Ano letivo 2012/2013 Disciplina: Bioqumica Experimental I

Cromatografia de Excluso Molecular

Departamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Marta Ferreira Turma: PL 2 Grupo: 2 Data de Realizao: 9 de Outubro de 2012 Alunos: Alina Ardel n42628 Ana Fonseca n 41872 Joaquim Veiga n 41871 Mariana So Pedro n41851

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Cromatografia de Excluso Molecular

ndice
Resumo ........................................................................................................................................3 Introduo ....................................................................................................................................4 Parte Experimental .......................................................................................................................6 Resultados Obtidos ......................................................................................................................8 Tratamento e Discusso dos Resultados ....................................................................................12 Concluso ...................................................................................................................................15 Bibliografia .................................................................................................................................15

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Cromatografia de Excluso Molecular

Resumo
Esta experincia teve como objetivo realizar uma cromatografia de excluso molecular com a finalidade de separar uma mistura contendo uma protena desconhecida. Para isso utilizou-se: uma matriz, j preparada, de resina Sephadex G-100 com limite de excluso 100 000 e uma gama de fracionamento 8 000 80 000 e um tampo Tris-HCl (pH 8,2) 50mM com NaCl 100Mm. O procedimento experimental comeou com a realizao de uma cromatografia de excluso molecular aplicando um composto, o azul de dextrano polmero que, devido sua cor azul, a sua deslocao pode ser seguida visivelmente ao longo da coluna. Por o azul de dextrano ser um soluto que no interage com as partculas do gel sendo totalmente excludo por estas, considerado o seu uso um passo necessrio para determinar o volume de excluso ou morto da coluna - volume da fase mvel exterior das partculas que corresponde ao volume eludo da coluna. Com resultado, obtiveram-se cerca de 12 fraes de 1mL cada que foram, de seguida, submetidas a duas leituras espectrofotomtricas, uma a 280nm e outra a 620nm, visto este absorver nos dois comprimentos de onda. Analisando as absorvncias obtidas verificou-se que em ambos os comprimentos de onda foi na frao 8 (V=8mL) que se obteve uma concentrao mxima de azul de dextrano. Isto significa que o volume eludo de dextrano 8mL, sendo este o volume morto da coluna. No segundo passo desta experincia, fez-se uma nova cromatografia de excluso molecular mas agora com uma mistura de padres: BSA, Mioglobina e cromato, seguindo-se o mesmo procedimento. Obtiveram-se 32 fraes que foram submetidas a leituras espectrofotomtricas a 280nm e 410nm. Por fim, realizou-se uma nova cromatogrfica para a mistura da amostra contendo a protena desconhecida com azul de dextrano a 280nm e 620nm.

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Cromatografia de Excluso Molecular

Introduo
A cromatografia de excluso molecular, tambm designada por filtrao gel, um mtodo cromatogrfico em coluna que permite separar diferentes molculas com base na sua massa molecular e forma, mais precisamente: raio de Stokes raio de uma molcula difundida em soluo. Uma molcula com um formato mais largo tem um maior raio de Stokes que outra mais compacta, mesmo que ambas tenham uma mesma massa molecular e densidade. Ora, como qualquer outro tipo de cromatografia, existem duas fases: a fase estacionria fase fixa, no lquida, contida na coluna que consiste numa matriz (gel) - polmero contendo uma rede de poros ou esferas tridimensionais, com volume e de tamanho uniforme e controlado - onde se difundem as molculas da amostra; e uma fase mvel que constituda pelo lquido ou eluente que atravessa a coluna como alternativa gravidade, , normalmente, utilizada uma bomba que faz com que a fase mvel percorra a coluna mais depressa a um determinado fluxo - arrastando consigo a soluo amostra a analisar. Perante uma amostra contendo molculas com diferentes raios de Stokes conseguese, facilmente, separar estas molculas umas das outras, recorrendo a esta tcnica, da seguinte maneira: as molculas com dimenses superiores aos poros do gel no penetram para dentro destes - no h interao poro-molcula - ficando estas limitadas ao espao exterior aos poros; as molculas com dimenses mais pequenas que ocupam um volume menor que o dos poros, penetram total ou parcialmente dentro destes (Fig.1) A separao feita num srie de fraes sucessivas recolhidas de uma forma rtmica, em que todas a fraes possuem a mesma quantidade de eluente recolhido. Para fins de anlise sabe-se que o tempo de permanncia na coluna de cada grupo de molculas idnticas dependente do tamanho destas: molculas de tamanho superior aos poros so as primeiras a serem eludas e por isso constituem o contedo das primeiras fraes obtidas; molculas mais pequenas, aquelas que penetram nos poros do gel, por interagirem com este, a eluio retardada, e as fraes correspondentes so recolhidas posteriormente; entre estes dois extremos encontram-se as molculas de tamanho intermdio aquelas que penetram parcialmente nos poros cuja eluio dada entre os dois timings anteriores. Assim sendo, a ordem de eluio de uma mistura de macromolculas segue em ordem decrescente da sua massa molecular (Fig.2). Para que o mtodo seja funcional essencial escolher o gel adequado para o estudo em causa e, para isso, tem de se ter em conta as diferentes propriedades do gel. Uma das caractersticas fulcrais a levar em considerao o limite de excluso que corresponde ao tamanho mais pequeno de molcula que no consegue ocupar os poros, ou seja, molculas com uma tamanho acima desse limite no consegue penetrar no gel. Outras particularidades a levar em considerao so: gama de fracionamento intervalo de massas moleculares possveis de separar no gel -, formas e tamanho das partculas que o constituem as partculas devem ser uniformes e adaptar uma forma esfrica e densidade elevada sendo que partculas de grandes dimenses originam fluxo elevado e separao com baixa resoluo enquanto as mais pequenas originam um fluxo baixo e separao com alta resoluo. A escolha da soluo tampo (eluente) , tambm, importante devendo-se ter em conta as suas caractersticas de modo a que estas no interfiram com a atividade biolgica das molculas. Pgina 4 de 15

