DBT. MANUAL DE BIOLOGA MOLECULAR II PRACTICA 2. Extraccin de DNA total de plantas.

Competencia: Conocer la tcnica de extraccin de ADN total de plantas a travs de una metodologa ya establecida para utilizar el material gentico en un corrimiento electrofortico. I. INTRODUCCIN

Las tcnicas de extraccin de ADN pueden variar segn las necesidades, es importante mencionar que ninguna planta posee el mismo material gentico es por ello, que desde hace ms de 20 aos el conocimiento de estas tcnicas han sido utilizadas para la resolucin de casos de criminologa, as mismo, es importante contar con una base de datos la cual permita establecer diferencias y similitudes que aclaren la procedencia de dichas plantas. El anlisis gentico de cualquier ser vivo provee informacin valiosa ya que es posible identificar la relacin que guarda con otros organismos as como su ancestro comn al realizar anlisis de bioinformtica, en ese sentido se cuenta con diversas fuentes de informacin como lo es el National Center Biotechnology Informations (NCBI) entre otros los cuales guardan toda la informacin de los organismos desde secuencias de protenas, genes, cromosomas incluso genoma completo, todo ello con la finalidad de poder entender el proceso evolutivo de los seres vivos en nuestro planeta as como los cambios ms significativos que le confieran importancia al ser humano. II. Materiales y reactivos Jabn liquido o SDS Mortero con pistilo Agua destilada (FRIA) Tubos eppendorf 1.5ml Papana pura o ablandador papel filtro o manta Sal de mesa Buffer TAE 1X Etanol al 70% (FRIO) Agitador de vidrio vasos de precipitado de 250ml Planta, hojas, tallo etc. Probeta de 100 ml. Metanol absoluto Pipetas 5 y 10 ml

III.

METODOLOGA

1. Colocar en el mortero 100ml de agua fra con 3gr de NaCl, moler muestra vegetal lo mejor posible, dejar reposar 5min.

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DBT. MANUAL DE BIOLOGA MOLECULAR II 2. Filtrar o decantar los 100ml en un vaso de precipitado de 250ml y agregar 10ml de jabn lquido para trastes o bien una solucin de SDS al 10%. 3. Agregar 0.300gr de papana pura o ablandador, agitar suavemente evitando hacer espuma dejar reposar de 5 -10 min. 4. Poner 1/4 de la mezcla en un tubo de ensayo, agregar sin mezclar y por las paredes metanol o etanol frio 1/2 5. Tomar de la mezcla el DNA que se observa, ponerlo en un tubo eppendorf. 6. Centrifugar 3,500 rpm 2 min, hacer 2 lavados con etanol, dejar secar y resuspender en 100 o 300 microlitros de tae 1x o agua destilada. 7. Guardar en el congelador a -20c para su posterior corrimiento electrofortico. IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES a) Anota en tu cuaderno las observaciones descritas por el docente durante la prctica. b) En tu reporte coloca esquemas claros y con una pequea descripcin de los que se observa. c) Incluye un diagrama de flujo que permita sintetizar los pasos realizados en la prctica. V. CUESTIONARIO 1. Con que bases podra utilizarse esta tcnica en un caso de criminologa? 2. Explica que funcin cumplen cada uno de los reactivos utilizados en la prctica. 3. Cmo prepararas una solucin de MgCl2 al 20 milimolar (mM) desarrolla las ecuaciones?

VI. REFERENCIAS Universidad Autnoma de Ciudad Jurez, instituto de ciencias biomdicas departamento de ciencias qumicobiolgicas programa de biologa. NAYELI VERA RAMIREZ, GUILLERMO BOJORQUEZ, GUILLERMO BOJORQUEZ, 2011. PDF John M. Butler. Forensic DNA Typing, biology, technology, and genetics of STR markers, 2005, second edition.

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DBT. MANUAL DE BIOLOGA MOLECULAR II PRACTICA 3. Extraccin de DNA total de sangre. Competencia: Conocer una tcnica de extraccin de DNA sanguneo por medio de un protocolo establecido para su corrimiento electrofortico y conocimiento de su pureza. I. INTRODUCCIN

La purificacin del DNA es importante porque permite: A) Identificar mutaciones. B) Ver caractersticas propias de los tipos de DNA (Polimorfismo). C) Para clonar (Genes especficos, fragmentos de cromosomas o individuos). D) Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno. E) Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patognicos. F) Identificar resistencia microbiana. G) Evaluar desordenes genticos, neurodegenerativos, neoplsicos, inmunolgicos. H) Medicina forense para la identificacin de personas. I) Para hacer test de paternidad. Entre otras CONCEPTOS IMPORTANTES Heparina: Heteropolisacrido complejo; posee buena cantidad de grupos sulfato y residuos glucosalina. La heparina inhibe la coagulacin de la sangre por activacin de la antitrombina III. En cantidades pequeas la heparina no tiene un efecto significativo en muchas de las determinaciones de laboratorio y se utiliza generalmente como anticoagulante en las muestras de sangre en los laboratorios clnicos. El citrato, la heparina y el EDTA entre otros, son anticoagulantes que imposibilitan la disponibilidad de iones de calcio, que es imprescindible en la coagulacin, y ya sin el calcio, la muestra de sangre al centrifugarla no se coagular y se podrn separar las molculas sin problema. Isopropanol: (CH3 CHOHCH3). Lquido transparente, voltil e incoloro empleado en el laboratorio qumico para extraer y disolver lpidos y en histologa se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El Isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratndolo y llevndolo al fondo del tubo. Etanol: (CH3CH2OH). Lquido voltil, incoloro, miscible con agua, metanol, ter, acetona y cloroformo. Se emplea principalmente como solvente en muchos procedimientos de laboratorio, como agente deshidratante en histologa como solvente de algunas sustancias tinturas) y como desinfectante. Solvatacin: Interaccin estabilizadora de un solvente con un soluto o de un solvente con grupos funcionales en la superficie de un material insoluble.

