La coagulacin de las protenas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalizacin por los agentes indicados que al actuar sobre la protena la desordenan por destruccin de sus estructuras secundaria y terciaria. Tcnica: Tomar una serie de cinco tubos de ensayo y colocar en cada un volumen determinado de solucin de albmina extrada de harina de trigo y observar.
a) 3 mL Albmina Vegetal b) 3 mL Albmina Vegetal c) 3 mL Albmina Vegetal d) 3 mL Albmina Vegetal e) 3 mL Albmina Vegetal + + + + + calor --------------------------> Observar 4 mL CH3 CH2 OH --------> 2 mL HCl 10% ---------------> 2 mL HNO3 20% ------------> 2 mL NaOH conc.----------->

II. Reacciones de coloracin: A - Reaccin de Biuret: El reactivo de Biuret est formado por CuSO4 y NaOH. Fundamento: El reactivo de Biuret pone de manifiesto la presencia de enlaces peptdicos (aunque no es especfica) por lo tanto la reaccin es positiva para las protenas y sus productos de hidrlisis parcial y negativa para los aminocidos. El nombre de la reaccin proviene del hecho que un compuesto simple llamado Biuret (se obtiene por calentamiento de urea) da tambin esta reaccin, ello se debe a que tiene un enlace parecido al peptdico. Es probable que la coloracin se deba a la formacin de complejos de coordinacin de Cu como:

HOH OC NH NH C NH OHOH Cu O
-

2-

HN C NH HN C O2 Na+

Tcnica: Colocar en tubo de ensayo 3 mL de solucin de albmina vegetal y agregar igual volumen de NaOH 10% Luego se aade 1 mL de CuSO4 aI 1%. Observar el color. Repetir el ensayo con solucin de un aminocido. Esta reaccin es til para determinar el grado de hidrlisis de una protena segn la coloracin observada.
Protenas Proteosas Peptonas Pptidos + Reactivo de Biuret ---------------------> Azul Violeta

+ Reactivo Biuret ----------------------------> Rosa + Reactivo de Biuret ------------------------> Rosa + Reactivo de Biuret ------------------------> Rosa

Aminocidos + Reactivo de Biuret ----------------------> Color propio de los reactivos

B- Reaccin xantoproteica: Fundamento: La reaccin es dada por los aminocidos que contienen el radical fenilo y tambin darn reaccin positiva las protenas que posean dichos aminocidos. La causa del color es la nitracin del ncleo bencnico. Tcnica: Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solucin de albmina vegetal, agregar gotas de HNO3 conc y calentar. La reaccin es positiva cuando aparece un precipitado blanco que por accin del calor pasa a amarillo. Realizar la misma reaccin con aminocidos aromticos y alifticos. Aminocidos Aromticos
OH

NH

CH2 HO C O CH NH2 HO C O

CH2 CH NH2 HO C O

CH2 CH NH2

Tirosina

Fenilalanina

Triptofano
OH

OH

I
O

I
CH2 HO C O CH NH2 CH2 HO C O CH

3,5-diyodotirosina

NH2

Tiroxina

C- Reaccin de la ninhidrina

Fundamento: La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un reactivo muy sensible y especfico de los aminocidos. Las protenas y los aminocidos dan positiva esta reaccin. Tcnica: Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solucin de ovoalbmina vegetal y 0.5 mL de ninhidrina 0.1%. La mezcla se calienta a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Dejar enfriar. Se origina una intensa coloracin azul-violeta. III. Extraccin de Protenas Vegetales. - Albminas: Protenas simples y globulares. Son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas. Tcnica de Extraccin: Colocar 10 g de Harina de Trigo en un vaso de precipitacin y aadir 40 mL de H2O destilada. Dejar decantar durante 1 hora. Tcnica de Reconocimiento: Recuperar el sobrenadante y colocar 2 mL en dos tubos de ensayo. Al primer tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret). Al segundo tubo de ensayo calentar a la llama con cuidado, enfriar y filtrar mediante papel de filtro, al filtrado recuperado realizar la reaccin de Biuret y observar - Globulinas: Protenas simples y globulares. Son insolubles o escasamente solubles en agua; solubles en soluciones acuosas salinas diluidas. Tcnica de Extraccin: Colocar 10 g de Harina de Arveja en un vaso de precipitacin y aadir 20 mL de NaCl 10%. Dejar decantar durante 1 hora. Tcnica de Reconocimiento: Recuperar el sobrenadante y colocar 2 mL en un tubo de ensayo. Al tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret) y observar. - Prolaminas: Protenas simples insolubles en agua; solubles en soluciones acuosas de alcoholes de bajo peso molecular. Tcnica de Extraccin: Colocar 10 g de Harina de Trigo en un vaso de precipitacin y aadir 50 mL de etanol 70% Dejar decantar 1 hora. Tcnica de Reconocimiento: Tomar 8 mL del sobrenadante y colocar en 4 tubos de ensayo, alcuotas de 2mL. Tubo N 1: Agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret). Observar Tubo N 2: Calentar a llama directa. Obsevar

Tubo N 3: Agregar 2 mL de Etanol al 100%. Observar Tubo N 4: Agregar 2 mL de agua destilada. Observar - Glutelinas: Protenas simples insolubles en agua, soluciones salinas o alcoholes. Son solubles en soluciones diluidas de cidos y bases. Tcnica de Extraccin: Colocar 10 g de Gluten en un vaso de precipitacin y aadir 50 mL de NaOH 10%. Dejar decantar durante 1 hora. Tcnica de Reconocimiento: Recuperar 4 mL del sobrenadante y colocar 2 mL en dos tubos de ensayo. Al primer tubo de ensayo se le debe agregar 2 mL de NaOH y 1 mL de CuSO4 (Biuret) y observar; mientras que al segundo tubo se debe neutralizar con el agregado de HCl y obsevar.

