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Animales Transgnicos

Introduccin
Clonacin nuclear: Produccin de animales
transgnicos idnticos al transplantar el ncleo de
clulas somticas a vulos sin ncleo (Enucleadas)
Animal transgnico: Composicin gentica ha sido
alterada al aadir DNA extranjero
Transgen: El DNA extranjero introducido
Tecnologa transgnica: perfeccionada en ratones
Regulacin de genes
Gentica molecular
Desarrollo de tumores
Especificidad inmunolgica
Expresin de biofrmacos
Modelos de enfermedades
Antes de la clonacin:
Muchas generaciones de cruces selectivos
Consuma mucho tiempo
Es costoso
Difcil introducir otra caracterstica nueva
Comenzar todo el proceso otra vez
Transgnesis
Vectores retrovirales: Infectan clulas
embrinicas en edad temprana antes de ser
implantado en la madre
Microinyeccin: en el ncleo agrandado del
espermatozoide (proncleo del macho) en un
vulo fertilizado
Liposomas (lpidos cationicos): Clulas
embrinicas madre son tratadas
genticamente despus son implantadas en
un embrin
Estrategia para Clonar Genes
Inyectar un gen clonado en el ncleo de un
huevo fertilizado
vulos fertilizados se implantan en hembra
receptiva
Alguna de la progenie tendr transgen en todas
sus celular
Animales con transgen en clulas reproductivas
(germinales) son cruzados
Nuevas lneas transgnicas
Vectores Retrovirales
Mtodo muy efectivo
Solo transfiere pedazos pequeos de DNA
(~8kb)
No se pueden utilizar secuencias largas de
regulacin
No se usan para animales transgnicos de uso
comercial
Vector es defectuoso en replicacin
Es necesario no tener contaminacin retroviral
Vectores Retrovirales
Embriones removidos de la
madre
Embriones en la etapa de
multiplicacin
8 clulas
Embrin es infectado con
retrovruses con el transgn
Embrin es implantado en
madre receptora
Cruces son llevados a cabo
Transgn en clulas
germinales
Mtodo de Microinyeccin
Superovulacin
Pregnant mares serum
Human Chorionic
Gonadotropin (48 hrs despus)
35 vulos (5-10 vulos
normalmente)
Hembra superovulando es
fertilizada por macho y
sacrificada
Los vulos fecundados se
obtienen de los oviductos
Inmediatamente
microinyeccin (vector lineal
sin secuencias procariticas)
Mtodo de preferencia
Ncleo macho (proncleo) y el
ncleo femenino separados
Ncleo femenino completa
divisin meiotica y se forma el
proncleo femenino
Ocurre Karyogamy: fusin de
los ncleos
Proncleo masculino es mas
grande
Microscopio de diseccin
Se mantiene en posicin con
micromanipulacin
Se inyecta el DNA (varios
cientos por da)
25-40 vulos son implantados
por microciruga
3 semanas despus se obtiene la progenie
Animales transgnicos analizados por PCR o
Southern Blot
Animales transgnicos se cruza con otro para
establecer si est en la clula reproductiva
(germinal)
Producir homocigotos
5% vulos implantados producen animales
transgnicos
25% son transgnicos
De 1000 vulos solo 30-50 transgnicos
Otros: lugar de integracin al azar pueden tener
defectos o baja expresin
Ingeniera Gentica de Clulas Madre
Clulas del blastocito se
pueden cultivar In Vitro
Retiene totipotencia
(pluripotencia)
El transgen es integrado en
un lugar especifico, se
selecciona, se crecen y
usan para producir el animal
transgnico
Clulas transgnicas son
introducidas a otro
blastocito
Se puede evitar la insercin
del transgen al azar
Para seleccionar y enriquecer
las clulas transgenicas con
integracin especifica
Seleccin Positiva-Negativa
Positiva: selecciona integracin
en cualquier lugar del genoma
Negativa: selecciona
integracin especifica
Lugar de integracin debe
estar en:
Regin que no codifique
Lugar activamente transcrito
Clulas madre transgnicas
se introducen al blastocito
Embriones se implantan en una
madre pseudo-preada
Se establecen las lneas
transgnicas
Se cruza la progenie para
producir ratones homocigotos
Vector de Seleccin
Dos lugares de
recombinacin homologa
Recombinacin homologa
doble
HB1 y HB2
Gen extranjero de nueva
funcin
Gen de seleccin:
Resistencia a G-418 (NeoR)
Dos genes de thymidine
kinase (TK1 y TK2)
Clulas se cultivan
primero en G-418
(positiva) y despus en
Ganciclovir (negativa)
El mtodo enriquece la poblacin de celular madres
embrinicas que contienen el transgen en el lugar
especificado.
