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Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2002 6 (3), 131142

Revue bibliographique : les mthodes chimiques didentification et de classification des champignons

Marjolaine Verscheure, Georges Lognay, Michel Marlier
Unit de Chimie gnrale et organique. Facult universitaire des Sciences agronomiques de Gembloux. Passage des Dports, 2. B5030 Gembloux (Belgique). E-mail : verscheure.m@fsagx.ac.be Reu le 7 mars 2002, accept le 24 juillet 2002. Depuis quelques annes, le dveloppement des mthodes analytiques et molculaires a permis aux scientifiques de raliser une classification des organismes selon des caractristiques biochimiques. Cette classification dnomme chimiotaxonomie comprend les mthodes molculaires et les mthodes chimiques qui fournissent des donnes complmentaires aux mthodes classiques. De plus, en combinaison avec les donnes morphologiques, la chimiotaxonomie permet une identification et/ou une classification plus performante. Mots-cls. Chimiotaxonomie, champignons, mthode molculaire, mthode chimique, mtabolite primaire, mtabolite secondaire. Chemotaxonomy of fungi: a review. For few years, advancements of molecular methods and analytical techniques enabled scientists to realise a classification of microorganisms based on biochemical characteristics. This classification, called chemotaxonomy, includes molecular methods and chemical methods which provide additional data and lead to a better identification and/or classification. Keywords. Chemotaxonomy, fungi, molecular method, chemical method, primary metabolites, secondary metabolites.

1. INTRODUCTION La systmatique des champignons est base principalement sur des critres morphologiques. En pratique, la procdure la plus utilise est la croissance disolats sur un milieu de culture appropri, ce qui permet de reconnatre les traits caractristiques de ces isolats qui sont gntiquement stables et en gnral peu influencs par les changements environnementaux. Cependant, dans certains cas, ces critres sont dlicats utiliser et requirent une exprience particulirement approfondie. titre dexemple, lidentification des espces appartenant au genre Alternaria, base uniquement sur des caractristiques morphologiques, est trs difficile car ces moisissures sont trs sensibles aux conditions de culture (Anderson, Thrane, 1996). Anderson et Thrane (1996) ont utilis la fois la morphologie, le profil en mtabolites et les caractristiques de culture (diamtre et couleur des colonies sur 9 milieux aprs 6 jours dincubation) pour classer 36 isolats appartenant aux espces dAlternaria infectoria et Alternaria alternata. Lanalyse par groupements des rsultats obtenus a permis de dlimiter deux groupes : le groupe A. infectoria dont les isolats produisaient uniquement des composs non identifis et le groupe A. alternata

o les isolats produisaient de lalternariol et de lther monomthyl dalternariol, eux-mmes subdiviss en trois sous-groupes. De plus, la couleur des colonies sur quatre milieux de culture diffrents a galement permis de diffrencier les groupes A. infectoria et A. alternata. 2. LA CHIMIOTAXONOMIE Depuis quelques annes, le dveloppement des mthodes analytiques et molculaires a permis aux scientifiques de raliser une classification des microorganismes selon des caractristiques biochimiques bases sur ltude de trois grandes classes principales de molcules : les mtabolites primaires, composs ncessaires aux fonctions vitales de lorganisme ; les mtabolites secondaires tels que les alcalodes ou les terpnes, qui nont pas de fonctions vitales ; les smantides qui portent linformation gntique : acide dsoxyribonuclique (ADN), acide ribonuclique (ARN) et protines. Actuellement, la combinaison de diverses caractristiques telles que les caractristiques morphologiques (par exemple, forme et taille cellulaire), physio-