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II.

MATERIALES Y REACTIVOS Tubos vacutainer con EDTA, heparina o citrato Tubos eppendorf estriles de 1.5 ml Micropipetas Puntas Vortex Microcentrfuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua desionizada grado I (MQ) estril (H 2Odd) Bao de agua a 37C Isopropanol Etanol 70 % METODOLOGA Extraccin de DNA TOTAL (cloroformo) Homogenizar el tejido ( 40 a 200 mg) o 300 microlitros de sangre anticoagulada, con 700L de solucin de lisis (10mM Tris; 400 mM NaCl; 2 mM Na2*EDTA, 30L SDS al 20% en TAE -solucin de lisis) y 10 l de proteinasa K ( 20 g /ml). La mezcla se homogeniza y se mantiene en agitacin constante de 5 a 24 horas. Nota: es importante verificar la adecuada agitacin durante la primer hora, regla emprica, recuerde que con bajo tiempo de digestin hay poca separacin de ADN, contrastantemente un tiempo prolongado puede incrementar el tiempo de exposicin a las Dnasas, del mismo tejido, y en consecuencia tambin hay poca obtencin de ADN. Un tiempo generalmente adecuado es de 12 a 14 horas (overnight). Para nuestro caso se colocaran las muestras en incubacin a TA (temperatura ambiente 37C) durante 10 min. con agitacin suave. Al tubo se le agregan 300 l de NaCl 6M (previamente filtrado). Para lograr una adecuada homogenizacin puede utilizar el Vortex durante 10 segundos, y se centrifuga en TA (temperatura ambiente 37C) por 2 min. a 14,000 g. Pasar a un tubo limpio los 700 l de la fase superior, se le agregan 700 l de Cloroformo, y despus de homogenizar completamente (con Vortex 10 segundos), se centrifuga a TA. Durante 10,000 rpm por 3 min. Posteriormente se toman 700 l del sobrenadante, evitando tomar o tocar la interface que contiene protenas. Considere que es preferible tomar menos lquido, pero no contaminado. Al sobrenadante se le agregan 600 l de Isopropanol FRIO, se homogeniza lentamente NO SE MEZCLA COMPLETAMENTE. Es recomendable dejar reposar el tubo en posicin vertical, durante unos 10 min a TA o en refrigerador, para facilitar la precipitacin del ADN. Las muestras son centrifugadas a 14,000 rpm por 3 min, TA. El sobrenadante es retirado cuidadosamente, procurando no perturbar el fondo del tubo, en donde est depositado el DNA.

III. 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7.

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DBT. MANUAL DE BIOLOGA MOLECULAR II 8. Para secar el pellet, se deja el tubo abierto a 37 C, durante media hora o se coloca en un sistema de vaco. 9. Finalmente el pellet seco, se resuspende con 100 l de TAE 1X o agua destilada. Para conservar la muestra se guarda en congelacin a 20C (durante meses) o a 80C (durante aos). IV. RESULTADOS Y DISCUSIN.

A) Elabora un diagrama de flujo donde muestres la tcnica de extraccin de manera sintetizada. B) Discute con tus compaeros cuales son las modificaciones que se podran hacer a la tcnica para poder tener un DNA en alta pureza coloquen las discusiones en su reporte. V. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Cul es la funcin del anticoagulante al momento de extraer la sangre? Por qu se forman 3 fases cuando se agrega cloroformo, que podemos encontrar en cada una de ellas. cul es la ventaja de utilizar un kit de extraccin de DNA? En qu consiste la relacin 260/280 en la determinacin del grado de pureza del DNA? Describe la elaboracin de al menos dos soluciones buffer de lavado para el DNA y poder eliminar impurezas. 6. Explica la funcin de cada uno de los reactivos que son utilizados en las extracciones: Fenol, Cloroformo, Isopropanol, Proteinasa K, Tris-HCl, SDS NaOH y NaCl VI. REFERENCIAS Genes IX (Lewin, Genes XI) 2007 Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology) 2003 An Introduction to Genetic Engineering 2008 Molecular Cell Biology 2007 Benjamin Lewin Paul Cutler Desmond S. T. Nicholl Harvey Lodish, Arnold Berk , Chris A. Kaiser , Monty Krieger, Matthew P. Scott, Anthony Bretscher , Hidde Ploegh, Paul Matsudaira. 9na 2da 1er 6ta Jones & Bartlett Publishers Humana Press Cambridge University Press W. H. Freeman

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