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Os resultados da cromatografia de excluso molar so apresentados num cromatograma, diagrama de eluio, que relaciona a variao de concentrao de soluto no eluente em funo do volume de eluente que atravessa a coluna.

Fig.1 Princpio da cromatografia de excluso molecular

Fig.2 Eluio de uma mistura contendo 3 protenas diferentes por ordem decrescente de massas

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Parte Experimental
NOTA: A montagem da coluna j tinha sido realizada pela turma do dia anterior. Foi utilizada resina Sephadex G-100 em vez de Sephacryl S-200-HR.

Fluxograma azul de dextrano

Medir a altura e o dimetro do gel empacotado na coluna. Calcular o volume total da coluna

Deixar correr um volume de soluo tampo Tris-HCl (pH 8,2) 50 mM igual ao volume total da coluna

Introduzir 400L da amostra na coluna atravs da entrada da bomba peristltica, aplicando de seguida um pequeno volume de soluo tampo, do mesmo modo.

Centrifugar 1 mL da soluo de azul de dextrano 4mg/mL numa microcentrifuga a 5000 x gav durante 10 min

Abrir a sada da coluna e iniciar a colecta do eluente em tubos de ensaio marcados com o volume de 1 mL. Deixar a amostra penetrar no gel e continuar a eluio com a soluo tampo

Aps iniciar a eluio do azul de dextrano, passar a coletar fraes de 1 mL em tubos de ensaio at toda amostra ter eludo a coluna

Proceder litura de Abs280 e Abs620 das fraes colectadas aps diluio para metade com tampo de eluio e determinar o volume morto da coluna.

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Bioqumica Experimental I Fluxograma Mistura Padro NOTA: Utilizou-se apenas uma mistura padro.

Cromatografia de Excluso Molecular

Centrifugar 1 mL da mistura de protenas padro adequada numa microcentrfuga a 5000 X gav durante 10 min

Introduzir cuidadosamente 500L da mistura de protenas padro na coluna atravs da entrada da bomba peristltica

Ler as Abs280 e Abs410 das fraes recolhidas aps a diluio para metade com tampo de eluio.

Abrir a sada da coluna e iniciar a colecta de fraes de 1 mL em tubos de ensaio

Fluxograma Amostra Desconhecida

Centrigugar 1 mL da amostra desconhecida numa centrfuga a 5000 X gav durante 10 min

Introduzir cuidadosamente 500 L de amostra desconhecida na coluna atravs da entrada da bomba peristltica Quando toda a amostra tiver sido fraccionada, passar um volume de soluo tampo de eluio atravs da coluna para lavar

Abrir a sada da coluna e iniciar a colecta de fraes de 1 mL em tubos de ensaio

No final, lavar a coluna passando 2 volumes de soluo tampo Tris-Hcl (pH 8,2) 50 mM com NaCl 100mM e NaN3 0,02% (m/v) atravs da coluna

Ler a Abs 280 das vrias fraes rescolhidas aps a diluio para metade com tampo de eluio