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logiques, mtaboliques, cologiques et molculaires permet la classification et lidentification correcte non seulement des bactries et des levures mais aussi des moisissures. La chimiotaxonomie, partie intgrante de la dmarche, comprend les mthodes molculaires et les mthodes chimiques. 2.1. Mthodes molculaires Cette partie donne un aperu des mthodes molculaires utilises en taxonomie fongique. Puisque le but de cette revue concerne avant tout les mthodes chimiques, cette partie nest donc ni exhaustive ni trs prcise. Cependant, il est impossible de discuter de la taxonomie fongique sans citer les techniques molculaires car celles-ci ont connu un progrs important et ont suscit un intrt norme grce lmergence de la technique de raction de polymrisation en chane (PCR). Lorsque les caractristiques morphologiques sont insuffisantes pour identifier un champignon, on utilise les techniques physiologiques et biochimiques. Cependant, pour des champignons filamenteux peu diffrencis tels que Penicillium, Aspergillus ou Alternaria, ces mthodes sont laborieuses, longues et quelquefois incompltes (Andersen, Thrane, 1996 ; Frisvad et al., 1998 ; Guarro et al., 1999). Les mthodes molculaires sont universellement applicables et permettent dexplorer le polymorphisme diffrents niveaux (comparaison entre des souches, des espces, des genres, etc.). Les mthodes molculaires sont bases sur ltude dun gne (locus), dun fragment dADN dfini (espaceur, intron, etc.), de plusieurs gnes (multiloci) ou encore de lADN total, dpendant du but poursuivi. Les mthodes utilises dans ltude de lADN total sont la dtermination du contenu en bases guanine et cytosine de lADN nuclaire ou ltude du taux dhybridation de lhtroduplex ADNADN dont un brin appartient lorganisme indtermin et lautre un organisme de rfrence. Cet htroduplex est compar lhomoduplex des souches hybrides avec elles-mmes. Les mthodes bases sur ltude dun gne ou de plusieurs gnes utilisent la technique PCR (Mullis et al., 1986). Cette technique permet lamplification de squences spcifiques dADN via sa synthse in vitro et lobtention rapide et simple de microgrammes de lADN cibl. La PCR-RFLP (polymorphisme de taille des fragments de restriction) (digestion de lADN par des enzymes de restriction) et le squenage prcd dune PCR sont bass sur ltude dun gne ou dun fragment dADN (Frisvad et al., 1998 ; Kano et al., 2000). Plusieurs auteurs ont utilis un fragment de lADN ribosomial (Frisvad et al., 1998) tel que les

units 5.8S (trs conserves), 18S et 25S (trs conserves mais plus utiles que 5.8S), les espaceurs (interne ou externe qui sont des rgions non codantes et variables) (Lbeck et al., 2000 ; Makimura et al., 2001) ou encore lintergenic spacer (IGS) qui spare deux copies de lADN ribosomial. Linconvnient de la PCR-RFLP est quelle fournit une information phylogntique moindre que lors dun squenage. Cependant, elle peut tre trs utile lors dun criblage disolats suspects appartenir la mme souche ou espce. En effet, bien que le squenage soit une technique trs prcise gnrant beaucoup dinformations, celle-ci demande un temps de mise en uvre lev ainsi quun cot important. ct de ltude dun gne, les techniques de fingerprints (empreintes molculaires) ciblent lensemble du gnome. Ces techniques contiennent, entre autres, le polymorphisme de lADN amplifi au hasard (RAPD), les microsatellites et les minisatellites. Le RAPD (Arisan-Atac, Kubicek, 1995 ; Frisvad et al., 1998) utilise la technique PCR pour amplifier des segments dADN gnomique avec des amorces doligonuclotides non spcifiques. Cette technique prsente le dsavantage dtre peu reproductible et ncessite la standardisation de la mthode damplification ainsi que de la visualisation des fragments obtenus. Cependant, elle peut tre utile lors de lanalyse rapide dun nombre lev disolats dont on suspecte quils font partie du mme taxon et dont aucune information sur la squence dun marqueur nest connue. Les microsatellites (squences rptitives de 2 5 paires de bases rparties de manire alatoire dans le gnome) et les minisatellites (squences rptitives denviron 20 paires de bases) peuvent tre amplifis (Frisvad et al., 1998). Ces techniques utilisant les micro- et minisatellites sont reproductibles et ncessitent peu dADN mais sont longues et coteuses. 2.2. Immunotaxonomie et lectrophorse des protines Les champignons produisent un grand nombre dantignes qui se sont rvls tre propres au genre et/ou lespce. En effet, des tudes ont montr que non seulement la prsence de polysaccharides (exoantignes) permet de classer les espces, mais aussi que la composition en carbohydrates dfinit le taxon auquel appartient lespce tudie. De plus, la production de ces molcules ne dpend ni du milieu de culture, ni de la temprature, ni de lge de la culture (Frisvad et al., 1998). ct des mthodes immunologiques, llectrophorse des protines et des isozymes (enzymes diffrents mais qui catalysent la mme raction) est une technique largement utilise en

