AMINOCIDOS: SOLUBILIDAD, CURVA DE TITUACIN Y SEPARARACIN POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Jessica A. Monsalve, Sayda M. Surez Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales. Universidad de los Llanos, Villavicencio-Colombia

RESUMEN La cromatografa de capa fina, consiste en la separacin de una mezcla por medio de la diferencia de las solubilidades entre dos sistemas disolventes, a partir de esto se realiz la separacin de los aminocidos: tirosina, glicina, triptfano y una muestra problema, que se revelaron e identificaron mediante la reaccin con la Ninhidrina. La representacin grfica de la variacin del pH de una solucin debida al agregando de una base o un acido se denomina curva de titulacin. La curva de titulacin surge entonces de la relacin entre la cantidad de acido o base agregada a una solucin y la variacin del pH de la misma. Se llev a cabo la titulacin de Metionina y Glicina, con el cido HCl y la base NaOH, para determinar el punto isoelctrico de cada uno. Palabras Claves: solubilidad, separacin por cromatografa de capa fina, curvas de titulacin, ndice hidroptico, factor de retencin, punto isoelctrico, pK.

INTRODUCCIN Las protenas son bsicamente veinte aminocidos diferentes, los cuales contienen un grupo carboxilo (-COOH, acido dbil) y un grupo amino (-+NH3, base dbil) unidos al mismo tomo de carbono. Estos aminocidos difieren unos de otros nicamente por la naturaleza de sus grupos R, que varan en estructura, tamao, carga elctrica y reactividad qumica1. Todos los aminocidos presentan al menos un grupo cido y un grupo bsico que se ionizan cuando estn en solucin, por lo que los aminocidos pueden tener propiedades de acido y de base, es decir, son anfotricos2. Cada grupo tiene un pK, el cual corresponde al pH en el que se encuentra la misma cantidad de la forma no ionizada que de la ionizada.
1 2

Los aminocidos tienen al menos dos pK, por lo que tienen mayor capacidad amortiguadora, ya que presentan de tres a cuatro formas inicas diferentes. Cuando la forma inica tiene una carga neta de cero (zwitterion), se dice que se encuentra en su punto isoelctrico o pi. Al variar el pH, cambia la proporcin de las formas inicas y es posible ver la capacidad amortiguadora de los aminocidos. Cada aminocido tiene sus propios pK, puesto que presenta diferentes sustituyentes en sus cadenas laterales. En la prctica de laboratorio se hizo la titulacin, de la glicina y metionina, con HCl, hasta lograr un pH de 1.5 y NaOH, llegando a un pH de 12.5, para luego determinar los valores de pK y el punto isoelctrico de cada uno.

Gonzales et al, 2009; Moore & Langley, 2008 VOET & VOET. Fundamentos de bioqumica, 2004

Se realizo la separacin de mezclas por medio de cromatografa de capa fina, en la cmara cromatografica ocurre la separacin de las mezclas debido al disolvente, el arrastre de mezclas se llevo a cabo por la fase mvil y la estacionaria. RESULTADOS Y DISCUSIN CURVA DE TITULACIN METIONINA

aminocido acta como aceptador de protones.

HCl 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 pH 5.75 3.83 3.53 3.31 3.17 3.06 2.97 2.88 2.81 2.75 2.68 2.62 2.57 2.53 2.48 2.44 2.40 2.36 2.32 2.28 2.25 2.22 2.19 2.15 2.12 2.09 2.07 2.05 2.02 2.00 1.97 1.96 1.93 1.90 1.88 1.86 1.84 1.83 1.80 1.78 1.76 1.75 1.73 1.71 1.70 1.68 NaOH 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 44 46 48 pH 7.32 7.45 7.02 7.75 7.82 7.93 8.12 8.20 8.30 8.38 8.45 8.53 8.59 8.66 8.73 8.78 8.84 8.88 8.93 8.98 9.05 9.10 9.14 9.18 9.24 9.30 9.36 9.41 9.46 9.53 9.59 9.64 9.71 9.78 9.87 9.92 10.05 10.17 10.32 10.49 10.72 10.95 11.15 11.41 11.58 11.71

Figura 1: Estructura del Aminocido Metionina.