Se usa el PCR para ver si hay integracin especifica
Un primer en la secuencia del cromosoma y otro en el
vector
Un gen especfico puede
ser blanco de
destruccin
Se incorpora una
secuencia de DNA,
usualmente un gen
reportero
Gene Knockout
Sistemas modelos
Transferencia de Ncleo
El ncleo de la clula
mamaria
Primer caso de pluripotencia
(totipotencia) del ncleo fue
Dolly
Clonados: ganados, cabras,
perros
Clula embrinica, fetal o
adulto es separada y
crecida en cultivo
Manipulacin gentica
Transgenic cell line
Clula donante transgnica se
fusiona al oocito sin ncleo
Se usan pulsos elctricos
2.5 Kv/cm for 10uSec cada uno
Induce la fusin y activacin del
oocito
Cada clula fusionada se cultiva
a la etapa blastocisto
Es transferida al tero de una
hembra pseudo-preada
Anlisis del genotipo al nacer
Usualmente:
Muchos mueren pero los que
nacen son saludables
Ventajas:
Cambios genticos permanentes
Integracin en lugar especfico
Todo hijo es transgnico
No hay silenciamiento del gen
Fcil de obtener mltiples clones con las
mismas caractersticas
Modificacin Gentica Mediante el Sistema
Cre-loxP de Recombinacin
Ratones transgnicos
Modificacin gentica en todas las
clulas
Proceso para la regulacin de un
gen en un tejido o tipo de clula
Cre-loxP: Sistema de recombinacin
del bacterifago P1
P1:
Entra en E. coli, forma plsmido
P1 circular es templete de replicacin
Dependiendo de los genes
expresados:
Se mantiene como plsmido
Forma viruses
En raras ocasiones se integra al
genoma de E. coli
Gen Cre: Integracin
Cre: Circularization recombination
protein o Cre recombinasa
Cre: corta y recombina
especficamente loxP sites
loxP: locus of crossing over [x] in
P1
loxP:
2 repeticiones invertidas (IR)
`13bp cada una separada por 8bp
Repeticiones directas (DR)
2 loxP distantes, se aproximan
C/u loxP tienen recombinasa pegada
Cre corta en el spacer
Lleva a cabo el intercambio
Une las hebras de DNA
Resultado de la recombinacin
depende de orientacin de loxP
IR: invierte el DNA entre los 2 loxP sites
DR: Remueve secuencia entre loxP sites
En P1 son IR
Cre-loxP solo funciona si loxP bien alejados
Usado en clonacin para producir
modificaciones especificas en un tipo de clula
Cre-loxP es absoluto
Cre gen bajo control de un
promotor especifico
Se crea lnea transgnica y se
confirma expresin en tejido
Se produce el constructque
tiene DR loxP a cada lado
floxed
Tiene marcador
Se integra en clula
embrionica madre
Recombinacin homologa
Clulas se seleccionan,
cultivan y se usan para
producir animales trangnicos
Cruzar animal transgnico
Cre con animal transgnico
loxP
Aplicaciones
Monitoreo del
efecto de la
perdida de
actividad de un
gen en un tejido o
clula especfica
Aplicaciones
Activacin de un transgen en
tejido o clula especfica
Secuencia que previene
transcripcin
Remover un gen que puede
ser txico para una clula o
tejido
Para crear modelos de
enfermedades
Inactivacin de genes en tejido
especfico
Inactivar kinesin-II en ratones en
fotorreceptores de la retina
Similar a retinitis pigmentosa
Ganado Transgnico: vacas, cabras, ovejas,
cerdos
Clulas mamarias como biorreactor
10,000 L/V/Y = 35g protena total/L
1g protena transgnica/L X 50% eficiencia de purificacin X 20
vacas = 100kg/Y
Necesidad de protena C = 100 kg/Y
Previene cogulos sanguneos
Factor IX = 5g/Y
Facilita coagulacin en hemoflicos
Sistema de Microinyeccin para
Ganado
Obtener oocitos de la vaca
Maduracin del oocito In Vitro
Fertilizacin con semen del toro
Centrifugacin para precipitar yema
Microinyeccin del DNA en proncleo
Maduracin del embrin In Vitro
Implantacin no quirrgica
Anlisis del DNA de la progenie
Baja eficiencia de integracin del transgen
y recuperacin de animales transgnicos
Clulas del embrin pueden ser removidas
y analizadas por PCR para confirmar
integracin
Metas
Cambiar la composicin de la
leche
Transgen K-casein = mas
queso
Transgen lactasa = menos
lactosa
Antgenos virales y
anticuerpos para vacunacin
oral y pasiva
2 aos producir una vaca
transgnica
20% del costo de crianza de un
animal es prevencin de
enfermedades
Mastitis, disentera, clera
Metas
Animales transgnicos
Protegidos de enfermedades
Produccin anticuerpos
monoclonales
Proteccin interna no necesitan
vacunacin
Inmunizacin In Vivo
Transgen para produccin de
anticuerpos
Anticuerpos monoclonales en
ratones, conejos y cerdos
Desarrollo de la glndula
mamaria como bioreactor
Animales transgnicos
Mas de 100 protenas
humanas
Modificaciones post-
traduccionales
Mayormente no hay efecto
adverso en el animal
Hormona de crecimiento
bovino
Dao a rganos internos del
cerdo
Hemoglobina humana en
cerdos era funcional
Produccin de rganos
Alotransplantation: humano a
humano
Xenotransplantation: animal a
humano
Mucho potencial en el cerdo
rganos animales son rechazados por el
cuerpo
Anticuerpos humanos reconocen epitopesen
la superficie de la clula
Carbohidratos (-Gal)
Protenas
Respuesta inflamatoria
Protenas en la membrana que previenen la
respuesta inflamatoria
Aves Transgnicas
Microinyeccin muy ineficiente
Mltiples espermatozoides penetran el
ovulo
Imposible identificar el pronucleo que
se va a fusionar
DNA inyectado en el citoplasma no se
integra en el genoma
Despus de ser fertilizado se forma la
envoltura de albmina
Mtodo predilecto es el uso de
clulas pluripotentes
Clulas del blastodermo o embrionicas
se remueven del pollito
Se integra el transgen por transfeccin
Se implantan en el espacio
subgerminal de un embrin receptor
quimeras: animales con clulas
provenientes de dos o mas individuos
Algunas clulas forman las clulas
reproductivas
Lneas de animales transgnicos pueden
ser establecidas al cruzar mltiples veces
estas aves transgenicas
Lneas mejoradas
Se puede tratar el embrin con radiacin
para matar clulas endgenas y aumentar
la proporcin de clulas transgnicas vs
normales
Bajo colesterol, resistencia a
enfermedades, mejor carne, biorreactores