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taxonomie. Llectrophorse des isozymes permet de dtecter et didentifier un champignon particulier mais son utilisation est encore controverse bien que des tudes (Micales, 1986) aient utilis la diffrence des profils en isozymes pour rsoudre des problmes situs au niveau de lespce. De plus, elle fournit plus dinformations dun point de vue volutif et est plus rapide que les mthodes bases sur la technique PCR. 2.3. Mthodes chimiques Les mthodes chromatographiques et spectroscopiques permettent lanalyse qualitative et quantitative dun ou plusieurs mtabolites ou composs de la membrane cellulaire. On tudie principalement les polysaccharides, les lipides insaponifiables, les acides gras, les mtabolites secondaires volatils et non volatils. Les polysaccharides. Les polysaccharides constituent 80 90 % de la membrane cellulaire des champignons et leurs diffrences de composition chimique et structurale indiquent que chaque genre possde ses propres caractristiques polysaccharidiques. La dtermination des structures des polysaccharides est trs complexe car elle ncessite la connaissance des monomres et de leur squence, de la taille des cycles, de la position des liaisons et de la configuration anomrique. Ahrazem et al. (1999) ont tudi les polysaccharides de Penicillium vermoesenii. Ils ont pu mettre en vidence la prsence dun polysaccharide spcifique lespce P. vermoesenii et ont conclu que cette espce tait plus proche du genre Fusarium que du genre Penicillium. Jimnez-Barbero et al. (1995) ont tudi les polysaccharides des genres Trichophyton et Microsporum (des dermatophytes dont la membrane cellulaire est compose de chitine). Ils ont constat que les polysaccharides de Trichophyton rubrum et Trichophyton soudanense sont presque identiques ceux de Microsporum gypseum. Les lipides insaponifiables. Plusieurs types de lipides insaponifiables sont tudis en chimiotaxonomie : les ubiquinones, les strodes et les carotnodes. Les ubiquinones. Les ubiquinones font partie des lipides terpniques et sont des constituants des membranes mitochondriales des eucaryotes. Ces molcules jouent un rle essentiel dans le mtabolisme, notamment lors du transfert dlectrons dans la chane du systme respiratoire. Les ubiquinones sont utilises en chimiotaxonomie car leur structure varie en fonction du taxon. La longueur de la chane isoprnode et le degr dinsaturation varie selon le systme biologique partir duquel les ubiquinones ont t isoles.

Okada et al. (1996) ont dtermin qualitativement et quantitativement les ubiquinones prsentes dans 14 espces de Cladosporium et ils ont divis le genre en deux : le premier groupe contenant lubiquinone Q10 (Figure 1a ) englobe six espces dont quatre sont des pathognes humains ; le deuxime groupe contenant lubiquinone Q10(H2) (Figure 1b) comprend huit espces qui sont des pathognes des plantes et/ou des saprophytes. Les rsultats de ces auteurs sont en accord avec les tudes phylogntiques et physiologiques classiques ralises antrieurement. Les strodes. Les strodes sont des composs importants de la bicouche lipidique de la membrane. Les champignons possdent des strols mthyls en C24 tels que lergostrol, un strode commun tous les champignons, des strols thyls et parfois des strols dsalkyls en C24 (Figure 2). La dtection de lergostrol indique la prsence de contaminants fongiques (Frisvad et al., 1998). Grandmougin-Ferjani et al. (1999) ont tudi par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (GCMS) la distribution en strols de 16 espces de champignons mycorrhiziens appartenant lordre des Glomales. Ils ont constat que le nombre de strols variait de 5 15 en fonction de lespce, que le strol majoritaire tait le 24thylcholestrol, tandis que lergostrol ntait pas dtect. Ces analyses ont montr un profil en strols trs similaire pour les espces tudies et ont rvl que les Glomales taient un ordre primitif des Zygomyctes. Cependant, des tudes complmentaires sont ncessaires car les strols ne sont pas prsents chez toutes les espces.
a

Figure 1. Structure chimique des ubiquinones Q10 (a) et Q10 (H2) (b) Chemical structure of ubiquinones Q10 (a) and Q10 (H 2) (b) (adapted from Frisvad et al., 1998).