Estructuralmente el Aminocido Metionina contiene un grupo carboxilo, un grupo amino, un tomo de Hidrogeno y una cadena lateral tioeter, es decir, un puente de azufre entre una cadena carbonada; al contener los grupos carboxilo y amino se puede comportar como acido o base dependiendo de la sustancia con la que reaccione denominndoseles anfteras, cada uno de estos grupos son ionizables presentan una fuerza en la cual la molcula es capaz de disociarse denominada pK, en la que estos grupos puede ganar o perder protones quedando cargados positiva o negativamente, el promedio de los pK se obtiene el punto isoelctrico donde la carga neta es cero. En la titulacin del aminocido con cido clorhdrico 0,1M, el aminocido acta como donador de protones, acidificndose a medida que se aumenta el volumen del titulante; al titular con Hidrxido de Sodio (NaOH), el

46 47 48 49 50 51 52 54 56 58

1.66 1.65 1.64 1.62 1.60 1.59 1.58 1.55 1.53 1.50

50 52 54 56 58 60 65 70 72 74 76

11.79 11.92 11.97 12.03 12.08 12.15 12.23 12.30 12.46 12.47 12.48

En el eje de abscisas se representa la cantidad de agente titulante y en el eje de ordenadas, el pH obtenido. Se determinaron dos pK para el aminocido, tal como lo muestra la grafica 1. Puede notarse, que no se encontraron los pK exactos del aminocido, pero se establece un rango para estos y el punto isoelctrico.

Tabla 1: Titulacin con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminocido Metionina.

Curva de Titulacin de Metionina

14 12 10 8 pH 6

pK1: 2,3

pK1: 2,3

4 2 0

pI: 5,74

-100

-50

0 mL de Titulante HCl/NaOH

50

100

Grafica 1: Curva de titulacin Aminocido Metionina.

Datos Tericos Datos Prcticos Alfa-COOH: 2.28 Alfa-NH3+: 9.21 Punto Isoelctrico: 5.743 pKa: Metionina pK1= 2,3 pK2= 9,6

Formula:

http://es.wikipedia.org/wiki/Metionina

GLICINA CURVA DE TITULACIN

Curva de Titulacin de la GLICINA
14.0 12.0 10.0

pH

8.0 6.0 4.0 2.0 -

-150

-100

-50

50

100

150

mL de Titulante HCl/NaOH Grafica 2: Curva de titulacin Aminocido Glicina.

El aminocido glicina es un cido diprtico, que se caracteriza por tener dos constantes de ionizacin y por consiguiente dos pKs: El primero (pK1) corresponde a la disociacin del grupo carboxilo (COOH). El segundo (pK2) corresponde a la disociacin del grupo amino (NH3+). Entre estos dos pK se sita el punto de equivalencia de las dos disociaciones inicas: se conoce como punto isoelctrico, para el cual las cargas (+) y (-) se encuentran en equilibrio.4

pKa Glicina Alfa-COOH: 2.34 Alfa-NH3+: 9.60 Punto Isoelctrico: 5.74 Formula:

Datos Prcticos pKa: Glicina. pK1= 1,63 pK2= 10,2

Datos Tericos
4

http://www.um.es/bbmbi/Areas/Quimica/Practica s/Practica01/Practica01.htm

HCl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

pH 6.45 4.14 3.80 3.60 3.47 3.35 3.27 3.18 3.10 3.05 2.99 2.94 2.88 2.84 2.80 2.76 2.72 2.69 2.65 2.62 2.58 2.55 2.51 2.49 2.45 2.42 2.40 2.38 2.35 2.32 2.30 2.27 2.24 2.22 2.20 2.17 2.15 2.13 2.11 2.08 2.07 2.04 2.03 2.01 1.99 1.96 1.94 1.92 1.91

NaOH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

pH 6.67 7.88 8.2 8.34 8.52 8.59 8.76 8.86 8.87 8.93 8.96 9.02 9.08 9.12 9.17 9.22 9.24 9.3 9.34 9.39 9.42 9.46 9.48 9.51 9.55 9.55 9.65 9.71 9.76 9.8 9.81 9.88 9.96 10.01 10.06 10.14 10.2 10.22 10.34 10.5 10.52 10.54 10.76 10.83 10.84 10.87 10.98 11.04 11.13

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106 108 111

1.90 1.89 1.88 1.87 1.85 1.84 1.83 1.82 1.81 1.79 1.78 1.77 1.76 1.75 1.74 1.73 1.72 1.72 1.71 1.70 1.69 1.692 1.679 1.660 1.651 1.638 1.625 1.615 1.603 1.594 1.587 1.575 1.568 1.558 1.552 1.544 1.535 1.528 1.522 1.515 1.509 1.500

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99

11.15 11.2 11.23 11.31 1133 11.35 11.38 11.4 11.41 11.43 11.45 11.46 11.47 11.48 11.5 11.51 11.52 11.53 11.54 11.55 11.56 11.57 11.58 11.59 11.6 11.607 11.612 11.619 11.62 11.63 11.634 11.64 11.647 11.65 11.656 11.66 11.667 11.67 11.674 11.68 11.684 11.687 11.69 11.693 11.7 11.702 11.705 11.706 11.71 11.711 11.712

100 105 110 115 120 125

11.714 11.729 11.73 11.74 11,75 11.755

Tabla 2: Titulacin con HCl 0,1 M y NaOH

0,1 M, en muestra de Aminocido Glicina.