IV. Determinacin cuantitativa de protenas por mtodo fotocolorimtrico Fundamento: Consiste en determinar la concentracin de protenas de una muestra problema empleando el reactivo de Biuret. Como dicho reactivo pone en manifiesto los enlaces peptdicos, podemos decir que la intensidad de color obtenida ser directamente proporcional a la concentracin de protenas. Tcnica: Preparar 3 tubos de ensayos de la siguiente manera Tubo Blanco (B): 0,1 mL de H2O destilada + 5 mL NaOH 10% + 0,5 mL CuSO4 1% Tubo Problema (P): 0,1 mL solucin de albmina vegetal (dilucin 1/20) + 5 mL NaOH 10% + 0, 5 mL CuSO4 1% Tubo Testigo (T): 0,1 ml solucin de protenas de concentracin conocida + 5 mL NaOH 10% + 0,5 mL CuSO4 1%. Resultados: Se determinar la Absorbancia de los tubos de ensayo usando un espectrofotmetro. Con el Tubo Blanco, calibrar a cero de absorbancia el aparato. Determinar la Absorbancia del Tubo Problema. Determinar Absorbancia del Tubo Testigo.

Clculos: Realizar los siguientes clculos: Absorbancia del Tubo Testigo Concentracin de Protenas (g%)

Absorbancia del Tubo Problema

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Concentracin de Protenas (g%) / Absorb Tubo Testigo
Factor (F)

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Factor

X (g%) = Absorb Tubo Problema x Factor x inversa Dilucin Es decir para nuevos dosajes bastar determinar Absorbancia de la muestra Problema y multiplicar por el factor y la dilucin correspondiente de la muestra en caso que se hiciere.

CUESTIONARIO
1- Mencione el reactivo que permite reconocer el grado de hidrlisis de una protena. Como est formado dicho reactivo? 2- Fundamento de la reaccin Xantoproteica. Que aminocidos dan positiva dicha reaccin? 3- Explique el fundamento de la determinacin cuantitativa de protenas. 4- Calcule la concentracin proteica de la muestra problema; conociendo que la solucin testigo tiene una concentracin de 20 g/L de protenas y una Absorbancia de 0,50 mientras que la muestra problema tiene una Absorbancia de 0,25. 6-Aminocidos esenciales I) Definicin. Ejemplos 7- Punto isoelctrico. I) Definicin II) El punto isoelctrico del aminocido Treonina es 6,16. Si en el laboratorio se prepara una solucin del mismo y el pH de dicha solucin es 5,45. Qu carga neta presentara dicho aminocido y hacia que polo migrara en un campo elctrico?

8-Aminocido Leucina. I) Escribir frmula como in dipolar. II) Conociendo que el pI de dicho aminocido es 5,98. Con qu valores de pH se debera trabajar en el laboratorio para asegurar que dicho aminocido en un campo elctrico migre hacia el nodo? 9- Carcter anftero del aminocido Alanina. Ecuaciones. 10- Comportamiento en medio cido y en medio alcalino del aminocido glutamato. Frmulas 11- I) a) Nombre del siguiente aminocido. b) Qu caractersticas presenta? II) a) A qu polo migrara en un campo elctrico. Justifique. b) En que medio debera encontrarse dicho aminocido para migrar hacia el polo negativo.

12- I) Escriba el siguiente tripptido: Leucilalanilglicina. II) a) Marque el residuo amino terminal. b) Marque los enlaces peptdicos que lo estabilizan. 13-I) Escriba el siguiente tripptido: Leucilfenilalanilisoleucina. II) a) Marque el residuo carboxilo terminal. b) Marque las cadenas laterales. 14- Mencione cuatro funciones de las protenas. Ejemplos. 15- Describa la estructura primaria de las protenas. Tipo de enlace que la estabiliza 16- Explique la estructura secundaria de una protena. Mencione los tipos de enlaces que la estabilizan. 17- Explique la conformacin de una protena. Tipos de enlaces que la estabilizan.

18- Protenas I) Definicin II) Complete la siguiente tabla Protena Ovoalbmina Queratina Segn su forma Segn su estructura qumica Segn su funcin

19Desnaturalizacin de protenas. I) Definicin II) Mencione dos agentes qumicos y explique el mecanismo de accin de los mismos. 20- Desnaturalizacin de protenas: I) Definicin. II) a) Estructuras que se ven afectadas durante la desnaturalizacin proteica b) Mencione dos ejemplos de agentes desnaturalizantes. 21- Clasifique las protenas segn su forma. Explique. Ejemplos 22- Clasifique las protenas segn su estructura qumica. Explique. Ejemplos. 23- Complete el siguiente cuadro: Protena Miosina Inmunoglobulinas Hemoglobina Enzimas Ovoalbmina Funcin general