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OH Cholestrol

OH 24-mthylcholestrol

OH

OH 24-thylcholesta-5,22-din-3-ol 24-thylcholestrol

Figure 2. Structure chimique du cholestrol, du 24-mthylcholestrol, du 24-thylcholesta-5,22-din-3-ol et du 24thylcholestrol Chemical structure of cholesterol, 24-methylcholesterol, du 24-ethylcholesta-5,22-dien-3-ol and of 24-ethylcholesterol (adapted from Grandmoujin-Ferjani et al., 1999).

Les carotnodes. La dernire classe de lipides envisage en chimiotaxonomie est celle des carotnodes car 60 % des champignons tudis en contiennent. Par exemple, les espces des Zygomyctes (ordre des Mucorales) possdent du carotne (Figure 3) comme pigment majoritaire tandis que les espces de Chytriadales et Blastocladiales biosynthtisent l-carotne et que certaines espces de Chytridiomycetes contiennent le -carotne (Frisvad et al., 1998). Les acides gras. Lopes da Silva et al. (1998) ont prouv quil tait possible de diffrencier des espces de Penicillium sur base de leur profil en acides gras cellulaires. En effet, plusieurs espces prsentaient la mme composition mais des concentrations relatives diffrentes ; lacide palmitique (16:0), lacide olique (18:1) et lacide linolique (18:2) ont t dtects pour toutes les espces tandis que la quantit en acides gras insaturs variait entre 68,5 % et 78,5 %. Cependant, diffrents facteurs peuvent influencer la composition et lorsque lon compare celle-ci, il faut

tenir compte de la vitesse de croissance, de lge de la culture, de loxygne disponible, de la temprature, du pH et de la composition du milieu de culture.

-carotne

-carotne

-carotne

Figure 3. Structure chimique du -carotne, -carotne et -carotne Chemical structure of -carotene, carotene and -carotene.

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Lidentification des organismes sur base des profils en acides gras est risque car il ny a pas eu danalyses sur des souches provenant de lieux diffrents. Par contre, en combinaison avec dautres caractres phnotypiques, ils sont dune utilit dmontre. El Menyawi et al. (2000) ont mis en vidence que lanalyse des profils en acides gras par chromatographie en phase gazeuse (GC) de souches de moisissures de spcimens cliniques tait une mthode rapide et prcise didentification. Cependant, ils ont d tablir une base de donnes contenant les profils dun grand nombre de moisissures et ils ont ainsi pu mettre au point une technique rapide didentification spcifique lespce qui facilite le diagnostic de linfection. Les mtabolites secondaires volatils. Les champignons synthtisent un grand nombre de mtabolites secondaires et, parmi eux, des molcules volatiles responsables de leur odeur caractristique (Tableau 1). Le dveloppement des techniques analytiques telles que la GC et la GC-MS a facilit lidentification des composs volatils, mme prsents ltat de traces. Wilkins et Larsen (1995) ont tudi la variation du profil en composs organiques volatils (COV) despces de moisissures provenant de btiments. Ils ont conclu que si le profil en terpnes est plus ou moins constant sous des conditions de croissance bien dfinies, il pourrait tre utile des fins taxonomiques. En effet, Sunesson et al. (1995) ont montr que la production de composs volatils dpendait de lespce de champignon tudie mais aussi du milieu de culture utilis.
Tableau 1. Liste des familles des mtabolites volatils microbiens Family of microbial volatile metabolites (adapted from Wilkins et al. , 2000). alcanes, alcnes, dines, trines hmi- (C5), mono- (C10), sesqui(C15,C11,C12), diterpnes (C20) alcools saturs, insaturs et branchs acides carboxyliques saturs, insaturs, branchs, diols, et esters ctols ctones, mthyl-2-ctone + alcools correspondants thyl(3-)ctones + alcools saturs/insaturs cycliques drivs soufrs thiols, mono-, di-, trisulfures, S-mthyl thioesters, thiothers composs aromatiques hydrocarbures, alcools, thers, ctones, phnols htrocycliques N (alkyl et alkoxypyrazines, indoles, pyrroles) O (alkylfuranes, gamma et deltalactones) hydrocarbures terpnes