No final do trabalho, desmontar todo o sistema e lavar bem a tubagem para que no restem quaisquer vestgios de sal

Retirar o gel do interior da coluna para um erlenmeyer e troque o tampo por uma soluo de etanol a 20% em gua destilada (soluo de armazenamento). Guardar o gel no frigorfico

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Resultados Obtidos
Aplicao do azul de dextrano Coluna: Altura = 41 cm

Dimetro = 1 cm, logo o raio = 0,5 cm Volume (mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs280 0,000 -0,006 0,037 0,015 0,040 0,009 0,028 0,350 0,778 0,272 0,102 0,041 0,018 Abs620 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001 -0,001 0,000 0,126 0,276 0,096 0,035 0,017 0,007

Tabela 1 - Absorvncias das fraes recolhidas com o azul de dextrano

Cromatograma do Azul de Dextrano

0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 -0,100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Volume de eluio (mL) 10 11 12 Abs280 Abs620

Absorvncia

Figura 3 - Leituras para Abs280 e Abs620 para o azul de dextrano

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Aplicao das misturas padro

Volume (mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Abs280 0,000 -0,011 -0,007 -0,015 -0,003 -0,003 -0,014 -0,007 0,033 0,092 0,130 0,139 0,115 0,091 0,083 0,114 0,170 0,220 0,189 0,150 0,092 0,063 0,131 0,465 0,985 1,337 1,258 0,856 0,457 0,180 0,050 0,000 -0,010

Abs410 0,000 -0,004 -0,001 -0,006 0,000 -0,001 -0,007 -0,002 -0,001 0,001 0,004 0,016 0,040 0,091 0,206 0,467 0,848 1,091 0,980 0,810 0,526 0,301 0,166 0,172 0,268 0,345 0,321 0,215 0,113 0,042 0,007 -0,006 -0,0100

Tabela 2 - Absorvncias das fraes recolhidas com a amostra padro

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Cromatograma da Amostra Padro e Azul de Dextrano

1,600 1,400 1,200 Absorvncia 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 -0,200 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Volume (mL) Padro Abs280

Padro Abs410
Azul Dextrano Abs620

Figura 4 - Leitura de Abs280 e Abs410 das fraes recolhidas da amostra padro e Abs620 das fraes recolhidas de azul de dextrano

Aplicao da amostra desconhecida Volume (mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Abs280 0,000 0,005 -0,003 0,001 -0,005 -0,007 0,002 0,036 0,058 0,060 0,050 0,043 0,040 0,032 0,028 0,027 0,025 0,017 0,015 Abs620 0,000 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,003 0,009 0,015 0,013 0,010 0,009 0,010 0,006 0,004 0,005 0,004 0,004 0,003

Tabela 3 - Leitura de Abs280 e Abs620 das fraes recolhidas com a amostra desconhecida

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Cromatograma da Amostra desconhecida

0,070 0,060 0,050 Absorvncia 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 -0,010 -0,020 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Volume (mL) Abs280 Abs620

Figura 5 - Leituras a Abs280 e Abs620 para a amostra desconhecida

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Tratamento e Discusso dos Resultados

Atravs dos cromatogramas obtidos podemos tirar vrias concluses em relao ao trabalho experimental efetuado. No caso do azul de dextrano, podemos verificar que o pico de absorvncia corresponde ao comprimento de onda de 280 nm no volume de eluio de 8 mL. Assim podemos concluir que o volume morto da coluna de 8 mL, j que o azul de dextrano um composto de alta massa molecular e este no penetra nos poros do gel. Em relao mistura padro, leu-se a absorvncia a 280nm e 410 nm. Como conhecemos as protenas que pertencem mistura e a sua massa molecular, pode-se deduzir qual o composto que absorve radiao a um determinado comprimento de onda. Sabendo que as molculas de maior massa molecular so eludas mais rapidamente, j que as molculas mais pequenas iro ficar retidas nos poros do gel, de expectar que o primeiro a ser eludo seja o azul de dextrano, seguido do BSA, mioglobina e, por fim, K 2CrO4. Ao relacionar-se este facto com os picos obtidos no cromatograma, conclui-se que os picos de absorvncia do comprimento de onda 280 nm correspondem ao pico do BSA (1 pico) e K2CrO4 (2 pico) e o de 410 nm ao pico de mioglobina. Para a amostra desconhecida leu-se a absorvncia a 280 nm e 620 nm. Como a amostra desconhecida contm azul de dextrano, e que este tem o pico de absorvncia aos 280 nm, podemos concluir que o primeiro pico corresponde ao azul de dextrano e segundo pico a protena desconhecida. Isto j era de esperar j que o azul de dextrano possui uma massa molecular maior do que a maioria das protenas.