En el caso de la Metionina se obtuvieron pK1 y pK2, de acuerdo a su orden de disociacin, primero est el carboxilo (2,3) y luego el grupo amino (9,6). El punto medio entre los dos pK1 y pK2 es el punto de inflexin de la curva de titulacin, o sea el punto isoelctrico que en este caso vendra siendo 5,74

Figura 2: separacin de cromatografa en capa fina.

mezclas

por

Lo mismo sucede con la glicina, primero se disocia el grupo carboxilo (1,63) y luego el amino (10,2), el punto isoelctrico es de . CROMATOGRAFA DE CAPA FINA EN AMINOCIDOS. FACTOR DE RETENCIN: La relacin entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa se conoce como Rf a= Distancia desde el punto de siembra hasta el frente de elucin del solvente. b= Distancia desde el punto de siembra hasta donde aparece la mancha de color despus del desarrollo de la cromatografa.

MUESTRA PROBLEMA: esta sustancia contena dos compuestos donde el proceso de cromatografa permiti la separacin de las dos mezclas. = 0,178 = 0,63 TRIPTOFANO = 0,637 TIROCINA = 0,534

GLICINA = 0,178 La cromatografa de capa fina es un procedimiento que se utilizo para separar molculas relativamente pequeas. La separacin de mezclas de las molculas es mediante la cromatografa de capa fina que consiste en reparto entre dos fases. Consiste de una fase estacionaria y una fase mvil, los disolventes ms polares eluyen rpidamente a los solutos que tengan mayor tendencia a

quedar retenidos. Cuanto ms polar sea el disolvente, menor es su poder de elusin, porque disuelve menos a los solutos no polares; sabiendo que los aminocidos son polares y apolares, donde la parte polar tiende a ser atrada por el agua debido a que es hidroflica; y la parte apolar tiende a esconderse debido a que es hidrofobica; las Molculas ms polares quedan ms retenidas en la fase estacionaria, es decir "corren menos", mientras que las molculas menos polares se ven menos retenidas y avanzan a mayor velocidad arrastradas por eluyente. En este proceso se determino el factor de retencin, se tomo las mediciones del eluyente y como las sustancias eran incoloras se les roci un poco del reactivo de ninhidrina para observar el recorrido de la separacin, se obtuvo para la glicina 0,178 y 0,63, tirosina 0,534, muestra problema 0,178, triptfano 0,637. Donde, las molculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce la elucin van siendo desplazadas por la fase mvil. El factor de retencin para la muestra problema fueron dos RF, donde segn los valores, se relacionan para determinar que el analito contiene dos sustancias que son glicina y triptfano se afirma que la cromatografa sirve para la separacin de dos mezclas. CONCLUSIONES A travs de la prctica, se comprobaron las caractersticas anfteras del aminocido, ya que al titular con acido se encontr una aproximacin del Pk1 del carboxilo as mismo al titular con hidrxido el Pk2 aproximado del amino apareci, as al encontrar los 2 pK se demuestra las

propiedades aminocidos.

dipolares

de

los

Se separo una mezcla de aminocidos por cromatografa en capa fina. Se identific los compuestos desconocidos en una mezcla por comparacin del cromatograma de la mezcla con el del compuesto conocido. BIBLIOGRAFA LEHNINGER Principios De Bioquimica David L. Nelson Michael, Editorial Omega, Espaa. ARTICULOS DE AMINOACIDOS {En lnea} {15 de Octubre de 2012} Disponible en:http://acemucsc.galeon.com/articulo s/Bioquimica/aminoacidos.htm David L. Nelson, Michael N. Cox, Lehninger PRINCIPIOS DE BIOUIMICA. 4 edicin. Aum, Stuart. INTRODUCCIN A LA QUMICA ORGNICA Y BIOLGICA. 1 ed. Compaa Editorial Continental, S.A. de C.V. Mxico (1981) Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura y funcin de las protenas. En: Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa). Cromatografa en capa fina {En lnea} Disponible/www.uprm.edu/biology/prof s/velez/cromatografias.htm(9/oct/2006) Separacin de mezclas {En lnea} disponible en: /http://www.fq.uh.cu/dpto/qi/Aimee/sint esis_inor_web/conf_3.htm(28/ago/200 6)

Dickson T.R. Introduccion a la qumica, Edit Publicaciones cultural 16 ed Mxico 1999 pp. 259 Allier Rosala etal LA MAGIA DE LA QUMICA editorial EPSA, Mxico DF 1995 1 edicin pp123 - 12

FIGURAS: Figura 1: Estructura del Aminocido Metionina. Figura 2: separacin de mezclas por cromatografa en capa fina.

TABLAS: Tabla 1: Titulacin con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminocido Metionina. Tabla 2: Titulacin con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminocido Glicina GRAFICAS: Grafica 1: Curva de Aminocido Metionina. Grafica 2: Curva Aminocido Glicina. de titulacin

titulacin