Cest surtout dans le domaine alimentaire et en biotechnologie que ces composs ont t tudis pour pouvoir dtecter et identifier rapidement les champignons contaminant certaines denres alimentaires. Ainsi, Magan et Evans (2000) ont analys des mtabolites secondaires volatils avec un nez lectronique pour dtecter rapidement la dtrioration des stocks de grains. Cette technique permet de faire la distinction entre des espces mycotoxigniques et non-mycotoxigniques. Biosynthse des mtabolites volatils. Le prcurseur le plus important lors de la biosynthse des mtabolites volatils est lactate, prsent dans les cellules sous forme dactyl coenzyme A. Lactyl CoA provient du pyruvate gnr par la glycolyse (Figure 4). Lactyl CoA est le prcurseur principal des acides gras et du mvalonate, un intermdiaire important dans le mtabolisme secondaire des terpnes. Les acides gras sont mtaboliss en dautres mtabolites primaires. Les diffrents types de mtabolites volatils peuvent provenir de lactate (Figure 5), des acides gras (Figures 6 et 7) ou des acides amins (Figure 8). Facteurs influenant la production des mtabolites volatils. Divers facteurs tels que les paramtres environnementaux (activit deau, pH, composition atmosphrique, agitation et temprature) et la composition des substrats peuvent avoir une influence prpondrante sur la production des mtabolites volatils, tant qualitativement que quantitativement. En gnral, on admet que des conditions favorisant la croissance peuvent aussi favoriser la production des mtabolites volatils. Cependant, la composition en mtabolites secondaires volatils peut fortement varier en fonction de la source de carbone et dazote. Sunesson et al. (1995) ont tudi la production de mtabolites volatils par 5 espces fongiques sur deux milieux de culture diffrents (malt extract agar (MEA) et dichloran glycerol agar (DG18)), riches dun point de vue nutritionnel, mais de composition diffrente, surtout leur contenu en eau (le milieu DG18 contient du glycrol au lieu deau). Daprs leurs rsultats, ces auteurs ont conclu que la production des volatils dpendait non seulement de lespce de champignon mais aussi du milieu. En effet, une grande majorit des volatils tait produite par une seule espce fongique et sur un seul milieu. Utilisation des mtabolites volatils pour lidentification des champignons. Lidentification des champignons sur base des mtabolites secondaires volatils est remise en question dans de nombreux

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Glucose

M. Verscheure, G. Lognay, M. Marlier

Composs azots

thanol Pyruvate Acides amins Malonate Mthyl-ctones

Alcools Cycle TCA Oxalo-actate Actate (Actyl-CoA) Mvalonate Lactones Mthionine Granyl pyrophosphate Farnsyl pyrophosphate Sesquiterpnes Gosmine Trichothecnes Esters Polyketides Acides gras Thronine Aspartate

Alcools secondaires

Alcools Aldhydes

Composs soufrs

Monoterpnes 2mthyl-isobornol

Figure 4. Biosynthse des mtabolites volatils partir dactyl coenzyme A, prcurseur principal des acides gras et du mvalonate Biosynthesis of volatile metabolites from acetyl CoA, major precursor of fatty acids and mevalonate (adapted from Magans and Evans, 2000).

articles car un seul ou trs peu disolats ont t tudis et il est possible que certains aient t mal identifis. Cependant, des tudes ont rvl quil tait possible de diffrencier les espces dAspergillus et de Fusarium sur base de leur production en sesquiterpnes (Wilkins, Larsen, 1995 ; Sunesson et al., 1995 ; Frisvad et al., 1998) et il a t dmontr quun grand nombre despces de Penicillium pouvaient tre classes suivant les profils en mtabolites volatils (Brjesson et al., 1990 ; Larsen, Frisvad, 1995a ; Larsen, Frisvad, 1995b). Par exemple, Nilsson et al. (1996) ont utilis la technique de microextraction sur phase solide (SPME) pour collecter les composs volatils mis par des Penicillium. Ils ont montr que les profils en mtabolites volatils taient caractristiques dune espce (Figure 9). Larsen (1997) a identifi des terpnes volatils de champignons associs aux fromages par dtection dions slectionns (SIM). Les volatils ont t chantillonns par SPME partir de cultures en botes de Ptri aprs 43 heures de croissance. Cet auteur a constat que quelques espces produisaient le mme mtabolite. Par exemple, Penicillium commune, P. discolor et P. solitum produisent tous les trois le 2-

