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Trabajo prctico N 3: Morfologa bacteriana y Tcnica de Gram.

Introduccin: La clasificacin de las bacterias depende principalmente de: 1. su tamao: Es de aproximadamente 0,5 m de dimetro, por lo que pueden ser apreciadas al microscopio ptico. 2. su forma: Mediante este tipo de microscopia pueden revelarse dos formas principales de bacterias: organismos ms o menos esfricos conocidos como cocos y otros cilndricos denominados bacilos. A su vez, ambos cuentan con una gran diversidad morfolgica por la que se distinguen cierto nmero de formas diferentes tanto de cocos como de bacilos. 3. sus propiedades de coloracin: Casi todos los procariotas estn rodeados por una envoltura celular rgida que rodea la membrana citoplasmtica que da a los diferentes tipos su morfologa. La tcnica de Gram es una tcnica de tincin diferencial que involucra principalmente un colorante primario, un decolorante y una coloracion de contraste y se utiliza ampliamente como base para la clasificacion de bacterias. Las que retienen el colorante primario incluso luego de la decoloracin son clasificadas como Grampositivas. Las que se decoloran y presentan la coloracin de contraste son denominadas, en cambio, Gramnegativas. La diferencia fundamental entre los resultados radica en la estructura de sus membranas celulares de estos dos tipos de bacterias, como se observar mas adelante en este Tp. Esta tcnica fue desarrollada en forma emprica por el bacterilogo dans Christian Gram en 1884 y se sigue utilizando hasta la actualidad.

Melina A. Varnavoglou Biologa II

Objetivos: Observar la morfologa de las distintas cepas bacterianas al microscopio ptico. Comparar clulas eucariontes y procariontes. Realizar la tcnica de tincin de Gram y analizar sus resultados. Identificar el tipo de pared bacteriana a partir de los resultados obtenidos. Determinar el tipo bacteriano de una muestra incgnita mediante la tincin y la morfologa que presente. Materiales: a) Instrumental de laboratorio: Microscopio ptico de campo claro. Portaobjetos. Hisopo. Mechero de Bunsen. Horno elctrico. Fsforos.

b) Sustancias o reactivos proporcionados: Kit de tincin de Gram. Aceite de inmersin. Agua destilada.

Procedimiento: 1. Tratamiento de las muestras: Se trabaj con diferentes muestras: tres suministradas por el docente cuya procedencia era la siguiente: 1) E. Coli. 2) Prebitico comercial: Actimel, 3) Muestra incgnita. y un cuarto preparado para el que se realiz un hisopado/frotis de la cavidad bucal cuyo procedimiento se describe a continuacin: Con un hisopo limpio, se rasp la cavidad bucal hasta obtener una cantidad adecuada de saliva. Se la extendi sobre el portaobjetos con el mismo hisopo y luego se procedi a secar la preparacin colocando el portaobjetos con la muestra en posicin horizontal sobre la llama tenue (lo cual se logra moderndola hasta que esta sea de color azul) de un mechero de Bunsen. Este procedimiento tambin puede realizarse en estufa.

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Luego se fij la muestra, pasando 3 veces el portaobjeto s del lado que no contiene a la muestra sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de aproximadamente 80C. Las muestras 1), 2) y 3) ya se encontraban extendidas sobre el portaobjetos, fijadas y secadas previamente por lo cual no fue necesario realizar el mismo tratamiento que se le aplic al frotis de la cavidad bucal. 2. Coloracin: Una vez tratadas las muestras, se procede a colorearlas mediante la tincin de Gram que se realiz siguiendo los pasos del protocolo de la tcnica de Gram para el Kit utilizado. Se describe, a continuacin, este procedimiento (que fue exactamente el mismo para las cuatro muestras antes mencionadas): Se tom el portaobjetos y se cubrieron con el colorante primario Cristal Violeta para Gram las zonas del portaobjetos que tenan la preparacin y se lo dej actuar durante 20 segundos. Inmediatamente despus se elimin el Cristal Violeta no absorbido lavando la muestra con un chorro fino de agua durante diez segundos. Luego la muestra fue cubierta con una solucin de Lugol con el fin de mordentar el colorante. Se lo dej accionar diez segundos. A continuacin, se decolor la muestra durante otros diez segundos con una solucin de alcohol-cetona, haciendo presin en el frasco plstico para que saliera un chorro fino que arrastre el colorante en todas las zonas donde fue aplicado. Se procedi a lavarlo nuevamente con un chorro fino de agua durante diez segundos y finalmente se le aadi a la muestra el colorante de contraste Safranina, dejndola actuar durante diez segundos. Por ltimo, se coloc la muestra en el horno elctrico para laboratorio y se la dej aproximadamente 5 minutos all para que se secara. 3. Observacin al microscopio: Los portaobjetos con las diferentes muestras fueron observadas una por una con el microscopio optico de campo claro, y se procedi a examinarlas, aadiendole en algunos casos un aceite de inmersin para poder distinguir con mayor claridad la coloracin y morfologa de las bacterias. Finalmente se realizaron dibujos de las caractersticas principales y coloracin de las estructuras observadas. Resultados: Se adjuntan a continuacin los dibujos obtenidos de la observacin, con sus caractersticas principales identificadas y clasificadas segn su morfologa y coloracin. Para esto ltimo se tuvo en cuenta la siguiente informacin: Tipo de bacteria Gram Gram + Color Negro azulado/ violeta oscuro. Rojizo/ rosado.

Melina A. Varnavoglou Biologa II

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Conclusiones: En la tcnica de Gram no es relevante saber con qu estructuras interacciona el colorante (como si ocurra, por ejemplo, con la tincin de Hematoxilina y Eosina) sino cmo responde cada envoltura nuclear a la coloracin. sta estructura es la que da a los diferentes tipos bacterianos su morfologa, por lo que, sabiendo cmo es la envoltura nuclear de la bacteria observada puede diferenciarse tambin su morfologa. Shalton demostr que la diferencia entre stas radica fundamentalmente en la estructura de sus envolturas nucleares: la de las G + esta formada por una capa homognea y compacta de peptidoglicanos junto con cidos teicoicos y polisacridos que mide entre 10 y 80 nm y se deshidrata cuando el colorante es aplicado retiendo asi al colorante primario, en otras palabras, este tipo de envoltura constituye una barrera de permeabilidad frente a la elusion del complejo colorante primario. En cambio, la envoltura de las G- consta de dos membranas: una interna de peptidoglicanos de solo 2 a 3 nm de espesor y una capa exterior de lipoprotenas y lipopolisacridos dispuestas en forma de una bicapa fosfolpidica de unos 8 nm espesor adems del espacio periplsmico que presenta enzimas y la presencia de transportadores denominados porinas. La delgadez y la mayor permeabilidad de la capa de peptidoglicano junto con el alto contenido de lpidos presentes en el sistema de membranas favorecen a que el decolorante diluya parcialmente permitiendo que el complejo colorante primario sea removido. La tincion de gram se presenta asi como una tcnica sumamente eficaz en reflejar la arquitectura de la envoltura nuclear de las bacterias y por tanto tambin la morfologa de estas. Observaciones: El punto crtico de la tincin de Gram es, aparentemente, la decoloracin por lo que si se producen errores en la tincin presumiblemente se debe a no haber decolorado bien la muestra por una medicion incorrecta del tiempo ya que es solo cuestin de segundos para que tanto las gram + como las gram se decoloren.