Clculo do Kav para os diferentes componentes da mistura padro Quando se quer caracterizar o comportamento dum certo composto, comum usar-se um coeficiente, Kav, que representa a frao da fase estacionria disponvel para a difuso do composto, desprezando a contribuio do volume slido das partculas do gel para o volume total da coluna. O Kav calculado utilizando a seguinte expresso:

em que representa o volume de eluio, da coluna.

o volume morto da coluna e

o volume total

O volume total da coluna, , pode ser calculado a partir da altura coluna, atravs da seguinte equao:

e do raio

da

Como

eo

, podemos concluir que:

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O volume morto da coluna, , corresponde ao volume de eluio de um composto de massa molecular elevada que no consegue penetrar no interior dos poros do gel, sendo que neste caso utilizou-se o azul de dextrano para encontrar este valor. Numa coluna bem empacotada, o volume morto corresponde a cerca de 30% do volume total.

O volume de eluio, , de cada componente da mistura pode ser determinado a partir do pico de absorvncia destas, isto : Composto Azul de dextrano BSA Mioglobina K2CrO4 (mL) 8 11 17 25 Absmx 0,778 0,139 1,091 1,337

Tabela 4 - Volume de eluio dos vrios componentes da mistura padro e azul de dextrano

Assim pode-se finalmente calcular o Kav dos diferentes componentes. Utilizando o BSA como exemplo:

Para os Kav dos restantes componentes da mistura, procedeu-se analogamente e os valores esto apresentados na seguinte tabela:

Componentes Azul de dextrano BSA Mioglobina K2CrO4

Kav 0 0,124 0,372 0,702

Tabela 5 - Valor de Kav para cada componente da mistura

O gel utilizado neste trabalho foi o Sephadex G-100, que possui uma gama de fracionamento para protenas globulares de a . Como o azul de dextrano tem uma massa molecular relativa de 2 000 000, isto , , e a gama de fracionamento corresponde ao intervalo de massa moleculares das macromolculas passvel de serem separadas pelo gel usado, pode-se concluir que expectvel que o K av seja 0, pois as molculas de azul de dextrano nunca poderiam penetrar nas partculas do gel. Os K av do BSA, Mioglobina e K2CrO4 encontram-se entre 0 e 1. Quanto mais prximo o Kav estiver do 0, como no caso do BSA, mais dificilmente as molculas do composto entram no gel. Isto explicado j que o BSA tem uma maior massa molecular. Quanto mais prximo estiver do 1, melhor as molculas de distribuem no interior e no exterior das partculas do gel, como no caso do K 2CrO4,cuja massa molecular a menor comparando com os restantes componentes. Pgina 13 de 15

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Clculo do Kav para a amostra desconhecida A partir da tabela 3 e do grfico 3 podemos concluir que houve 2 picos nas absorvncias medidas. No primeiro pico o volume de eluio correspondente, , ,eo segundo pico, o volume de eluio, , Assim pode-se calcular o Kav destes componentes: 1 Pico:

2 Pico:

Tendo em conta os Kav obtidos anteriormente, pode-se concluir que o 1 pico corresponde ao pico do azul de dextrano e o 2 pico corresponde ao pico de BSA, j que os valores de Kav so prximos. Assim pode-se dizer que a amostra desconhecida composta por azul de dextrano e BSA.

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Concluso
Nesta experincia foi possvel separar uma mistura de protenas globulares atravs de uma cromatografia de excluso molecular. A partir das fraes de 1 mL recolhidas da coluna leu-se a absorvncia em diferentes comprimentos de onda. Com estas medidas construram-se cromatogramas, elucidativos ao volume de eluio de cada componente. Ao usarmos uma coluna Sephadex G-100, quando se faz a eluio do azul de dextrano, este no ir penetrar nos poros do gel. Assim pode-se calcular o volume morto da coluna e, consequentemente, com o volume total e os volumes de eluio das vrias espcies, pode-se calcular o coeficiente de distribuio das mesmas. Com estes valores ficou-se a saber que a protena desconhecida era o BSA, visto que ambos possuam uma massa molecular semelhante.

Bibliografia
- Protocolo Experimental da Aula Prtica Cromatografia de Excluso Molecular - Slides das aulas de Bioqumica Analtica n 7: Princpios gerais das tcnicas de separao cromatogrficas (I)

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