mthyl-isobornol. Toutefois, P. discolor produit le 2mthyl-isobornol et la gosmine, ce qui illustre le fait que cest une combinaison de mtabolites qui est spcifique une espce et non un mtabolite unique. Les mtabolites secondaires non volatils. Les mtabolites secondaires non volatils peuvent tre utiles la caractrisation despces et la dtermination des relations phylogntiques car ils peuvent servir de signaux chimiques entre les organismes ou les espces. Ils seraient donc complmentaires aux donnes morphologiques et molculaires, et on obtiendrait une description complte dune part importante du phnotype qui est peru par dautres organismes. Lapproche chimiotaxonomique consiste analyser chimiquement ou lucider les structures des mtabolites secondaires spcifiques disolats dans un taxon particulier, et comparer les rsultats obtenus avec dautres espces du mme genre. Utilisation des mtabolites secondaires non volatils en chimiotaxonomie. Les mtabolites secondaires non volatils ont t largement utiliss pour la taxonomie de quelques genres de champignons filamenteux.

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COOH Dimthylallyl-diphosphate Isopentnyl-diphosphate Monoterpnes O2

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Granyl-diphosphate 2-mthyl-isobornol OH O 10-HPOP

COOH

Farnsyl-diphosphate H O OH 1-octn-3-ol Nrolidyl-diphosphate Gosmine COOH

-himachalne -bisabolne

Figure 7. Lipoxygnation des acides gras : lacide linolique est oxyd en 10-hydroxyperoxyde, qui est cliv par une lyase en deux parties dont le 1-octn-3-o1 Lipoxygenation of fatty acids: linoleic acid is oxidized in 10-hydroxyperoxide which is cut by a lyase in two parts including 1-octen-3o1 (adapted from Frisvad et al., 1998).

-caryophyllne

NH2

COOH O

COOH O

H +CO2

Figure 5. Formation de mono- et sesquiterpnes partir disopentnyl diphosphate et de dimthylallyl diphosphate Biosynthesis of mono- and sesquiterpenes from isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate (adapted from Frisvad et al. , 1998).

leucine HOOC

LIPIDES

bta-oxydation
COOH COOH O -CO2

acide hexanoque

OH

OH

2-pentanol

2-pentanone

3-mthyl-1-butanol

Figure 6. -oxydation des acides gras saturs et formation de mthyl ctone et des alcools correspondants oxidization of satured fatty acids and formation of methyl ketone and corresponding alcohols (adapted from Frisvad et al., 1998).

Figure 8. Formation de 3-mthyl-1-butanol partir de leucine Formation of 3-methyl-1-butanol from leucine (adapted from Frisvad et al., 1998).

Lorsquun grand nombre disolats provenant de rgions et dhabitats diffrents ont t examins, la combinaison des donnes morphologiques et des mtabolites secondaires a permis de dlimiter les

espces. Dans le cas des genres Penicillium, Aspergillus et Fusarium (considrs comme tant trs difficiles identifier et classer), les mtabolites secondaires se sont rvls trs utiles.

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Penicillium vulpinum A P. coprophilum

M. Verscheure, G. Lognay, M. Marlier

CYA

Penicillium decumbens YES

Penicillium hirsutum var venetum

P. discolor CYA B Penicillium discolor

YES

Figure 9. Profils en mtabolites volatils obtenus par prlvement SPME et analyse GC-MS pour 4 espces de Penicillium aprs 4 jours de croissance en botes de Ptri Volatile metabolites obtained by SPME and analysis by GC-MS for 4 Penicillium species grown in Petri dishes after 4 days (adapted from Nilsson et al., 1996).

Par exemple, Smedsgaard et Frisvad (1997) ont tudi la production des mtabolites secondaires mis par des espces du genre Penicillium. Ces auteurs ont montr quen injectant des extraits fongiques bruts, cultivs sur milieu Czapek yeast autolysate (CYA) et Yeast extract sucrose agar (YES), directement dans une source electrospray dun spectromtre de masse (transformation dun chantillon liquide en gouttelettes par application dun champ lectrique et production dions), on obtenait un profil en masses caractristique de lespce (Figure 10). De plus, ces profils fournissent une information taxonomique complmentaire.

Figure 10. Analyse par ESMS des mtabolites secondaires produits par des espces du genre Penicillium. A : Penicillium coprophilum (319 uma dechlorogriseofulvin ; 353 et 355 uma griseofulvin ; 434 uma meleagrin ; 448 uma oxaline) sur CYA et sur YES. B : P. discolor (238 uma viridicatin ; 254 uma viridicatol ; 279 uma dehydrocyclopeptin ; 281 uma cyclopeptin ; 295 uma cyclopenin ; 311 uma cyclopenol ; 529 et 551 uma chaetoglobosin A-D ; 531 et 567 uma chaetoglobosin EF) sur CYA et sur YES Analysis by ESMS of secondary metabolites produced by species belonging to the genus Penicillium (adapted from Smedsgaard and Frisvad, 1997).

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139 Tableau 2. Analyse par HPLC-DAD des cinq mtabolites secondaires produits par les espces Fusarium chlamydosporum et Fusarium tricinctum Analysis by HPLC-DAD of five secondary metabolites produced by the species Fusarium chlamydosporum and Fusarium tricinctum. (DIOL : chlamydospordiol ; ICL : isochlamydosporol ; CL : chlamydosporol ; ACP : acuminotapyrone ; VIS : visoltucin) (adapted from Solfrizzo and Visconti, 1996). Souche Fusarium chlamydosporum 7-729 T-731 T-826 T-513 T-669 T-746 Fusarium tricinctum T-460 T-226 T-387 T-511 T-693 T-823 KF 260 T-545 T-904 Concentration (g/g) DIOL ICL CL ACP VIS

Daprs Smedsgaard et Frisvad, ces donnes chimiques en combinaison avec dautres caractristiques (morphologie, physiologie ou production de mtabolites volatils) pourraient prsenter une classification amliore des espces constitutives du genre Penicillium. Solfrizzo et Visconti (1996) ont utilis la chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP) avec un dtecteur barrettes de diode pour quantifier les cinq mtabolites secondaires (chlamydosporol, isochlamydosporol, chlamydosoporol, acuminotaryrone, visoltucin) caractristiques du genre Fusarium (Figure 11). Ils ont tudi la production de ces mtabolites par plusieurs souches de Fusarium tricinctum et de F. chlamydosporum (Tableau 2). Ils ont trouv que la visoltricine ntait produite que par F. tricinctum tandis que les quatre autres composs taient produits par les deux espces, mais en proportions diffrentes. ct des profils en mtabolites secondaires non volatils caractristiques dune espce, des auteurs ont pu mettre en vidence la prsence dun mtabolite spcifique une espce. Par exemple, Larsen et al. (1998) ont montr que lespce Penicillium verru cosum pouvait tre identifie sur base de la prsence

2200 260 1200 170 777 353

800 900 1800 ND ND ND

3200 400 1400 ND ND ND

1800 459 1460 441 230 36

ND* ND ND ND ND ND

74 40 225 130 110 70 50 ND ND

ND ND 200 650 ND ND 80 ND ND

ND 40 200 780 220 40 110 ND ND

37 6 13 3 10 6 20 ND ND

ND 40 29 271 1350 22 100 30 1165

* ND = non dtect ; < 3 g/g pour DIOL, ICL, CL, ACPet < 1 g/g pour VIS.
DIOL ICL

CL

ACP

VIS

Figure 11. Mtabolites secondaires produits par des espces appartenant au genre Fusarium Secondary metabolites produced by species belonging to the genus Fusarium (adapted from Solfrizzo and Visconti, 1996). DIOL : chlamydosporol ; ICL : isochlamydosporol ; CL : chalmydosoporol ; ACP : acuminotaryrone ; VIS : visoltucin.

exclusive de lacide arabnoque (Figure 12). En effet, cette molcule nest pas produite par les autres espces de Penicillium. Un deuxime exemple est celui de Larsen et al. (1999) qui ont analys par CLHP les mtabolites produits par lespce Penicillium scabrosum. Ils ont trouv que les profils en mtabolites taient trs semblables dun point de vue qualitatif (Figure 13). En effet, tous les isolats tudis produisaient les penigequinolones A et B (Figure 14) en tant que produits majoritaires, en plus des molcules de cyclopenine, cyclopenol et viridicatine dj rencontres chez plusieurs espces de Penicillium. Les auteurs ont observ que la combinaison de ces cinq mtabolites tait unique lespce Penicillium scabrosum et constitue donc un excellent indicateur chimique pour identifier cette espce. Le troisime exemple est ltude par Larsen et al. (2000) de la production de benzodiazpines (Figure 15) par 53 isolats de Penicillium. Ils ont trouv que tous les isolats contenaient une grande quantit de sclrotigenine dans leur myclium et que ce produit dont lactivit biologique a t dmontre auparavant pourrait jouer un rle de dfense chimique.

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Figure 12. Structure de lacide arabnoque, mtabolite secondaire lespce Penicillium verr ucosum Chemical structure of arabenoic acid, secondary metabolite specific to the species Penicillium verrucosum (adapted from Larsen et al., 1998).

penigequinolone A

pnigquinolone B

Figure 14. Structure chimique des pnigquinolones A et B, deux mtabolites secondaires non volatils produits par lespce Penicillium scabrosum Chemical structure of penigequinolones A and B, two non volatile secondary metabolites produced by species Penicillium scabrosum (adapted from Larsen et al., 1999).

Figure 13. Profil chromatographique (en haut) et profil en masses (en bas) des mtabolites secondaires produits par lespce Penicillium scabrosum en culture sur le milieu CYA Chromatographic profile (top) and mass profile (bottom) of secondary metabolites produced by species Penicillium scabrosum cultivated on CYA (adapted from Larsen et al., 1999).

sclrotigenine

auranthine

3. CONCLUSIONS La systmatique des champignons est principalement base sur lobservation des caractristiques morphologiques propres une espce donne. Lorsque les caractristiques morphologiques sont inefficaces pour identifier un champignon (isolats sensibles aux conditions environnementales ou peu diffrencis), on utilise les techniques physiologiques et biochimiques. Cependant, pour des champignons filamenteux peu diffrencis tels que Penicillium, Aspergillus ou Alternaria, ces mthodes sont laborieuses, longues et quelquefois insuffisantes. Les mthodes molculaires et les mthodes chimiques ont t dveloppes dans le but dobtenir un

Figure 15. Structure des deux benzodiazpines produites par certaines espces appartenant au genre Penicillium Chemical structure of two benzodiazepines produced by several species belonging to the Penicillium genus (adapted from Larsen et al., 2000).

complment dinformations sur la taxonomie dun isolat tudi. Ces mthodes se regroupent dans la chimiotaxonomie. lheure actuelle, les mthodes molculaires sont utilises en routine dans les laboratoires de mycologie car elles permettent dtablir un systme de classification bas sur ltude de marqueurs gntiques. ct des mthodes molculaires, les mthodes chimiques peuvent fournir des rsultats compl-

Revue bibliographique : la chimiotaxonomie des champignons

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mentaires la description morphologique et/ou la biologie molculaire. Les composs tudis en chimiotaxonomie sont les polysaccharides, les lipides insaponifiables, les acides gras, les mtabolites secondaires volatils et non volatils. Ltude des polysaccharides se rvle trs complexe car la dtermination de leur structure demande des analyses dtailles. Les lipides insaponifiables comprennent les ubiquinones, les strodes et les carotnodes. Les strodes sont les lipides insaponifiables les plus tudis car les champignons sont gnralement composs dergostrol. Cependant, ce dernier nest pas prsent dans tous les cas. Lanalyse des acides gras indique quil est possible de diffrencier des espces sur base de la concentration relative en acides gras mais pas sur base de la composition. Ltude des mtabolites secondaires volatils a t fortement critique car peu disolats ont t tudis mais il a t dmontr quil tait possible de diffrencier des espces appartenant aux genres Aspergillus, Fusarium et Penicillium sur base de la production en mtabolites secondaires volatils. De plus, ils pourraient tre utiles la dtection rapide de champignons indsirables qui sont soit des contaminants des btiments soit des contaminants de certaines denres alimentaires. Les mtabolites secondaires non volatils peuvent tre caractriss par des mthodes chimiques standardises et disponibles dans de nombreux laboratoires. Ils pourront aussi jouer un rle majeur lors de la rvision des genres des champignons parce quils procurent des donnes prcises et complmentaires aux observations morphologiques de la mycologie classique. On peut donc sattendre ce que les mtabolites secondaires non volatils fassent partie de la description de nouvelles espces. En conclusion, lors dtudes taxonomiques, les caractristiques morphologiques seront toujours tudies mais seront combines avec les tudes molculaires et chimiques pour identifier et classer correctement un champignon. Cependant, il est ncessaire de standardiser les mthodes chimiques et de raliser la caractrisation dun grand nombre disolats.

Remerciements Les auteurs tiennent remercier le Dr A. Wilmotte (Universit de Lige, Centre dingnierie des protines) ainsi que le Dr Ph. Jacques (FUSAGx, Unit de Bioindustries) pour leur aide prcieuse dans la rdaction de cette revue.

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